全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (9): 935~942 935
收稿 2013-05-17　　修定 2013-07-03
资助 国家重点基础研究发展计划(2012CB113900)、国家自然科
学基金(31000908)、重庆市自然科学基金(2011BA1002)、
中央高校基本科研业务费专项(XDJK2012B020)和国家大
学生创新项目(201210635045)。
* 共同通讯作者(E-mail: swutql@163.com, Tel: 023-68250227;
E-mail: swausongm@163.com, Tel: 023-68251093)。
甘蓝抽薹开花抑制因子FLC与SVP体外表达及相互作用
杨朴丽, 张丹华, 刘智宇, 许俊强, 王志敏, 汤青林*, 宋明*
西南大学园艺园林学院, 南方山地园艺学教育部重点实验室, 重庆市蔬菜学重点实验室, 重庆400715
摘要: 甘蓝抽薹开花抑制因子FLC与SVP可能存在相互作用, 从而调节开花时间。为进一步的验证该相互作用, 以甘蓝‘ZQ’
为材料, 扩增了594 bp的FLC cDNA和726 bp的SVP cDNA序列, 它们分别编码197和241个氨基酸, 且均属MIKC型蛋白。
NCBI比对发现FLC与BoFLC3同源性高达98%, SVP与BoSVP-a同源性高达99%。将甘蓝FLC和SVP分别与原核表达载体
pET43.1a融合, 构建重组质粒pET43.1a-FLC、pET43.1a-SVP, 并转化宿主菌大肠杆菌BL21, 均能够在体外表达目的蛋白。
利用免疫共沉淀的原理及pET43.1a-FLC、pET43.1a-SVP融合蛋白序列中的6×His标签能与Ni+结合的特点, 结合SDS-
PAGE, 检测到体外表达蛋白FLC与SVP能相互作用并形成复合体, 这为深入研究FLC与SVP互作机理及探讨其与抽薹开花
因子的相互作用提供了理论依据和技术基础。
关键词: 甘蓝; FLC; SVP; 体外表达; 蛋白质相互作用
In vitro Expression and on the Interactions between FLC and SVP from
Repressors of Bolting in Brassica oleracea L.
YANG Pu-Li, ZHANG Dan-Hua, LIU Zhi-Yu, XU Jun-Qiang, WANG Zhi-Min, TANG Qing-Lin∗, SONG Ming∗
Chongqing Key Laboratory of Olericulture, Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions, Ministry
of Education, College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 400715, China
Abstract: There exists a possible interaction regulating flowering time of bolting repression factors between
FLC and SVP in Brassica oleracea L. To prove the interactive mechanism between FLC and SVP furtherly, the
protein interaction in vitro was testified in B. oleracea (Cabbage) ‘ZQ’. In this study, we gained the cDNA
sequences of FLC with 594 bp and SVP with 726 bp, and encode 197 and 241 amino acid residues, respectively,
and both are MIKC-type protein. NCBI blast draws that the homology of FLC with BoFLC3 up to 98%, and
SVP with BoSVP-a up to 99%. The FLC and SVP genes of B. oleracea were inserted into the expression vector
pET43.1a, constructed the recombinant plasmids pET43.1a-FLC and pET43.1a-SVP, respectively, then
transformated into E. coli (BL21), and both expressed target protein in vitro. With co-immunoprecipitation and
characteristic of 6×His tag in fusion protein of pET43.1a-FLC and pET43.1a-SVP which could combine with
Ni+, we detected that the two fusion proteins can form a complex with each other via SDS-PAGE. This research
could provide theoretical and technical bases for analyzing the mechanism of protein interactions between FLC
and SVP in vitro, and for probing the interactions among bolting repression factors furtherly.
