全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (7): 1117~1124　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0101 1117
收稿 2015-04-09　　修定 2015-05-28
资助 国家自然科学基金(31371594)、浙江省公益技术研究农业项目(2014C32015)和浙江省水稻种业科技创新团队项目(2010R50024)。
* 共同第一作者。
** 通讯作者(E-mail: yangl@zjnu.cn; Tel: 0579-82282396)。
水稻叶片中多种胁迫响应基因OsmiR1858a的预测及其表达分析
梅俊1,*, 张维林1,*, 王涛1, 王长春1, 马伯军1, 严成其2, 杨玲1,**
1浙江师范大学化学与生命科学学院, 浙江金华321004; 2浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所, 杭州310021
摘要: microRNA (miRNA)不仅参与植物生长发育的调控, 而且在多种胁迫应答过程中发挥着重要的调节作用。基于基因
芯片及蛋白质双向电泳数据, 采用生物信息学方法预测出与水稻白叶枯病抗性相关的1个miRNA, 即OsmiR1858a。对白叶
枯病抗性不同的2个水稻基因型‘8411’和‘SH5’叶片接种Zhe173病菌, 将‘SH5’幼苗分别进行不同非生物胁迫以及激素处理,
利用茎-环状引物实时荧光定量PCR技术分析了OsmiR1858a的表达情况。结果显示: 抗病基因型‘SH5’中OsmiR1858a表达
受Zhe173小种侵染先显著下调、后显著上调, 感病基因型‘8411’中的表达则变化不大; 同时分析了‘8411’和‘SH5’中Osmi-
R1858a响应菲律宾9个小种及另外4个抗病性不同基因型中OsmiR1858a响应Zhe173小种侵染的表达变化情况, 结果表明
OsmiR1858a与广谱抗病性有关。与对照组的4个处理时间点相比, 低温处理2 h显著提高‘SH5’叶中OsmiR1858a的表达, 12
h以后则显著下调; 而盐害在处理12 h内显著抑制OsmiR1858a的表达, 24 h恢复到对照水平; 干旱处理先诱导上调后抑制;
甲紫精处理后期则显著诱导OsmiR1858a的表达。OsmiR1858a的表达大多受外源水杨酸抑制; 茉莉酸处理在9 h显著诱导
OsmiR1858a的表达, 6 h和12 h则呈显著抑制作用; 萘乙酸处理6 h时也使其表达显著上调, 但12 h时显著下调。上述表达结
果表明, OsmiR1858a参与水稻对多种胁迫的响应。
关键词: 水稻; 胁迫; OsmiR1858a; 预测; 表达
Identification and Expression Analyses of OsmiR1858a in Rice Leaves under
Multiple Stresses
MEI Jun1,*, ZHANG Wei-Lin1,*, WANG Tao1, WANG Chang-Chun1, MA Bo-Jun1, YAN Chen-Qi2, YANG Ling1,**
1College of Chemistry and Life Sciences, Zhejiang Normal University, Jinhua, Zhejiang 321004, China; 2Institute of Virology and
Biotechnology, Zhejiang Academy of Agricultural Science, Hangzhou 310021, China
Abstract: microRNAs (miRNAs) play important roles not only in the regulation of plant growth and develop-
ment, but also in the response to various stresses. Based on gene microarray and proteomic data, a bacterial
blight (BB) responsive miRNA, OsmiR1858a, was predicted by bioinformatics method. The BB-resistant and
-susceptible genotypes ‘SH5’ and ‘8411’ were inoculated with strain Zhe173, and the seedlings of ‘SH5’ were
treated with various abiotic stress and plant hormones. The expression of OsmiR1858a in rice leaves was then
analyzed by stem–loop real-time PCR. The level of OsmiR1858a was significantly downregulated first and then
upregulated in BB-resistant genotype ‘SH5’ upon Zhe173 attack, whereas it had no obvious change in BB-sus-
ceptible genotype ‘8411’. The expression of OsmiR1858a in ‘SH5’ and ‘8411’ in response to nine Philippines
strains, and those in four other genotypes in response to Zhe173, were also analyzed. The results showed that
OsmiR1858a was involved in wide spectrum resistance to BB. OsmiR1858a was significantly increased at 2 h
and then significantly decreased after 12 h under cold stress, while it significantly decreased within 12 h and
then recovered at 24 h under NaCl treatment. The expression of OsmiR1858a was upregulated only at 6 h of
drought stress, while it was upregulated after 9 h of methyl viologen treatment. Exogenous salicylic acid could
inhibit significantly the expression of OsmiR1858a at three time points in ‘SH5’ leaves. The level of Osmi-
R1858a was significantly increased only at 9 h after jasmonic acid treatment, whereas it was significantly
decreased at 6 h and 12 h. OsmiR1858a was significantly upregulated at 6 h, but downregulated at 12 h upon
1-naphthaleneacetic acid treatment. Together, the results indicated that OsmiR1858a might have a role in the
response to multiple stresses.
