全 文 ：水稻内生固氮细菌的生化特性及其对烟草和玉米的侵染 ?
王逸群1 , 钟秀容2
(1 福建师范大学生命科学学院发育与神经生物学重点实验室 , 福建 福州 350108;
2 福建医科大学电子显微镜室 , 福建 福州 350004)
摘要 : 对水稻内生固氮菌 N1 (短小芽孢杆菌 , Bacillus pumilus)、N2 (阴沟肠杆菌 , Enterobacter cloacae) 和
N3 (鹑鸡肠球菌 , Enterococcus gallinarum) 的一些生化特性及其对烟草和玉米的侵染进行了研究。采用三亲
交配法将标记基因 nifH- lacZ、 nifHDK-lacZ和 gfp分别导入到固氮菌中 , 用携带标记基因的固氮菌分别接种
烟草云烟 85 和玉米吉甜 6 号 , 对感染固氮菌的烟草和玉米材料进行β-半乳糖苷酶组织化学染色和激光共
聚焦扫描显微镜、透射电子显微镜和扫描电子显微镜观察。光学显微镜和电子显微镜观察结果表明在接菌
的烟草和玉米部分根细胞中和细胞间隙都发现了固氮菌 , 在接菌的玉米茎的维管组织细胞中也发现了固氮
菌 , 推测固氮菌从玉米根开始向上移动。接种固氮菌 N3 的玉米与对照相比 , 在鲜重上提高了 18 .53 %。
关键词 : 固氮菌 ; 生化特性 ; 烟草 ; 玉米 ; 侵染
中图分类号 : Q 939 .1 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2008 ) 02 - 211 - 10
Biochemical Characteristics of Rice Endophytic Diazotrophic
Bacteria and Their Infection to Tobacco and Maize
WANG Yi-Qun1 , ZHONG Xiu-Rong2
( 1 Laboratory of Neural and Developmental Biology, College of LifeSciences, Fujian Normal University, Fuzhou 350108 , China;
2 Department of Electron Microscope, Fujian Medical University, Fuzhou 350004 , China)
Abstract: Some biochemical properties of rice endophytic diazotrophic bacteria N1 ( Bacillus pumilus) , N2 ( Enterobacter
cloacae) and N3 ( Enterococcus gallinarum) were characterized in this study . The plasmids harboring the reporter gene
lacZ fused to the promoters of nifH and nifHDK , and the reporter gene gfp aswell , were first transformed into riceendo-
phytic diazotrophic bacteria respectively through triparental mating . After the conjugated bacteria were inoculated into to-
bacco Yunyan85 andmaize Jitian 6 , the stainingofβ-galactosidasewas carried out on thetobacco andmaize roots and the
observation was made under theconfocal laser scanningmicroscope, transmissionelectronmicroscopeand scanningelectron
microscope . The results showedthat the riceendophytic diazotrophic bacteriawerenot only present inepidermal cells, cor-
tex cells and intercellular spaces of tobacco andmaize roots, but also found in vascular tissuecells of maize stem also, in-
dicatingthat the bacteria hadmigrated fromthe roots into the stem . Data showed that the the fresh weight of maize plants
inoculated with riceendophytic diazotrophic bacteria N3 was 18 .52% morethan that of the control .
Key words: Endophytic diazotrophic bacteria; Biochemical characteristics; Tobacco; Maize; Infection
非豆科植物自主固氮是世界生物固氮研究中
的重大和热点问题。目前国内外已经从非豆科植
物中分离到了一些内生固氮细菌 , 1986 年 Bar-
bara从卡拉草内分离到了具有高固氮效率的固氮