Key words: Brassica oleracea L.; FLC; SVP; in vitro expression; protein interaction
甘蓝(Brassica oleracea L.)是重要的十字花科
(Cruciferae)芸薹属蔬菜作物, 属于典型的绿体春化
类型。在生产上, 如果播种时期不适宜或者外界
环境的刺激, 会造成“先期抽薹”从而影响营养器官
的产量; 在育种上, 为了缩短育种周期, 加快育种
进程, 又需要提早抽薹开花。因此, 研究甘蓝抽薹
开花的调控机制, 对甘蓝生产栽培和品种选育都
具有非常重要的意义。
甘蓝抽薹开花受到春化途径、光周期途径、
赤霉素途径和自主途径等多条路径调控(Lee等
2000)。FLOwERing LOCUS C (FLC)和SHOTR
VEgE-TATiVE PHASE (SVP)是甘蓝和芥菜(Brassica
juncea)等十字花科作物抽薹开花调控网络中的两
个关键基因(宋明等2012; 汤青林等2011, 2012a)。
FLC基因在FRi (FRigiDA)自主途径和春化途径中
植物生理学报936
起关键作用。FRI和FLC为共生关系, FRi和FLC的
过量表达 , 会使得植物的开花时间严重推迟
(Michaels和Amasinor 2001; Sheldon等2006)。洪薇
和曹家树(2002)发现拟南芥(Arabidopsis thaliana)
中FLC的表达水平与低温处理的时间呈数量关系,
低温处理时间越长, FLC的表达越弱。而SVP基因
通过自主途径、赤霉素途径和温敏途径响应开花
信号, 进而调控植物开花(Lee等2007; Li等2008)。
Hartmann等(2000)通过转座子标签从拟南芥中克
隆到SVP基因, 并证实了SVP不但与开花的早晚相
关, 而且与其剂量也相关。
FLC和SVP基因编码的蛋白均具有典型MIKC
结构域。即MADS域、介于中间位置的I结构域、
类角蛋白(K)结构域和羧基端(C)结构域 , 其中
MADS域和K域保守性较强。K域的作用最为重
要, 其介导形成二聚体。预测K域由3个两性分子
(亲水脂性)的a螺旋K1、K2和K3组成(Martinez-
Castilla和Alvarez-Buylla 2003)。它们主要在植物
茎尖和根尖分生组织等活跃区域表达, 调节开花
信号整合途径(Wigge等2005), FLC与SVP两个基因
表达的蛋白可以直接结合在开花途径整合子SOC1
和FT的启动子上, 从而调节SOC1和FT的转录, 抑
制其表达并延迟抽薹开花(Searle等2006; Hepworth
等2002; Helliwell等2006)。这一抑制作用很可能
与FLC和SVP蛋白间的相互作用密切相关(Alex-
andre和Hennig 2008; Michaels 2008)。
在拟南芥中, 通过GST融合技术和免疫沉淀
法已经分别证实了FLC与SVP在体内和体外均存
在相互作用, 形成一个开花阻遏复合物(Li等2008;
Fujiwara等2008; Jung和Muller 2009), 并推测这一
相互作用很可能也存在于其他十字花科作物中,
从而调控成花枢纽基因(FT和SOC1)的表达。在十
字花科芥菜作物上, 利用pET原核表达系统, 蛋白
体外表达以及SDS-PAGE, 检测到芥菜SVP与FLC
能相互作用, 并形成稳定的蛋白复合物(汤青林等
2011)。此外, 利用酵母真核表达系统, 也检测到芥
菜 S V P与 F L C确实存在相互作用 (汤青林等
2012a)。但在甘蓝作物中, 抽薹开花抑制基因FLC
与SVP是否也存在相互作用, 迄今为止还未见相关
报道。
为了检测甘蓝FLC与SVP之间的相互作用, 本
研究从甘蓝‘ZQ’材料中克隆了FLC和SVP基因, 并
进行体外表达和FLC-SVP蛋白复合物验证, 研究
这两个转录因子的作用机制。为进一步调节FLC-
SVP复合物的锁定或解聚, 决定开花信号整合子的
关闭(抑制抽薹开花)或开启(促进开花结实)等提供
