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柽柳bZIP 基因调控耐盐相关基因的表达



全 文 :植物生理学通讯 第46卷 第12期, 2010年12月 1237
收稿 2010-09-17 修定  2010-11-03
资助 国家自然科学基金(30972387)。
* 通讯作者(E-mail: wangyucheng1029@126.com; Tel:
0451-82191627)。
柽柳bZIP基因调控耐盐相关基因的表达
吴英杰, 王超, 及晓宇, 王留强, 王玉成*
东北林业大学林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室, 哈尔滨150040
提要: 本研究探讨了柽柳(Tamarix hispida) bZIP (basic leucine zipper)基因对抗逆基因表达的调控。我们比较了非盐胁迫和
盐胁迫条件下非转基因和转 bZIP 基因植株的 SOD、POD、ATPase、GST、LTP 和 LEA 等基因表达量的变化。结果表明,
在非胁迫条件下, bZIP 转录因子可能直接调控了 poxN1、TOBPXD、TOBLTP 和 ltp1 基因的表达, 而其他基因的表达可能
不受 bZIP 转录因子的直接调控。在盐胁迫下, bZIP 转录因子能够直接或间接地调控部分抗逆基因的表达, 使它们的表达
量显著增强。
关键词: bZIP 基因; 烟草; 盐胁迫; 实时定量 RT-PCR; 基因表达
Expression of Salt-Tolerant Genes Regulated by a bZIP Gene in Tamarix hispida
Willd
WU Ying-Jie, WANG Chao, JI Xiao-Yu, WANG Liu-Qiang, WANG Yu-Cheng*
Key laboratory of Forest Tree Genetic Improvement and Biotechnology, Northeast Forestry University, Ministry of Education,
Harbin 150040, China
Abstract: The genes whose expression regulated by a basic leucine zipper (bZIP) gene from Tamarix hispida
were investigated in the present study. Expression of stress-tolerant genes including SOD, POD, ATPase, GST,
LTP and LEA were compared between bZIP transformed and non-transgenic plants under normal growth and
salt stress condition. The results showed that under normal condition, poxN1, TOBPXD, TOBLTP and ltp1
genes may be directly regulated by bZIP, while the others may be not regulated by bZIP directly. Under salt
stress bZIP regulated the expression of some stress resistance genes and enhance their expression level.
Key words: bZIP; tobacco; salt stress; real-time PCR; gene expression
在自然条件下, 植物经常会遭受干旱、盐碱
和低温等逆境胁迫, 使其生长发育受到抑制甚至导
致植株死亡。因此, 干旱、盐碱胁迫是限制农林
业生产的主要因素之一(曾华宗和罗利军 2003)。
由于植物的抗胁迫性大多数属于数量性状, 涉及多
种基因的相互作用, 转入单一的抗性基因的作用有
限。而抗逆相关的转录因子基因可以调控一系列
抗性基因的表达, 一个基因的转入, 可以起到对多
个抗逆基因的调控作用, 显著增强植物的抗逆性(张
道远等2003; 杨传平等2004)。因此, 应用转录因
子基因进行植物抗逆基因工程育种具有重要潜力。
bZIP (basic leucine zipper)蛋白是真核生物的