弧菌 ( Azoarcus sp .) ; 1987 年巴西 Dobereiner 实
验室从甘蔗体内分离到内生固氮菌醋酸固氮菌
云 南 植 物 研 究 2008 , 30 (2) : 211～220
Acta Botanica Yunnanica

? ?基金项目 : 福建省科技厅重点科技项目 (2004N026)、福建省自然基金项目 ( B0410009) 和福建省教育厅科技项目 ( JB03125) 资助
收稿日期 : 2007 - 06 - 17 , 2007 - 09 - 17 接受发表
作者简介 : 王逸群 (1964 - ) 男 , 博士 , 副教授。研究方向 : 植物生物技术。 E-mail : yiqun@fjnu. edu. cn
( Acetobacter iazotrophicus) , 可以提供给甘蔗大部
分氮素营养 ; 1981 年丘元盛等从水稻根中分离
到了粪产碱菌 ( Alcaligenes facalis) A-15 , 已经成
功地构建了工程菌株 (Stoltzfus等 , 1997; Reinhold-
Hurek and Hurek, 1986; Lima等 , 1987; 丘元盛等 ,
1981a, b; 尤崇杓等 , 1982)。值得一提的是 , 丘元
盛等 (1981a, b) 对固氮菌 A-15 和 E-26 的生理生
化性状进行了研究 ; 之后国内外一些学者对从不
同种植物分离到的不同固氮细菌也进行了生理生
化方面的研究 , 取得了很多有意义的进展 (关秀
清等 , 1997; 孙晓璐等 , 1999; 朱美珍和吴永强 ,
1999; 丁延芹等 , 2004; Hannan等 , 2004; 姚拓等 ,
2004)。前人的研究结果给了我们很大启示 , 要
实现非豆科植物的自主固氮 , 首先必须从植物体
中分离固氮细菌 , 然后对其性质进行研究 , 并探
讨能否扩大其宿主范围等。本文利用笔者从福建
省推广的水稻品种中分离到的固氮酶活性较大的
3 株水稻内生固氮细菌 (王逸群等 , 2005 ) , 对其
生物化学性质进行研究 , 用这 3 株固氮细菌接种
烟草和玉米 , 在透射电子显微镜、扫描电子显微
镜以及激光共聚焦扫描显微镜下观察它们对烟草
和玉米根细胞的侵染 , 本实验旨在为扩大水稻内
生固氮菌的宿主范围以及为进一步研究内生固氮
细菌与植物相互作用奠定基础。
1 材料与方法
1 .1 植物材料
烟草云烟 85、玉米吉甜 6 号由本室保存。
1 .2 菌株和质粒
水稻内生固氮细菌 N1 ( 短小芽孢杆菌 , Bacillus
pumilus) 、N2 (阴沟肠杆菌 , Enterobacter cloacae) 和 N3
(鹑鸡肠球菌 , Enterococcus gallinarum) 由本室从水稻根
中分离并保存 (王逸群等 , 2005 )。质粒 pHC60 携带能在
原核细胞中表达的 gfp基因 (四环素抗性 ) 由中国科学
院植物研究所荆玉祥研究员惠赠 ; 质粒 pGFP4412 携带能
在原核细胞中表达的 gfp基因 (卡那霉素抗性 ) 由中国
农业大学陈三凤教授赠送 ; 含有 nifH 启动子调控的 lacZ
基因的 pAB358 (卡那霉素抗性 ) 和协助质粒 pRK2013 由
中国农业大学李季伦教授惠赠 ; 携带由启动子 nifHDK 调
控的 lacZ基因的 pMB210 (四环素抗性 ) 由北京大学王
忆平教授赠送。
1 .3 方法
1 .3 .1 水稻内生固氮菌的生化特性实验
1 .3 .1.1 水稻内生固氮菌的糖发酵实验 以蛋白胨 - 水
为培养基 , 分别加入葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖、阿
拉伯糖、木糖等 , 使单糖的最终浓度为 1 .0% , 以酚红
作为指示剂。将装有以上培养基的试管接种固氮菌 N1、
N2 和 N3 , 以不接种细菌的试管作为对照 , 放入培养箱
中 28℃暗培养 , 48 h后进行观察。
1 .3 .1.2 淀粉水解和明胶液化实验 在淀粉琼脂平板上
划线接种固氮菌 N1、N2 和 N3 , 以不接种细菌的平板作
为对照 , 置培养箱中 28℃暗培养 , 48 h后 , 在平皿上滴
加碘液 , 无菌处平皿呈蓝黑色 , 若细菌生长线周围变成
透亮的无色 , 为阳性 ( + ) , 若细菌生长线周围仍为蓝
黑色 , 为阴性 ( - )。
在装有明胶培养基的试管中 , 接种固氮菌 N1、N2
和 N3 , 以不接种细菌的试管作为对照 , 放入培养箱中
28℃暗培养 , 48 h后将试管放入 4℃冰箱 30 min后 , 进行
观察 , 明胶培养基呈液化状态为阳性 ( + ) , 无液化现
象发生则为阴性 ( - )。
1 .3 .1.3 触酶实验 使用无菌牙签将固氮菌 N1、N2 和
N3 从平板上取出 , 将菌体涂于载玻片上 , 用微量移液器
将一滴过氧化氢溶液加于菌体之上 , 若有气泡产生 , 则
为阳性 ( + ) , 若无气泡产生 , 则为阴性 ( - )。
1 .3 .1.4 脲酶实验 在装有尿素琼脂培养基的试管中 ,
接种固氮菌 N1、N2 和 N3 , 以不接种细菌的试管作为对
照 , 放入培养箱中 28℃暗培养 48 h后进行观察 , 若斜面
上有紫红色产生 , 则为阳性 ( + ) , 若无紫红色产生 ,
则为阴性 ( - )。
1 .3 .1.5 耐盐性实验 本实验所用 M9 基础盐培养基的
成分如下 : 每升含 ( NH4 )2 SO4 1 .0 g, K2 HPO4 1 .4 g,