借鉴; 为生产上避免“先期抽薹”, 育种上加快品种
选育进程等奠定基础。
材料与方法
1 试验材料
甘蓝(Brassica oleracea L.)材料‘ZQ’为重庆市
西南大学蔬菜学重点实验室提供。种子播种和植
株生长均在RXZ型智能人工气候箱中进行, 采用
20 ℃、16 h光照和18 ℃、8 h黑暗的光周期, 生长
至苗期后取茎尖于–80 ℃冻存用于RNA提取。大
肠杆菌BL21菌株及pET-43.1a原核表达载体均由本
实验室保存; pEASY-Blunt Simple Cloning Vector、
TransStart FastPfu DNA Polymerase、DNA回收纯
化试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京全式金生物
技术有限公司; UNIO-10 Trizol Total RNA Prepara-
tion Kit、BamHI、EcoRI、KpnI为上海生工生物
工程公司产品; TOYOBO MagExtractor-His-tag蛋
白纯化试剂盒购自东洋纺(上海)生物科技有限公
司。引物合成由华大基因完成, 测序送上海英骏
生物技术有限公司。
2 引物设计
根据模式植物拟南芥及油菜(Brassica napus)
FLC基因序列(NCBI登录号分别为AY850000和
AY036889)设计简并引物对1 (FF和FR)。FF: 5′-
CGCGGATCCACAGAAGCCATGGGAAGAAA-
GAAAC-3′, 5′为带保护碱基的BamHI酶切位点; FR:
5′-CGGGGTACCGTGGCTAATWAAGCAGTS-
GGAGAGT-3′, 5′为带保护碱基KpnI酶切位点。以
拟南芥和白菜SVP基因序列(NCBI登录号分别为
AF211171和AY356366)设计特异引物对2 (SF和SR)。
SF: 5′-CCGGAATTCTTCGTTGTGATGGCGAGAG-
AAAAGA-3′, 5′为带保护碱基的EcoRI酶切位点;
SR: 5′-CGGGGTACCATCTCTAACCACCATACGG-
TAAGCC-3′, 5′为带保护碱基KpnI酶切位点。
3 FLC和SVP基因的克隆
提取甘蓝茎尖总RNA, 使用TransScript First-
杨朴丽等: 甘蓝抽薹开花抑制因子FLC与SVP体外表达及相互作用 937
Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒反转录成
cDNA第1条链。并以此作为扩增模板, 采用Trans-
Start FastPfu DNA Polymerase, 分别以引物对1和2
扩增甘蓝FLC和SVP基因的编码序列。PCR扩增程
序均为94 ℃ 2 min; 94 ℃ 15 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30
s, 35个循环; 72 ℃ 5 min。PCR产物经1%琼脂糖电
泳后, OMEGA Gel Extraction试剂盒回收FLC和
SVP目的条带, 与pEASY-Blunt Simple Cloning
Vector 22 ℃连接10 min, 转化宿主菌JM109, 经菌
液PCR和酶切鉴定后挑选正确的克隆送上海英骏
生物技术有限公司测序。测序结果分别命名为
FLC和SVP。NCBI在线Blast分析甘蓝FLC和SVP
基因同源性, DNAStar软件分析同源基因的包含开
放阅读框的完整编码区并推导其氨基酸序列 ,
ClustalX2比对, MEGA4软件构建分子进化树。
4 表达质粒的构建与鉴定
提取FLC目的基因质粒, 经BamHI/KpnI双酶
切后将编码序列定向插入载体pET43.1a; SVP质粒
经EcoRI/KpnI双酶切后定向插入载体pET43.1a。
并转化大肠杆菌JM109后提取重组质粒经双酶切
鉴定和上海英骏公司测序验证。把鉴定正确的重
组表达质粒分别命名为pET43.1a-FLC和pET43.1a-