转录因子和阻抑蛋白中最大而且最保守的类型之
一。它是由一个二聚体化作用的亮氨酸拉链区域
和一个 DNA 结合的碱性结构域组成。研究表明,
bZIP 基因可以被多种逆境胁迫所诱导, 如干旱、
盐碱等胁迫均可以诱导bZIP基因的上调表达(Kim
等 2001)。bZIP 基因表达是叶绿体内光合损伤的
适应性反应, 对保护和修复光合元件(photosynthetic
apparatus)起关键作用(Wellmer等2001)。逆境胁
迫下, 植物体内会产生一系列的解毒剂, 以阻止游
离氧的进一步损害, 使细胞免受毒害。研究发现,
bZIP基因是阻止游离氧的进一步损害的关键基因,
对植物的抗逆胁迫起重要作用(Yanagisawa和Sheen
1998)。Strathmann等(2001)在玉米中分离了bZIP
蛋白基因mlip15, 该基因的表达受低温的正向调控,
盐胁迫和外源ABA可诱导其强烈表达。将bZIP蛋
白基因 ABF3 和 ABF4 分别在拟南芥中的组成型表
达, 导致转基因植株对ABA超敏感, 同时增强耐旱
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性(Kang等2002)。通过酵母单杂交发现拟南芥中
ABF2 和 ABF4 能够同 rd29B 基因(该基因受ABA 诱
导表达)启动子的ABRE结合, 而且二者都受干旱、
高盐或 ABA 信号的上游控制。研究表明, 在盐
渍、干旱等胁迫下, bZIP转录因子与顺式作用元
件ABRE等相互作用, 从而对耐盐基因在转录水平
上进行调节, 转录因子的调控为盐应答所必需(Uno
等2000)。已有研究表明, bZIP转录因子是植物胁
迫反应必需的, 其高量表达将增强植物对多种胁迫
的抗性。在以前研究中, 我们发现转bZIP基因的
烟草耐盐能力较非转基因烟草明显提高(Wang 等
2010)。在此基础上, 我们比较了一些抗逆相关基
因在转bZIP基因烟草和非转基因烟草间的表达量
差异。结果显示, 转基因烟草中的一些抗逆相关基
因的表达量明显提高, 说明bZIP转录因子能够通过
增强一些抗逆基因的表达来增强植物的抗逆能力。
材料和方法
1 材料
本实验室已从柽柳(Tamarix hispida Willd)中克
隆了一个bZIP基因, 并将其用组成型启动子CaMV
35S驱动, 转入烟草(Nicotiana tabacum Linn)中, 经
Southern及Northern检测表明, bZIP已经转入烟草,
并成功表达(Wang 等 2010)。将转 bZIP 烟草 T1 代
种子, 种在温室花盆中, 生长基质为沙和草炭土(2:
1)。温室温度为24 ℃, 相对湿度为65%~75%, 每
天浇水, 保证土壤水分充足。种子萌发生长2个月
后, 用0.2 mol·L-1 NaCl溶液浇灌土壤进行盐处理。
在未胁迫(0 d)及胁迫下的短期、中期和长期即
1、4和7 d后, 分别取处理和对照烟草的健康叶片
用蒸馏水清洗, 拭干后置于-70 ℃中保存备用。
2 实时定量RT-PCR分析基因的表达
2.1 样品的制备 采用CTAB法(王玉成等2003)提
取不同处理的烟草叶片组织中总RNA, 经DNase I
(Promega)消化去除DNA。以 0.5 mg 总 RNA 为模
板, 应用PrimeScriptTM RT Reagent Kit (TaKaRa)进
行 cDNA 的合成。将合成的第一链的 cDNA 稀释
10 倍, 用作定量 RT-PCR 模板。
2.2 实时荧光定量RT-PCR 实时定量PCR反应试
剂盒为 SYBR Green Realtime PCR Master mix
(Toyobo, Japan)。反应体系为10 mL 2×SYBR Green
Realtime PCR Master mix, 引物各0.3 mL (20 mmol·L-1),
6.9 mL水, 2.5 mL模板。定量PCR反应条件为: 94 ℃
预变性30 s; 94 ℃ 12 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 40 s, 78.4
℃读板 1 s, 45 个循环。然后在荧光定量PCR 仪
(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)上完成RT-PCR。用
a-tubulin和ubiquitin基因作为内参基因。用2-DDCt
方法进行基因的相对定量分析(Livak和Schmittgen