KH2 PO4 0 .6 g, MgSO4 0 .1 g, CaCl2 0 .1 g, 葡萄糖 5 g, NaCl
视实验需要添加 , pH 为 6 .8～7.0。在含有各种不同浓度
NaCl的 M9 基础盐培养基上接种固氮菌 N1、N2 和 N3 ,
观察其生长情况 , 判断其耐盐性。
1 .3 .1.6 氧化酶实验 取洁净的一张灭菌的滤纸 , 放到
培养皿中 , 用无菌玻璃棒取固氮菌培养物涂于滤纸片
上 , 再滴加新配制的 1 % 二甲基对苯二胺盐酸盐试液 ,
在 30 s内由粉红色逐渐变成紫红色 , 氧化酶反应为阳性 ,
否则为阴性。
1 .3 .1.7 乙酰甲基甲醇生成实验 将固氮菌接种在磷酸
盐葡萄糖蛋白胨水培养基中 , 28℃培养 48 h后 , 每 2 ml
培养中加入α-萘酚乙醇试液 1 ml , 混匀 , 在加 40%氢氧
化钾溶液 0 .4 ml , 充分振荡 , 4 h以内出现红色为阳性 ,
无红色反应为阴性。
1 .3 .1.8 枸橼酸盐利用实验 将固氮菌接种在枸橼酸钠
斜面培养基上 , 28℃培养 48 h, 斜面培养基上有菌苔生
长 , 培养基由绿色变为蓝色为阳性 , 培养基颜色无改变
时为阴性。
212 云 南 植 物 研 究 30 卷
1 .3 .1.9 硝酸盐还原产气实验 将固氮菌接种在硝酸盐
蛋白胨水培养基中 , 28℃培养 48 h, 在装有培养基的杜
氏小管中有气体产生 , 即为阳性 , 否则为阴性。
1 .3 .1.10 靛基质实验 将固氮菌接种在蛋白胨水培养
基中 , 28℃培养 48 h, 沿试管壁加入靛基质试液 0 .3～
0 .5 ml, 液面呈玫瑰红色为阳性 , 呈试剂本色为阴性。
1 .3 .1.11 苯丙氨酸脱氨酶实验 将固氮菌接种在苯丙
氨酸斜面培养基上 , 28℃培养 48 h。在培养好的菌种斜
面上滴加 2～3 滴 10% 三氯化铁溶液 , 自培养物上方流
到下方 , 呈蓝绿色者 , 为阳性反应 , 否则为阴性反应。
1.3.2 三亲交配法将报告基因 gfp和 lacZ导入到固氮菌中
按莫才清等 ( 1997 ; 1998 ) 的三亲交配法将报告基
因 gfp和 lacZ导入到固氮菌 N1、N2 和 N3 中。
1.3.3 烟草和玉米无菌苗的制备和水稻内生固氮菌的接种
烟草和玉米种子用 1%的硝酸银消毒 5 min, 无菌水
洗涤 5 次 , 再用 95% 的乙醇消毒 10 s, 用无菌水洗涤 5
次 , 放到装有 LB 固体培养基的平板上 28℃暗培养 2 d
后 , 将无任何污染的种子转入到 1?2 MS 固体培养基上黑
暗培养 1 星期后萌发。烟草和玉米种子发芽后 , 进行光
照培养 , 培养条件为 : 培养温度为 26℃ , 光照培养采用
16 h光照和 8 h黑暗的方式。
将萌发 2～3 星期并且没有污染的烟草和玉米转入到
装有 Hurek固体培养基的大试管 (玉米用培养瓶 ) 进行
光照培养 , 试管口用无菌的封口膜封住。将固氮菌 N1、
N2 和 N3 接种在 Hurek液体培养基中 , 摇床转速为 220 r?
min, 温度为 28℃的条件下培养 3 d后 , 取细菌培养物 ,
用 50 ml 离心管在 4℃、10 000 r?min下离心 5 min, 去上清
液 , 用磷酸缓冲盐溶液 PBS ( pH = 7 .3) 悬浮细菌沉淀
后 , 用微量移液器吸取该菌液 2 ml, 接种在烟草和玉米
根附近后 , 将宽度为 3 cm的牛皮纸卷成圆筒 , 罩住接菌
材料的根部 , 然后连同不接菌的材料作为对照一起 , 在
26℃条件下进行光照培养。
1 .3 .4 β-半乳糖苷酶组织化学染色和徒手切片的制作
用无菌镊子夹取接种含有标记基因 lacZ 的固氮菌
N1、N2 和 N3 感染烟草和玉米材料 , 然后用无菌刀片将烟
草和玉米根切成 1 cm左右的小段后 , 放到无菌水中清洗
10 次 , 然后在 20%的次氯酸钠溶液中消毒 5 min, 用无菌
水清洗 10 次后 , 放到消过毒的滤纸上去除根表面沾着的
水。将表面消过毒的烟草和玉米根放到装有 LB 固体培养
基的平板上 1 h后 , 将烟草和玉米根再放回 eppendorf 管
中。LB 平板 28℃黑暗培养 48 h, 如果没有菌落长出来 ,
表明烟草和玉米根表面消毒干净 , 没有细菌存在。取表
面消毒干净的烟草和玉米根 , 用 0.1 mol?L 的磷酸钠缓冲
液 ( pH = 7 .2) 洗涤 3 次 , 每次 5 min。用溶于 0.2 mol?L 二甲
基砷酸钠 ( pH = 7.2) 中的终浓度为 1.25% 的戊二醛固定
30 min, 抽真空 1 h。固定后的材料用 0 .2 mol?L 的磷酸钠缓
冲液 ( pH = 7.2) 洗涤 3 次 , 每次 15 min。转移到染色液中
染色 , 在黑暗条件下 , 温育过夜 , 用无菌水洗涤 5 次 , 每
次 10 min。用 12%的次氯酸钠透明 40 s。β-半乳糖苷酶组
织化学染色后按文献 (Boivin等 , 1990; 李正理 , 1996) 介
绍的方法制作徒手切片。在显微镜下观察和拍照。
1 .3 .5 烟草和玉米接种固氮细菌后对细菌进行光学显微
镜观察 分别取接种固氮细菌 7 d、14 d、21 d、28 d的烟
草和玉米经过β-半乳糖苷酶组织化学染色后呈蓝色的
根 , 与不接菌的烟草和玉米的根作为对照一起 , 用 3%
戊二醛和 1%锇酸进行双固定 , 依次置于各级丙酮中脱
水 , Spurr树脂渗透、包埋 , 在 LKB2088 型超薄切片机上