SVP并转化至宿主菌BL21。挑取单菌落, 接种于1
mL含有50 μg·mL-1氨苄青霉素的LB液体培养基中,
37 ℃振荡培养过夜。次日, 过夜培养物按1:100的
比例扩大培养 , 当OD 600在0.8~1.0时加入异丙
基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG), 按照L9(3
4)正交
设计筛选融合蛋白表达条件(表1)。
5 FLC与SVP相互作用的体外检测
以上节中确定的最佳条件培养含有pET43.1a-
SVP的BL21菌液, 并按照TOYOBO MagExtractor-
His-tag蛋白纯化试剂盒纯化体外表达的重组蛋白
产物。体外表达的蛋白pET43.1a-SVP和pET43.1a-
FLC分别作为诱饵蛋白和靶蛋白。
诱饵蛋白和靶蛋白的制备、Ni+剩余的假阳
性检测、蛋白提取液的配制参考汤青林等(2011)
的方法。为排除相互作用检测过程中可能由于Ni+
没有完全与pET43.1a-SVP结合, 使得剩余的Ni+又
与pET43.1a-FLC结合, 从而带来假阳性结果, 本试
验设置了5个Ni+梯度(10、15、20、25和30 µL
MagneHisTM Ni+磁珠), 进行Ni+剩余检测, 排除Ni+
剩余的假阳性现象。
以50 mL pET43.1a-SVP表达菌液, 细胞破碎后
4 mL去离子水重悬。取0.6 mL融合蛋白pET43.1a-
SVP重悬液, 加入10 μL Ni+为基准进行下一步试
验, 参考汤青林等(2012b)的方法检测FLC与SVP的
相互作用。以1×FastBreakTM Cell Lysis Reagent裂
解细胞, MagneHisTM Ni+磁珠吸附重组蛋白, 磁力
架回收Ni+磁珠, 并用蛋白提取液重悬。取30 μL表
达蛋白pET43.1a-FLC悬浮液与200 μL pET43.1a-
SVP上清液混匀, 4 ℃孵育2 h, 每隔15 min混匀一
次。孵育结束后用200 μL蛋白提取液洗3次, 然后
用50 μL洗脱缓冲液洗脱蛋白。将各蛋白洗脱液加
入等体积的2×样品缓冲液100 ℃煮沸5 min, 每样
取30 μL电泳检测。
实验结果
1 甘蓝FLC基因克隆与序列分析
以引物对FF/FR从甘蓝材料‘ZQ’中克隆到
FLC基因cDNA序列的完整编码区, 为594 bp, 编码
了197个氨基酸。蛋白质分子量为48.96 kDa, 理论
等电点为4.96。属于MIKC型MADS域蛋白, 其中
MADS域(M域)由第1~58位氨基酸构成, K域由第
85~163位氨基酸构成, M域与K域之间为I域, K域
之后为C域(图1)。NCBI网上比对发现: 克隆的
FLC与拟南芥和油菜的同源性分别高达87%和
97%, 表明确实获得了甘蓝FLC基因。由于克隆的
甘蓝FLC与油菜5个FLC等位基因 (BnFLC1、
BnFLC2、BnFLC3、BnFLC4和BnFLC5)同源性分
表1 IPTG诱导原核表达条件的正交设计表
Table 1 L9(3
4) orthogonal layout of IPTG induction conditions
编号 因素 温度(A)/℃
IPTG浓度(B)/ 时间(C)/h
mmol·L-1
1 A1B1C1 22 0.1 1
2 A1B2C2 22 0.5 2
3 A1B3C3 22 1.0 4
4 A2B1C3 25 0.1 4
5 A2B2C1 25 0.5 1
6 A2B3C2 25 1.0 2
7 A3B1C2 30 0.1 2
8 A3B2C3 30 0.5 4
9 A3B3C1 30 1.0 1
植物生理学报938
别为87%、91%、97%、89%和88%, 其中与
BnFLC3同源性最高 , 且与甘蓝cap i ta ta变种
(Brassica oleracea var. capitata) BoFLC3和BoFLC4
的同源性分别为98%和88%。由此推测本试验克
隆到了甘蓝FLC3。为进一步研究FLC蛋白的进化