Key words: Oryza sativa; stress; OsmiR1858a; identification; expression
植物生理学报1118
植物在长期的进化过程中形成了多种应对胁
迫的机制, 其中转录后基因水平的表达调控以维
持细胞内稳态发挥着至关重要的作用(Bartel 2004;
Sunkar等2012)。microRNA (miRNA)是一类长度
约为21个核苷酸的内源非编码单链小分子RNA
(Bartel 2004)。不同胁迫能够诱导或抑制植物相应
miRNA表达, 它们与靶基因(大多为转录因子)的
mRNA进行完全或近乎完全的配对, 直接切割或者
抑制翻译, 使得靶基因降解或者积累(Sunkar等
2012), 实现对下游胁迫应答相关基因表达的负调
控, 从而引起植物信号转导与生化代谢的变化, 最
终增强了植物对胁迫的适应能力(Bartel 2004;
Zhang等2006)。miR398是第一个被报道的受多种
胁迫调控的miRNA, 它通过负调控2个靶基因Cu/
Zn过氧化物歧化酶(Cu/Zn-superoxide dismutase,
CSD)——细胞质CSD1和叶绿体CSD2的表达, 在
调节铜代谢平衡, 应答重金属、蔗糖、臭氧、盐
害等非生物胁迫中扮演重要角色, 并且参与应答
生物胁迫(Sunkar和Zhu 2004; Sunkar等2006,
2012)。细菌鞭毛素(flagellin)是一类可以诱导寄主
植物细胞发生防卫反应的病原物相关分子模式因
子, 其活性位点是被称为flg22的N-末端保守的22
个氨基酸多肽。鞭毛蛋白flg22能提高拟南芥对丁
香假单胞菌的抗性 , 因为来源于flg22的多肽能
诱导产生1个对生长素受体(TIR1、TIR2和TIR3)
F -box蛋白mRNAs进行负调控的miRNA, 即
miR393, 抑制生长素信号, 从而阻止病菌的生长。
组成型超表达TIR1的另外一个同源基因AFB1 (非
miR393的靶基因), 导致拟南芥对外来病菌超敏感;
而超表达miR393能使植株显著抑制外来菌的生长
(Navarro等2006)。植物miRNAs在各种抗逆中具
有不可替代的作用(Lv等2010; Sunkar等2012; Xia
等2012), 但是迄今对其作用机制的了解还很有限,
而研究胁迫相关miRNA对靶基因调控的机理, 首
先需要寻找与胁迫相关的miRNAs。近年来通过
构建miRNA文库、miRNA基因芯片、降解组测序
等技术, 发现众多响应胁迫的miRNAs (Lv等2010;
Sunkar和Zhu 2004; Zhang等2006; Zhu等2008)。由
于通过实验手段只能克隆到高丰度的miRNA, 而
且费时、费力、费用高(Zhang等2006), 于是便有
学者开发了多种基于机器学习的计算方法用于预
测相关miRNAs, 其中支持向量机(support vector
machine, SVM)是目前使用最多的方法(Zhou等
2007)。
水稻是世界上重要的粮食作物之一, 生物和
非生物胁迫, 如白叶枯病、冷害、高盐、干旱等
严重影响了水稻的产量和品质。疣粒野生稻(Oryza
meyeriana)蕴含对白叶枯病免疫、高抗细菌性条
斑病、抗稻飞虱、旱生和耐荫等优良的基因资源
(钱韦等2001), 但因其在稻属中隶属于GG基因组,
与AA基因组中的栽培稻亲缘关系极远, 以至于很
难克服二者之间有性杂交不亲和的障碍。本课题
组利用不对称体细胞杂交技术, 将疣粒野生稻的
抗性基因导入栽培稻‘8411’中, 回交后自交, 获得
了性状稳定的高抗新种质(黄佳男等2008; Yu等
2008)。
miRNA的检测方法有多种, 最经典的方法是
Northern blot, 但其需要较高的实验条件, 并且操作
繁琐、技术难度大、耗时长。其他诸如miRNA芯
片技术、miRNA原位杂交等基于基因杂交的方法
仅能半定量, 而茎-环状引物实时荧光定量PCR方
法具有快速、灵敏和准确的特点(Zhou等2007)。
茎-环状引物实时荧光定量PCR定量分析分为两
步, 即茎-环结构逆转录引物的逆转录反应和实时
荧光定量PCR, 因茎-环结构的逆转录引物在逆转
录后增加了cDNA的长度, 克服了miRNA长度短小
而难于检测的障碍(Chen等2005; Varkonyi-Gasic等
2007)。
本文基于本实验室已有的全基因组芯片和蛋
白组分析数据, 采用生物信息学方法预测出受白
叶枯病菌Zhe173诱导显著上调的OsmiR1858a, 并
采用茎-环状引物实时荧光定量PCR技术分析了抗
性不同水稻基因型的OsmiR1858a响应不同白叶枯
病菌小种以及抗病基因型OsmiR1858a响应冷害、