切片 (李正理 , 1996)。美蓝染色 , 光学显微镜下观察。
1 .3 .6 对接种固氮细菌的烟草和玉米进行激光共聚焦扫
描显微镜观察 将分别取接种含有报告基因 gfp的固氮
细菌 7 d、14 d、21 d、28 d的烟草和玉米材料 , 经过无菌
水清洗 10 次后 , 用次氯酸钠进行表面消毒 , 无菌水清洗
后放到 LB 固体培养基的平板上 1 h, 同样将该 LB 固体培
养基平板 28℃黑暗培养 48 h, 来探测烟草和玉米根表面
消毒的效果。取表面消毒干净的烟草和玉米根 , 进行徒
手切片 , 在激光共聚焦扫描显微镜下观察。绿色通道的
激发光波长为 488 nm, 红色通道的激发光波长为 568 nm。
观察烟草材料时 , 用 488 nm+ 568 nm双光扫描 ; 观察玉
米材料时 , 488 nm+ 568 nm+ 透射光三通道观察 (程在全
等 , 2002; 刘元等 , 2003; 迟峰等 , 2004)。将不接菌的根
作为对照。
1 .3 .7 烟草和玉米接种固氮细菌后对固氮细菌进行电子
显微镜观察 分别取接种固氮细菌 7 d、14 d、21 d、28 d
的烟草和玉米根 , 经过固定、脱水和包埋后 , 先进行半
薄切片 , 通过光学显微镜下观察定位后 , 进行超薄切
片 , 切片厚度为 60～80 nm, 用醋酸双氧铀和柠檬酸铅双
染 , 在 JEM-100CX?II 型透射电镜下观察和拍照 (崔克明
等 , 2000)。将不接菌的根作为对照。
1 .3 .8 接种固氮细菌的烟草对固氮细菌进行扫描电子显
微镜观察 接种固氮细菌的烟草和玉米根连同未接种固
氮菌的材料一起 , 经过固定、脱水、临界点干燥后喷
金 , 在 JSM-5310LV 型扫描电镜下观察和拍照。
1 .3 .9 烟草和玉米接种固氮细菌后对固氮细菌的分离
分别取接种固氮细菌 7 d、14 d、21 d、28 d的烟草和
玉米根 , 对烟草和玉米的根进行表面消毒 : 0 . 1% 的
HgCl2 消毒 5 min, 无菌水洗涤 5 次 , 70%乙醇消毒 1 min,
无菌水洗涤 5 次。后将烟草和玉米根放到 LB 固体培养
基的平板上 1 h后 , 取出烟草和玉米根 , 然后将该 LB 固
体培养基平板 28℃黑暗培养 48 h, 如果 LB 平板上没有菌
落长出来 , 证明烟草和玉米根表面消毒干净。取表面消
毒干净的烟草根 (鲜重约 500 mg) 和玉米根 (鲜重约 1
g) , 放入适量灭菌石英砂和无菌水的研钵中研碎 , 转入
3122 期 王逸群和钟秀容 : 水稻内生固氮细菌的生化特性及其对烟草和玉米的侵染
三角瓶内用磷酸缓冲盐溶液 PBS ( pH = 7 .3 ) 定容至 20
ml , 梯度稀释 10 - 1 ～10 - 4 , 每个梯度取 400μl 汁液涂布
在装有 Ashbg无氮固体培养基的平板上 , 28℃培养 , 36
～48 h长出菌落。将不接菌的根作为对照。
1 .3 .10 固氮菌对玉米的作用 首先将玉米种子表面消
毒 , 然后在无菌条件下萌发。将萌发 2～3 星期并且没有
污染的玉米转入到装有 Hurek 固体培养基的培养瓶中 ,
每个培养瓶种 1 株 , 进行光照培养。在 Hurek 液体培养
基中培养固氮菌 N1、N2 和 N3 , 摇床转速为 220 r?min,
温度为 28℃的条件下培养 3 d后 , 取细菌培养物 , 用 50
ml离心管在 4℃、10 000 r?min 条件下离心 5 min, 弃上
清 , 用磷酸缓冲盐溶液 PBS ( pH = 7 .3) 悬浮细菌沉淀
后 , 用微量移液器吸取该菌液 2 ml, 接种在玉米根附近
后 , 在 26℃条件下进行光照培养。每个菌种接种玉米实
验中设置了 3 组重复 , 在每个重复中每种细菌接种 10 株
玉米。以不接菌的玉米作为对照。
2 实验结果
2 .1 水稻内生固氮菌的生化特性
固氮菌 N1 只利用蔗糖 , 而不能利用其它糖
类 , 说明 N1 对碳源的利用范围较为狭窄 ; 而固
氮菌 N2 和 N3 除了乳糖外 , 对其它糖类都能利
用 , 说明 N2 和 N3 对碳源的利用具有广泛性。
触酶可以催化将过氧化氢分解成为水和氧的反
应 , 触酶的功能是将代谢过程产生的、具有毒性
的过氧化氢除去 , 以保护细菌不被伤害。本实验
中的固氮菌 N1、N2 和 N3 触酶反应都为阳性 ,
说明它们具有排除代谢中产生的过氧化氢的能
力。三株固氮菌的耐盐浓度都是在 3% , 这说明
本实验的三株固氮菌与大多数细菌一样 , 其耐盐
浓度在 3% ～5% 范围内 , 不具有耐受高浓度盐
的能力 ( 表 1 )。
2.2 β-半乳糖苷酶组织化学染色与徒手切片观察
取固氮菌感染的烟草和玉米的根 , 进行β-半
乳糖苷酶组织化学染色 , 接菌的材料染成蓝色 ,
而对照没有染色反应。对染成蓝色的烟草材料 ,
进行徒手切片后 , 在显微镜下观察 , 结果表明在
烟草根的部分表皮细胞、内皮层细胞被染成蓝色
(图 1: C)。
2 .3 C对接种固氮细菌的烟草和玉米根根进行光
学显微观察
光学显微镜观察结果表明 : 在接种固氮细菌
的烟草根表皮细胞、内皮层细胞中发现细菌存
在 , 而未接菌的对照烟草根细胞中没有发现细菌
(图 1: D)。在接种固氮菌的玉米根细胞中 , 部
分内皮层细胞 , 维管组织细胞中发现细菌 , 而对
照没有发现细菌。
2 .4 C对接种固氮细菌的烟草和玉米进行激光共
聚焦扫描显微镜观察
激光共聚焦扫描显微镜观察结果表明 , 在接
种携带报告基因 gfp的固氮细菌的烟草材料中 ,
在根的表皮细胞和内皮层细胞可以观察到绿色荧