关系, 从NCBI数据库中搜索其他植物FLC的氨基
酸序列, 经ClustalX2比对, 以MEGA4软件构建FLC
蛋白分子进化树 (图2 )分析表明 : 甘蓝FLC与
BnFLC3、BrFLC3、BoFLC3和BjFLC-like在同一
分支上, 亲缘关系最近。
2 甘蓝SVP基因克隆与序列分析
以引物对SF和SR从甘蓝材料‘ZQ’中克隆到
了726 bp的SVP cDNA片段, 含完整的开放阅读框,
共编码241个氨基酸。蛋白质分子量为58.29 kDa,
理论等电点为4.96, 也编码MIKC域蛋白。MADS
域(M域)由第1~59位氨基酸组成; K域由第94~170
位氨基酸组成; I域位于M域与K域之间, 由36个氨
基酸组成; C域由K域之后的71个氨基酸组成(图
3)。NCBI比对发现: 克隆的SVP与拟南芥、葡萄
的同源性分别为88%、78%, 与甘蓝SVP-a同源性
最高达99%, 表明本实验确实克隆到了甘蓝SVP基
因。为进一步研究SVP蛋白的进化关系, 从NCBI
数据库中搜索其他植物SVP的氨基酸序列 , 经
ClustalX2比对, 以MEGA4软件构建SVP蛋白分
子进化树 (图 4 )表明 : 甘蓝 S V P与B r S V P、
BjSVP、BnSVP、BnSVP-4、BjSVP-1在同一分
图1 FLC核苷酸序列编码及结构域
Fig.1 Deduced amino acids and protein domains of FLC
核苷酸序列上方为对应的氨基酸; M、K结构域分别用相应方框表示。图3同。
图2 FLC蛋白分子进化树
Fig.2 phylogenetic tree of FLC
Th、Ew、At、Ci、Bn、Br、Bj、Bo、Rs分别为盐芥(Thell-
ungiella halophila)、山葵(Eutrema wasabi)、拟南芥(Arabidopsis
thaliana)、菊苣(Cichorium intybus)、油菜(Brassica napus)、白菜
(Brassica rapa)、芥菜(Brassica juncea)、甘蓝(Brassica oleracea)、
萝卜(Raphanus sativus)的缩写。
杨朴丽等: 甘蓝抽薹开花抑制因子FLC与SVP体外表达及相互作用 939
支上亲缘关系最近, 同时也显示出SVP在芸薹属
中高度保守。
3 表达质粒的构建与鉴定
将甘蓝FLC和SVP分别插入原核表达载体pET-
43.1a, 获得重组质粒pET43.1a-FLC和pET43.1a-
SVP。pET43.1a-FLC经BamHI/KpnI双酶切可得到
600 bp左右的目的条带(图5); pET43.1a-SVP经
EcoRI/KpnI双酶切可得到750 bp左右条带(图6)。
将上述表达质粒送上海英骏有限公司双向测序, 结
果表明FLC和SVP插入pET43.1a载体的位点和方
向完全正确, 因此可用于后续的体外蛋白诱导和
相互作用研究。
4 FLC和SVP重组蛋白的原核表达
表达产物经SDS-PAGE检测, 结果显示有重组
蛋白pET43.1a-FLC (图7-A)和pET43.1a-SVP (图
7-B)表达的特异条带出现, 其蛋白质相对分子量与
预期值相符, 而空载体pET43.1a或者未诱导的重
组子菌液均不见此条带。由此证明原核表达质粒
图3 SVP核苷酸序列编码及结构域
Fig.3 Deduced amino acids and protein domains of SVP
图4 SVP蛋白分子进化树
Fig.4 phylogenetic tree of SVP
At、Vv、Bn、Br、Bj、Bo分别为拟南芥(Arabidopsis thaliana)、葡萄(Vitis vinifera)、油菜(Brassica napus)、白菜(Brassica rapa)、芥
菜(Brassica juncea)、甘蓝(Brassica oleracea)的缩写。
植物生理学报940