2001), 用Graphpad Instat 3.0软件进行基因表达数
据的显著性分析。引物由上海生工生物公司合成,
引物序列见表 1。
结果与讨论
1 转基因和非转基因植株的基因表达比较
在以前研究中发现, 转bZIP基因烟草的抗逆
能力显著提高(Wang等2010), 说明bZIP转录因子
具有调控植物耐盐的能力。基因的表达在盐胁迫
前期会迅速产生反应, 并随着胁迫时间的延长, 表
达量可能发生改变, 为了更全面地了解基因在不同
胁迫时间内的变化趋势, 我们选取转基因烟草的
SO D、POD、ATP a s e、GST、LTP 和 LEA 等 6
个家族的11个抗逆相关基因, 比较非胁迫及盐(NaCl)
胁迫1、4和 7 d后上述基因在转基因及非转基因
烟草中的时序表达模式差异。结果表明, 在非胁迫
条件下(0 d), 转基因植株中仅仅poxN1表达显著
( P < 0.05)高于非转基因植株(图 1 - E )。此外,
TOBPXD、TOBLTP 和 ltp1 基因在转基因植株中的
表达显著(P<0.05)低于非转基因植株(图1-C、I和
J), 而其他基因则与非转基因植株的表达量无显著
(P>0.05)差异。说明bZIP转录因子可能直接调控
了 poxN1、TOBPXD、TOBLTP 和 ltp1 基因的表
达, 使之表达量升高或降低。在NaCl胁迫1 d时,
在转基因植株中, 除TOBLTP基因(图1-I)外, 其他
基因的表达量显著(P<0.05)高于对照非转基因植
株, 在NaCl胁迫4 d时, poxN1、H+-ATPase和 ltp1
(图 1-E、F和 J)基因的表达量显著(P<0.05)高于
对照非转基因植株; 在NaCl胁迫7 d时, 各基因的
表达量都显著(P<0.05)高于对照非转基因植株, 说
明bZIP转录因子能够直接或间接地调控这些基因
的表达, 使它们的表达量显著增强。
2 bZIP转录因子对植物耐盐相关基因的调控
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)
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在植物抗氧化胁迫中具有清除氧自由基、维持活
性氧代谢平衡的功能, 是防止质膜过氧化, 保护膜
系统的关键酶(Comic 2000)。比较转基因烟草各
株系的Cu/ZnSOD (GenBank登录号为EU123521, 图
1-A)和 MnSOD 基因(GenBank 登录号为AB093097,
图1-B)表达量可以发现, 两种SOD基因的表达模式
相似, 都是在胁迫前期表达量显著升高(P<0.05), 在
胁迫4 d与对照无显著差异, 而后基因的表达量又
逐步升高, 并在7 d时达到最高峰(P<0.05)。而在
非转基因烟草中, Cu/ZnSOD的表达量在NaCl胁迫
不同时间有所上升, 但均低于转基因植株, 而
MnSOD的表达量在胁迫下除第4天外, 其表达量明
显低于转基因植株。以上结果说明, 由于bZIP基
因的表达, 增强了 Cu/ZnSOD 和 MnSOD 的基因表
达。因此, Cu/ZnSOD 和 MnSOD 基因的表达可能
受 bZIP 转录因子的直接或间接调控。
过氧化物酶(peroxidase, POD)在植物抗氧化胁
迫中具有清除氧自由基、维持活性氧代谢平衡的
功能, 是防止质膜过氧化, 保护膜系统的关键酶。
植物细胞中含有 POD 等多种抗氧化酶类和抗氧化
化合物来清除细胞内的活性氧, 植物在逆境条件下
受伤害的程度及植物对逆境的抵抗能力与其体内的
POD 活性有关, 其活性越高, 植物的抗逆性越强
(Flexas和Medrano 2002; 赵丽英等2004)。比较
转基因烟草各株系POD活性可以发现, 在 NaCl处
理过程中, 两种 POD 基因 TOBPXD (GenBank 登录
号为D11396, 图 1-C)和 PER4-9 (GenBank登录号
为AY032675, 图1-D)的表达模式在转基因及非转
基因植株中相近。在非转基因植株中, 它们都是在
胁迫1 d和4 d时表达量减少, 然后恢复, 在胁迫7 d
后表达量恢复到胁迫前水平或高于胁迫前。在转
基因植株中, 它们在胁迫4 d后表达量明显降低, 而
表1 荧光定量PCR的引物序列
Table 1 Primers sequences for fluorescent quantitative PCR
基因 GenBank 登录号 引物序列(5→3)