光小点 ( 图 1: F; 图 2: I) , 在根尖细胞中绿色
表 1 水稻内生固氮菌的生理生化特性
Table 1 Biochemical and physiological characteristics of endophytic diazotrophic bacteria obtained from rice plants
性质 Characters
水稻内生固氮菌菌株
Rice endophytic diazotrophic bacteria
N1 ?
( Bacillus
pumilus)
N2
( Enterobacter
cloacae)
N3
( Enterococcus
gallinarum)
性质 Characters
水稻内生固氮菌菌株
Rice endophytic diazotrophic bacteria
N1
( Bacillus
pumilus)
N2 D
( Enterobacter
cloacae)
N3 0
( Enterococcus
gallinarum)
葡萄糖 (Glucose) - + + 枸橼酸盐利用 + + +
乳糖 (Lactose) - - + ( Citrate utilization)
甘露醇 (Mannitol) - + + 硝酸盐还原 - + +
蔗糖 ( Sucrose) + + + ( nitrate reduction)
阿拉伯糖 ( Arabinose) - + + 靛基质 - - -
木糖 ( Xylose) - + + ( indole production)
甘露糖 (Mannose) - + + 耐盐性
淀粉酶 (Amylase) - - - ( salt tolerance) :
脲酶 ( Urease) - - + 0 ?% 的 NaCl + + +
明胶液化 - - - 3 ?% 的 NaCl + + +
( Gelatin hydrolysis) 6 ?% 的 NaCl - - -
触酶 ( Catalase) + + + 8 ?% 的 NaCl - - -
氧化酶 (Oxidase) - - - 苯丙氨酸脱氨酶实验 - - -
乙酰甲基甲醇生成 - + + (Phenylalaninedeaminase test)
( Voges- Proskauer test)
412 云 南 植 物 研 究 30 卷
图 1 A . 未接固氮菌的烟草根作为对照 ; B . 接种携带标记基因 lacZ 的固氮菌 N1 并且经过β-半乳糖苷酶组织化学染色后的烟草根 ;
C . 对β-半乳糖苷酶组织化学染色后的烟草根进行徒手切片 (箭头所指为染成蓝色的细胞 ) ; D～ E . 烟草根的半薄切片 ; D . 接种固氮
菌 N1 的烟草根细胞 ( 箭头所指为固氮细菌 ) ; E . 未接菌的烟草根细胞作为对照 ; F～G . 对接种携带标记基因 gfp 的固氮菌的烟草根
进行激光共聚焦扫描显微镜观察 ; F .接种携带标记基因 gfp的固氮菌 N3 的烟草根 (箭头所指为固氮细菌 ) ; G . 接种携带标记基因 gfp
的固氮菌 N3 的烟草根尖 (箭头所指为固氮细菌 )
Fig . 1 A . Control , tobacco roots without inoculation; B . After inoculation of the endophytic diazotrophic bacteria N1 taggedwith lacZ gene, tobacco roots
were stained forβ-galactosidase activity; C . Micrograph of a free-hand cross-section of a tobacco root inoculatedwith therice endophytic diazotrophic bacteria
N1 taggedwith lacZgene after histochemical staining ofβ-galactosidase (the arrow) ; D-E . Semi-thinsection of tobacco roots; D . After inoculation of rice en-
dophytic diazotrophic bacteria N1 , thediazotroph bacteria were found in cell of tobacco roots ( the arrow) ; E . control , tobacco roots without inoculation; F-
G . The observation of tobacco roots inoculated with rice endophytic diazotrophic bacteria taggedwith gfp geneunder the confocal laser scanning microscope;
F . After inoculation of rice endophytic diazotrophic bacteriaN3 tagged with gfp gene, the diazotroph bacteriawere found in the cellsof tobacco roots (the ar-
row) ; G . After inoculation of rice endophytic diazotrophic bacteria N3 taggedwith gfp gene, thebacteriawere found in the cells of tobacco root tip