pET43.1a-FLC和pET43.1a-SVP均构建正确, 且融
合蛋白在大肠杆菌中表达成功。另外, 各泳道之
间重组蛋白的表达量差异较大, 说明IPTG浓度
(mmol·L-1)和诱导温度对该蛋白表达量有影响。体
外诱导蛋白pET43.1a-FLC (图7-A中泳道4标注“F”
之处)和pET43.1a-SVP (图7-B中泳道4标注“S”之
处)均以0.1 mmol·L-1 IPTG在25 ℃诱导4 h时表达量
最高。采用TOYOBO MagExtractor-His-tag蛋白纯
化试剂盒分别对体外表达的融合蛋白pET43.1a-FLC
和pET43.1a-SVP进行纯化, 均可得到目标条带。
5 FLC和SVP相互作用的体外检测
参考汤青林等(2011)的方法进行Ni+剩余的假
阳性检测(图8-A), 加入10 μL MagneHisTM Ni+磁珠
时未见pET43.1a-FLC融合蛋白条带, 说明Ni+完全
与pET43.1a-SVP结合, 而加入15、20、25和30 μL
MagneHisTM Ni+磁珠时就会同时出现pET43.1a-
SVP和pET43.1a-FLC融合蛋白条带, 说明过量的
Ni+与pET43.1a-FLC结合。因此加入10 μL Ni+到该
体系中不会出现Ni+剩余的假阳性现象。
以50 mL pET43.1a-SVP表达菌液, 细胞破碎后
图5 pET43.1a-FLC酶切电泳图
Fig.5 Electrophoresis profiles of pET43.1a-FLC digested by
restriction enzymes
M1: DL2000 DNA marker; 1: BamHI/KpnI双酶切; 2: BamHI单
酶切; 3: KpnI单酶切; 4: pET43.1a-FLC质粒对照; M2: Trans2K plus
II DNA marker。
图6 pET43.1a-SVP酶切电泳图
Fig.6 Electrophoresis profiles of pET43.1a-SVP digested by
restriction enzymes
M: Trans2K plus II DNA marker; 1: EcoRI/KpnI双酶切; 2:
EcoRI单酶切; 3: KpnI单酶切; 4: pET43.1a-SVP质粒对照。
图7 pET43.1a-FLC (A)和pET43.1a-SVP (B)不同诱导条件的SDS-PAGE电泳图谱
Fig.7 SDS-PAGE patterns of fusion protein pET43.1a-FLC (A) and pET43.1a-SVP (B) expression under differrent conditions
M: 蛋白分子量标准; 0: 空载体诱导对照; 1~9: 不同IPTG诱导条件对应表1中1~9编号(泳道中F、S之处分别表示pET43.1a-FLC和
pET43.1-SVP); 10: 未诱导对照。
杨朴丽等: 甘蓝抽薹开花抑制因子FLC与SVP体外表达及相互作用 941
4 mL去离子水重悬。取0.6 mL融合蛋白pET43.1a-
SVP重悬液, 加入10 μL Ni+为基准进行下一步试
验。将纯化的pET43.1a-FLC (图8-B, 泳道3)、
pET43.1a-SVP (图8-B, 泳道4), 以及这两者4 ℃共
孵育2 h的产物一起电泳。共孵育产物经SDS-
PAGE后, 既有pET43.1a-SVP融合蛋白条带, 也有
pET43.1a-FLC融合蛋白条带(图8-B, 泳道1和2), 说
明FLC与SVP结合在一起并随Ni+磁珠一起沉淀下
来, 形成了蛋白复合物, 由此证实了甘蓝SVP与FLC
两者间的相互作用。
讨　　论
FLC在茎尖分生组织表达时会抑制开花, FLC
主要促进子是FRi , FRi能维持FLC高水平表达
(Michaels和Amasino 1999)。本研究克隆的甘蓝
FLC为594 bp, 经NCBI同源性比对为FLC3, 编码