a-tubulin AJ421412 F: T AAC CA TC ATA GA AGA GG GT TC
R : G C A A T C C T T C T T G A C A A T G A G G
ubiquitin DQ830978 F: TGGTCGGGTGGGATTCCCTCT
R : G C C A A G A T A C A G G A T A A G G A G G
Cu/ZnSOD EU123521 F: TGTCACGGGACCACATTAC
R : C AC C AG C AT T TC C AG T AG C
M n S O D AB093097 F: G CAACTC CACGGC TTCCAG ACC
R : C G A T A GC C C A A C C A A GA G A A C C
T O B P X D D11396 F: GAAATCCTGGCTCCGCTCTG
R : T G GA G T T G C C T T G GT A A G A G
PER4-9 AY032675 F: A GGGGAAAT GTTATTGT CTCC
R : C A C A T T G G G A A G T A C C A C T A G
poxN1 AB044154 F: A TCGGTC CACAGC TTCTGG TCTG
R : A G G G T C T C A A C A C T C A A G A T C
Lea5 AF053076 F: GTGCCAGGTGGAGTGAGAGG
R : G GG A CG T GG T A TG G TA A CC A
G S T D10524 F : T TG G CC T TC T A CT T CC A TC C
R : T G T C A A C T G C A A C C A T G A G A G
TOB LTP D13952 F: GT AA GGA ATG TTG AC ACC AC
R : G A A T G G A A A T G G T A G G T A A G
ltp1 X62395 F : A A T A G C T G G G A A A A T T G C A T G
R: CA G TG G A AG G GC T GA T C TT G
H+-ATPase X66737 F: T CAGCAGGA ATGATGT CTCC
R : T CA T GG A AG C T GC T GC T GT C
V-ATPase subunit G (vag2) AJ005900 F: C TTTTAGGT GCCGAGC AGGA
R : A G G A G C A T C T G G A C A A C A T C A G
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在胁迫7 d时, 表达量上升, 并远高于胁迫前。另
一POD基因 poxN1 (GenBank登录号为AB044154,
图 1-E)的表达模式在转基因与非转基因植株中相
同, 都是在胁迫1~4 d表达量无明显变化, 而在胁
迫7 d表达量明显上升, 且转基因植株的表达量明
显高于非转基因植株。这些结果说明, 在盐胁迫
下, bZIP转录因子能够增强POD家族基因的表达,
从而可能增强植物体内清除活性氧的能力, 增强植
物的耐盐性。
质膜H+-ATPase 是植物细胞质膜上的一种重
图1 NaCl处理后基因在转基因及非转基因烟草中的时序表达模式差异
Fig. 1 Gene expression levels in transgenic and non-transgenic plants after different NaCl treatment periods
横坐标为通过NaCl处理的不同时间, 纵坐标为基因的相对表达量(对照值为1), *表示同一处理条件下转基因植株与非转基因植
株的基因的表达产生显著(P<0.05)差异。A: Cu/ZnSOD; B: MnSOD; C: TOBPXD; D: PER4-9; E: poxN1; F: H+-APTase; G: V-ATPase;
H: GST; I: TOBLTP; J: ltp1; K: Lea5。
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要功能蛋白, 是植物生命活动过程的主宰酶, 该酶
与植物生长发育极为密切, 细胞内的pH调节、细
胞伸长、气孔开闭调节等一系列生理过程都与质
膜H+-ATPase 有关。由于 H+-ATPase 能为细胞中