5122 期 王逸群和钟秀容 : 水稻内生固氮细菌的生化特性及其对烟草和玉米的侵染
图 2 H～M . 对接种携带标记基因 gfp的固氮菌的烟草和玉米材料进行激光共聚焦扫描显微镜观察 ; H . 未接菌的烟草根作为对照 ; I .
对接种携带标记基因 gfp的固氮菌 N3 的烟草根细胞进行观察 (横切 ) , (箭头所指为固氮细菌 ) ; J . 未接菌的玉米根细胞作为对照 (横
切 ) ; K . 对接种携带标记基因 gfp 的固氮菌 N2 的玉米根细胞进行观察 (横切 ) , ( 箭头所指为固氮细菌 ) ; L . 对接种携带标记基因 gfp
的固氮菌 N2 的玉米茎细胞进行观察 (横切 ) , ( 箭头所指为固氮细菌 ) ; M . 对接种携带标记基因 gfp 的固氮菌 N2 的玉米茎维管组织细
胞进行观察 ( 横切 ) , (箭头所指为固氮细菌 )
Fig . 2 H-M . Theobservation of tobacco and maize inoculated with rice endophytic diazotrophic bacteria tagged with gfp gene under the confocal laser
scanning microscope; H . Control , tobacco roots without inoculation; I . The diazotroph bacteriawere found in the cellsof tobacco roots inoculatedwith rice
endophytic diazotrophic bacteriaN3 tagged with gfp gene, ( cross section) ( the arrow) ; J . Control , maize roots without inoculation (cross section) ; K .
Thediazotroph bacteriawere found in the cells of themaizeroots inoculatedwith rice endophytic diazotrophic bacteriaN2 taggedwith gfp gene, (cross sec-
tion) ( the arrow) ; L . After inoculation of rice endophytic diazotrophic bacteria N2 tagged with gfp gene, the diazotroph bacteria were found in cells of
maize stem, (cross section) ( the arrow) ; M . After inoculation of rice endophytic diazotrophic bacteria N2 tagged with gfp gene, the diazotroph bacteria
were found in vascular tissue cells of maize stem, ( cross section) ( the arrow)
612 云 南 植 物 研 究 30 卷
图 3 N . 对照 , 未接菌的玉米茎维管组织细胞的激光共聚焦扫描显微镜观察 (横切 ) ; O～T . 对接种固氮菌的烟草和玉米根细胞进行
透射电子显微镜观察 ; O . 接种固氮菌 N2 后 14 天的烟草根 ( 箭头所示为细胞中的固氮菌 ) ; P . 接种固氮菌 N1 后 21 天的烟草根 ( 箭头
所示为细胞和细胞间隙中的固氮细菌 ) ; Q .对照 , 未接种固氮菌的烟草根 ; R . 接种固氮菌 N2 后 21 天的烟草根 (箭头所示为细胞中的
固氮菌 ) ; S . 接种固氮菌 N3 后 14 天的烟草根 (箭头所示为细胞间隙中的固氮菌 ) ; T . 对照 , 未接菌的玉米根
Fig . 3 N . Control , thevascular tissue cells of maize stemwithout inoculationwereobserved under the confocal laser scanningmicroscope ( cross section) ,
O-T . The observation of tobacco and maize roots under the transmission electron microscope; O . Theobservation of tobacco roots with inoculation of endo-
phytic diazotrophic bacteriaN2 after 14 days, The diazotrophwere found in cell of tobacco roots ( the arrow) ; P . Theobservation of tobacco rootswith inoc-
ulation of endophytic diazotrophic bacteria N1 after 21 days, The diazotroph were found in cell and intercellular spaces of tobacco roots ( the arrow) ; Q .