1 9 7个氨基酸 , 为典型的M I K C型蛋白。其中
MADS、I、K和C域分别为58、26、79、34个氨基
酸。SVP基因在成花转变前的营养组织中表达, 对
抽薹开花也有抑制作用(Hartmann等2000)。本试
验克隆的甘蓝SVP为726 bp, 编码241个氨基酸, 其
MADS、I、K和C域分别为51、42、97、71个氨
基酸。甘蓝FLC和SVP蛋白尽管相差44个氨基酸,
图8 SDS-PAGE显示pET43.1a-FLC与pET43.1a-SVP的Ni+剩余(A)和相互作用(B)
Fig.8 SDS-PAGE showing rest of Ni+ and interaction of pET43.1a-FLC and pET43.1a-SVP
A: 1~5表示MagneHisTM Ni+-磁珠加入量分别为10、15、20、25和30 µL。B: 1、2, pET43.1a-FLC与pET43.1a-SVP孵育产物; 3, 纯化的
pET43.1a-FLC; 4, 纯化的pET43.1a-SVP。M: 蛋白质分子量标记。
但是它们的MADS域高度保守; 它们的K域氨基酸
相差较大, 但是均分别由3个a螺旋组成, 每个a螺
旋构成1个亚域。FLC和SVP均属于抑制开花的
MADS盒转录调节蛋白(Martinez-Castilla和Alvarez-
Buylla 2003)。尽管FLC和SVP单独突变都会显著
提早开花, 但单独对FLC或SVP功能的研究, 很可
能不能从真正意义上诠释其在抽薹开花调控中的
生命本质。因为植物抽薹开花调控相关的蛋白质
往往并不是独立在细胞内行使功能, 通常与其他
蛋白质相互作用形成复合体, 在特定的时间和空
间内参与重要的生理活动, 完成特定的功能(陈谋
通和刘建军2009; 王海波等2006)。因此, 研究FLC
与SVP的蛋白互作机制, 很可能成为植物开花调控
网络的突破口(黄泽明和倪兵2010)。
本试验将甘蓝体外原核表达蛋白pET43.1a-
FLC作为靶蛋白, 与诱饵蛋白pET43.1a-SVP相互作
用。巧妙利用融合蛋白序列中6×His标签能与Ni+
结合的特性, 将诱饵蛋白与靶蛋白4 ℃孵育后, 利
用pET43.1a-SVP上结合的Ni+与磁力架吸附性纯化
出诱饵蛋白与靶蛋白的异源复合体 , 并经SDS-
PAGE变性凝胶电泳检测到了两条清晰纯合的目
标蛋白, 试验设置了2次重复均可得到相同的结果
(图8-B, 泳道1、2), 由此证明甘蓝FLC与SVP蛋白
植物生理学报942
存在相互作用。
在拟南芥中, SVP功能缺失显著抑制FLC高表
达的FRi FLC植株的晚花型, SVP突变在很大程度
上抑制了FLC的晚花表型,而FLC功能缺失可以适
度恢复35S::SVP的晚花型, 这些结果表明FLC和
SVP功能是相互依存的, 并且前者更多依赖于后者
(Michaels和Amasino 1999)。利用GST融合技术、
酵母双杂交技术和免疫共沉淀法证实了拟南芥
SVP与FLC在体内和体外均存在相互作用(Li等
2008; Jung和Muller 2009), 存在一定的依赖关系。
另外, 汤青林等(2011, 2012a)利用酵母双杂交技术
和原核表达系统也证实了FLC与SVP在芥菜中也
能形成蛋白复合物。而本试验甘蓝FLC与SVP蛋
白互作的结果与拟南芥、芥菜中的结论相似。
在本试验FLC与SVP结合产物纯化过程中经
过了3次洗涤, 仍能检测到两者的相互作用, 表明
FLC与SVP之间的相互作用并不是瞬间发生, 而应
是两者结合并形成了稳定的异源复合体。与免疫
共沉淀法鉴定蛋白质相互作用相比, 此方法不需
要制备抗体, 简化了操作, 节省时间, 避免了因抗
体特异性不强可能带来的假阳性结果。这一方法
能为蛋白质-蛋白质间相互作用的研究提供更好的
技术平台(黄泽明和倪兵2010), 对甘蓝FLC与SVP
相互作用机制的深入研究奠定了基础。
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