离子和代谢物质进行跨液泡膜运输提供能量(刘玲
玲等2004)。因此, 可以调节细胞对盐胁迫的耐受
性。比较非转基因和转基因烟草各株系ATPase类
基因的表达发现, H+-ATPase (GenBank登录号为
X66737, 图1-F)和V-ATPase subunit G (GenBank登
录号为AJ005900, 图1-G)在受胁迫前期表达量变化
不大, 但在7 d时表达量明显增加。并且, 在胁迫
7 d时, 转基因烟草的H+-ATPase和V-ATPase sub-
unit G显著高于非转基因植株。研究结果表明, 在
非胁迫条件下, 各转基因烟草与对照之间的ATPase
活性差异显著, 在盐逆境条件下由于bZIP转录因子
的表达, 明显提高了这两个基因的表达量。
谷胱甘肽-S-转移酶(GST)能清除细胞内的自
由基和过氧化物。氧在机体内易发生单电子还原,
生成超氧阴离子(O2-), 并能衍生出 H2O2和 ·OH等
活性氧或自由基。这些自由基会引起脂质过氧化
和某些酶的失活, 产生氧化损伤(Bate和Twell 1998)。
由于GSH- Px将 H2O2还原成H2O, 降低了自由基生
成的可能性, 从而发挥了保护作用。盐胁迫下, 转
基因和非转基因植株的GST基因(GenBank登录号
为D10524, 图1-H)表达模式相近, 都是在盐胁迫第
7天表达量明显增加, 但在转基因植株中, GST基因
的表达在胁迫1和7 d表达量显著高于非转基因植
株, 说明, 在盐胁迫下, bZIP转录因子可能间接地
调控了GST基因的表达, 从而可能增强植物的体内
清除自由基和过氧化物能力, 增强其耐盐能力。
脂质转移蛋白(lipid transfer protein, LTP)是在
高等植物生命活动中一类重要的活性蛋白质, 占细
胞可溶性蛋白的4%, 其显著的结构特征是分子内
有一个疏水孔穴, 在体外能够可逆地结合和转运多
种类型的疏水分子。LTPs 具有低分子量、高位
置保守性的特点, 如具有8个保守的半胱氨酸Cys
位点, 在N端具有典型的信号肽结构, 在植物生殖
发育、抗性和防御反应及信号转导中行使着重要
的生理生化功能(李诚斌等2006; 徐民俊等2002)。
比较转基因烟草各株系LTP含量可以发现, 在非胁
迫下, 转基因植株中TOPLTP基因(GenBank登录号
为X62395, 图1-I)和LTP1基因(GenBank登录号为
D13952, 图1-J)的表达量略低于非转基因植株, 而
在盐胁迫后(1和4 d), 转基因植株的2种LTP基因
TOPLTP 和 LTP1 明显高于非转基因植株, 在胁迫
7 d, 转基因植株中的TOPLTP 基因远远高于非转
基因植株。说明在盐逆境条件下由于bZIP基因的
表达, 提高了 LTP 的表达量。从而使 LTP 的活性
提高, 增强了植物的耐盐能力。
晚期胚胎富集蛋白(late-embryogenesis-abun-
dant protein, LEA)是在正常性种子胚胎发育后期、
伴随脱水干燥过程形成的一类低分子量蛋白, 在水
分亏缺、盐胁迫、渗透胁迫和冷害条件下的植物
组织中都积累该蛋白(Chen等2007; 王俊刚等2002;
孙海丹等2004)。比较转基因烟草植株Lea5 (Gen
Bank登录号为AF053076, 图1-K)表达量可以发现,
在NaCl胁迫下, 转基因和非转基因烟草的Lea5基
因表达量都是逐步升高。同时, 胁迫1 d和7 d时,
转基因植株 Lea5 的表达量明显高于非转基因植
株。说明, bZIP 转录因子能够直接或间接调控
Lea5基因的表达, 并通过增强Lea5的表达从而提
高植物的耐盐能力。
本研究从柽柳中分离出一个bZIP基因, 在盐
胁迫下研究了该基因对一些抗逆基因表达的调控,
通过对非转基因植株和转 bZIP 基因植株的 SOD、
POD、ATPase、GST、LTP 和 LEA 等基因进行
表达分析。在非胁迫条件下, Cu/ZnSOD 和 poxN1
表达显著高于非转基因植株, 而其他基因则与非转
基因植株的表达量无显著差异, 说明bZIP转录因子
能够直接调控这两个基因的表达。在盐胁迫下, 除
TOBLTP基因外, 其他基因的表达量都显著高于对
照非转基因植株, 表明在盐胁迫条件下, bZIP转录
因子能够直接或间接调控一些抗逆基因的表达从而
增强其抗逆能力。本研究为将bZIP转录因子用于
抗逆基因工程育种奠定了基础。
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