Control , tobacco roots without inoculation; R . Theobservation of tobacco roots with inoculation of endophytic diazotrophic bacteria N2 after 21 days, the
diazotroph were found in cell of tobacco roots ( the arrow) ; S . Theobservation of tobacco roots with inoculation of endophytic diazotrophic bacteria N3 after
14 days, the diazotroph were found in intercellular spaces of tobacco roots (the arrow) ; T . Control , the cells of maize roots without inoculation
7122 期 王逸群和钟秀容 : 水稻内生固氮细菌的生化特性及其对烟草和玉米的侵染
荧光小点分布较多 ( 图 1: G) , 而对照没有观察
到绿色荧光小点 , 说明固氮菌在接菌的烟草根细
胞中有分布。在接种携带报告基因 gfp的固氮细
菌的玉米根细胞中 , 在皮层细胞和维管组织细胞
中 , 有大量的绿色荧光小点分布 ( 图 2: K ) , 而
对照没有 ; 在接菌的玉米茎细胞中 , 在维管组织
细胞中 , 可以观察到绿色的小点 ( 图 2: L、M) ,
而对照没有。
2 .5 ?对接种固氮细菌的烟草和玉米根进行电子
显微镜观察
透射电子显微镜观察结果表明 : 在接种固氮
细菌的烟草根细胞和细胞间隙中 , 观察到了细菌
的存在 , 而未接菌的对照烟草根细胞没有发现细
菌 ( 图 3: O、P、R) , 而对照烟草材料的根细胞
中没有发现细菌。在接种固氮细菌的玉米根细胞
中 , 发现大量的固氮细菌存在 ( 图 4: U) 。
扫描电子显微镜观察结果表明 : 在接种固氮
菌的烟草根细胞中 , 观察到了细菌存在 (图 4:
Y ) , 而对照没有观察到细菌存在。
水稻内生固氮细菌 N1、N2 和 N3 侵入烟草和
玉米根后 , 没有发现宿主烟草和玉米根细胞对细
菌有排斥反应 , 使细菌发生死亡 , 因为在接种固
氮细菌后不同的时间内分别取烟草和玉米根分离
固氮细菌 , 都可以分离到固氮细菌 , 而对照未接
图 4 U . 接种固氮菌 N2 后 14 天的玉米根 (箭头所示为细胞中的固氮菌 ) ; V～Y . 对接种固氮菌的烟草根细胞进行扫描电子显微镜观察 ;
V . 未接菌的烟草根作为对照 ; W . V 的局部放大 ; X . 接种固氮菌 N3 后 14 天的烟草根 ; Y . X 的局部放大 (箭头所示为细胞中的固氮菌 )
Fig . 4 U . Theobservation of maizeroots with inoculation of endophytic diazotrophic bacteria N2 after 14 days, the diazotrophwere found in cell of maize
roots (the arrow) ; V-Y . Theobservation of tobacco roots with inoculation of endophytic diazotrophic bacteria under scanning electronmicroscope . V . Con-
trol , tobacco roots without inoculation; W . Showing the enlargement of parts of fig . V ; X . Theobservation of tobacco roots with inoculation of endophytic
diazotrophic bacteria N3 after 14 days; Y . Showing the enlargement of parts of fig . X , the diazotroph were found in cell of tobacco roots ( the arrow)
812 云 南 植 物 研 究 30 卷
菌的材料没有分离到固氮细菌 ; 并且电子显微镜
的观察结果显示在接种固氮细菌后不同时间内烟
草和玉米根细胞中都可以观察到细菌 , 而对照没
有观察到。细菌侵入烟草和玉米根细胞后 , 没有
对烟草和玉米根细胞造成伤害 , 因为光学显微镜
和电子显微镜的观察结果表明 : 没有发现接种固
氮细菌后烟草和玉米根细胞在结构上有什么变化。
2.6 n烟草和玉米接种固氮细菌后对固氮细菌的分离
从接种固氮细菌 N1、N2 和 N3 的烟草和玉
米根中 , 可以分离到固氮细菌 , 而未接菌的材料
未分离到固氮菌。将分离到的细菌制成涂片 : 在
灭菌的载玻片上加入 10μl 无菌水 , 然后用无菌
的接种环取分离到的细菌少许 , 均匀涂在载玻片
上 , 盖上盖玻片 , 在荧光显微镜下进行观察 , 可
以观察到发绿色光的小点点。由于接种的固氮菌
携带报告基因 gfp, 在波长为 488 nm的激发光作
用下 , gfp基因表达出荧光蛋白呈绿色 , 可以在
荧光显微镜下观察发绿色光的小点点。另外 , 用
美国 BD公司 Phoenix system全自动细菌鉴定仪对
分离到细菌进行鉴定 , 结果表明分离到的菌株和
接种菌株是同一种菌株。
2 .7 固氮菌对玉米的作用
玉米接种固氮菌 1 个月后 , 对植株鲜重进行
测定 , 结果表明未接菌的对照植株单株平均鲜重
为 1 .23 g (标准误为 0 .035) , 而接种细菌 N3 的玉
米单株平均鲜重为 1 .46 g ( 标准误为 0 .027) , 提
高幅度为 18 .52% ( 对测得的数据进行 t测验 , t
= 5 .16 , 自由度 df = 58 , t 测验结果表明 : 接种
细菌 N3 的玉米单株鲜重与未接种的对照植株单
株鲜重具有极显著差异 ) ; 而接种固氮菌 N1 和
N2 的材料鲜重没有提高。由此可见细菌 N3 对玉
米生长有一定的作用。
3 讨论
3 .1 固氮菌在所感染植物中的定殖范围
通过对水稻内生固氮细菌 N1、N2 和 N3 在
烟草和玉米根中的定殖研究 , 我们发现固氮菌在
烟草和玉米的根中有分布 ( 图 1～3 ) , 在玉米中
也观察到了接种物向茎杆的移动 ( 图 2: L、M)。
从目前文献报道来看 , 研究感染植物固氮细菌的
定殖大多集中在根部 ( 安千里等 , 2001; 吕泽勋
等 , 2001a, b; 刘元等 , 2003; 迟峰等 , 2004) , 在
植物 其它 器官 中定 殖的 研究 较少 ( 迟 峰等 ,
2004) , 根据我们在接菌玉米茎中固氮菌的定殖
情况 , 推测在植物其它器官中可能细菌分布也较
少 , 或者研究根部固氮菌的存在更有意义 , 因为
提供给植株氮素营养的器官一般在根部。
3 .2 固氮菌的运动
在玉米根细胞和茎细胞中 , 都观察到了固氮
菌。玉米根细胞中固氮菌分布较多 , 而玉米茎中
细菌分布较少。因为我们接菌是在玉米根部 , 却
在玉米茎中也发现了细菌 , 我们推测这些细菌能
够从根部向上移动。这和前人观察的结果相一致
(Hannan等 , 2004; 迟峰等 , 2004 )。
3 .3 固氮菌的生理生化特性
通过对固氮菌的一些生理生化特性的了解 ,
可以推测固氮菌侵入植物后会对植物细胞带来什
么样的影响以及固氮菌能否更好适应植物细胞的
环境 , 与植物更好地合作进行生物联合固氮作
用。例如 , 明胶化试验可以检验固氮菌是否具有
明胶酶 , 明胶酶是有些微生物分泌的一种蛋白
酶 , 它能催化蛋白质分解 , 能分泌明胶酶的固氮
菌进入植物细胞后 , 如果将植物细胞中的蛋白质
分解 , 对植物细胞的正常生理活动造成不良影
响 ; 靛基质试验可以检验固氮菌是否具有将色氨
酸分解为吲哚的能力 , 靛基质试验阳性的固氮菌
可以将植物细胞中的色氨酸分解为吲哚 , 对植物
细胞的蛋白质有效合成极为不利 ; 本文对固氮菌
进行了糖发酵试验 , 结果显示有的固氮菌利用糖
类单一 , 只能利用蔗糖作为碳源 , 有的固氮菌能
利用多种糖类 , 如果固氮菌侵入某种植物的细胞
中缺乏蔗糖 , 那么对于只能利用蔗糖的固氮菌在
植物细胞中生存下来都比较困难 , 更不要说固氮
了; 对固氮菌进行淀粉水解试验可以知道固氮菌
是否具有将淀粉分解为麦芽糖的能力。如果反应
为阳性 , 该固氮菌可以将植物细胞中储存的淀粉
分解 , 固氮菌可以吸收分解产物麦芽糖并有效地
利用它 ; 从固氮菌是否具有触酶活性可以判断出
固氮菌是否具有将周围环境中的有毒物质过氧化
氢除去的能力 , 固氮菌侵入植物细胞中 , 植物细
胞代谢中也可能产生过氧化氢 , 如果固氮菌触酶
活性为阴性 , 固氮菌在植物细胞中很可能受到过
氧化氢的伤害 , 不利于其生存; 固氮菌的抗盐能
力可以推测固氮菌对植物细胞中高盐浓度环境的
9122 期 王逸群和钟秀容 : 水稻内生固氮细菌的生化特性及其对烟草和玉米的侵染
适应情况 , 如果植物是在盐碱地生长 , 植物细胞
中盐浓度可能会高些 , 固氮菌能否在植物细胞这
种逆境下生存并发挥作用 , 取决于它的抗盐能力。
因此了解固氮菌的一些生理生化特性 , 对于判断
固氮菌侵入植物细胞后的生存状况以及是否能更
好地发挥联合固氮作用 , 提供了一些试验依据。
致谢 中国科学院植物研究所荆玉祥研究员提供了无私
的帮助。
〔参 考 文 献〕
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