高盐、干旱、氧化胁迫以及激素水杨酸(salicylic
acid, SA)、茉莉酸(jasmonic acid, JA)、萘乙酸
(1-naphthaleneacetic acid, NAA)处理的表达变化,
以期为研究其在水稻抗性中的功能奠定基础。
材料与方法
1 材料
白叶枯病感病水稻(Oryza sativa L.) ‘8411’、
梅俊等: 水稻叶片中多种胁迫响应基因OsmiR1858a的预测及其表达分析 1119
抗病水稻‘SH5’, 其中‘SH5’是通过不对称体细胞杂
交技术, 将疣粒野生稻(Oryza meyeriana Baill.)的
抗性基因导入‘8411’, 并以‘8411’为轮回亲本, 回交
后自交8代得到的稳定且抗性高的新种质(黄佳男
等2008)。携带单拷贝的抗白叶枯病基因Xa21的转
基因株系D62B-Xa21及其野生型籼稻‘D62B’种子
由中科院遗传与发育生物学研究所翟文学研究员
惠赠。高度感病基因型粳稻‘日本晴’和抗病基因
型粳稻‘秀水09’。
白叶枯病菌为我国长江流域的中国IV型代
表菌株Zhe173和菲律宾小种P2 (PXO86)、P3
(PXO79)、P4 (PXO71)、P5 (PXO112)、P6
(PXO99)、P7 (PXO145)、P8 (PXO280)、P9
(PXO339)和P10 (PXO124)。
2 方法
2.1 材料培养
选取颗粒饱满的水稻种子, 浸泡在含3%过氧
化氢溶液中12 h, 无菌水冲洗5遍, 37 ℃培养箱中催
芽3 d。挑选发芽基本一致的种子转至沙钵中, 并
置于28 ℃、相对湿度70%、光照时间16 h·d-1的人
工气候室中培养。待幼苗长至二叶期时, 选取长
势良好的幼苗移至含有水稻完全培养液的PVC槽
中水培至五叶期, 进行如下处理。
2.2 胁迫及激素处理
接白叶枯病菌: 菌株活化后, 采用人工剪叶法
对展开叶片接种, 分别于模拟接种0 d及接菌后1、
2、3、5 d取样(黄佳男等2008)。
对‘SH5’幼苗进行非生物胁迫处理: 低温处理
组幼苗于4 ℃培养箱中培养, 对照组于28 ℃培养
箱中培养; 盐害处理组幼苗移至含有100 mmol·L-1
NaCl的营养液中, 干旱处理组移至含有20% PEG-
6000的营养液中 , 对照组均在正常营养液中水
培。上述3种处理均于处理后2、6、12、24 h取
样。氧化胁迫处理组叶片喷施100 mL 100 µmol·L-1
的甲基紫精(methyl viologen, MV; 溶于0.02%吐
温-20中), 对照组喷施100 mL 0.02%吐温-20, 于喷
施后2、6、9、12 h取样。
激素处理‘SH5’幼苗: 用0.02%吐温-20配制2
mmol·L-1 SA、100 µmol·L-1 JA、100 µmol·L-1
NAA各100 mL, 均匀喷施于幼苗叶片上, 对照组喷施
100 mL 0.02%吐温-20, 于喷施后2、6、9、12 h取样。
2.3 生物信息学预测白叶枯病抗性相关miRNAs
取抗病基因型模拟接种水及接种白叶枯病菌
Zhe173后24 h的叶片, TRIzol法提取叶片总RNA,
使用Affymetrix GeneChip Rice Genome Array基因
表达谱芯片杂交与分析(上海生物芯片有限公司),
获得下调1.5倍基因, 用miRU (http://plantgrn.noble.
org/psRNATarget / )在线预测其中哪些基因是
miRNA的靶基因, 若1个miRNA存在多个靶基因,
就认为可能是由于miRNA的存在导致这几个靶基
因共同下调, 此miRNA可能为候选miRNA; 从芯片
结果获得上调5倍的基因, 在Orisis数据库(http://
www.bioinformatics2.wsu.edu/cgi-bin/Osiris/)获取
基因启动子上游1 kb序列, 利用软件BioProspector
(Liu等2001)、CONSENSUS、MDscan (Liu等
2002)和MotifSampler (Thijs等2002)分析启动子序
列, 从中搜索6~10 bp长度的高频基序, 利用Bioop-
timizer (http://www.people.fas.harvard.edu/~junliu/
BioOptimizer/)对不同软件搜索出的基序进行处理
(Jensen和Liu 2004), 提高预测准确性。使用工具
STAMP (http://www.benoslab.pitt.edu/stamp/)将优
化过的基序与植物转录因子数据库(http://www.
dna.affrc.go.jp/PLACE/)比对, 获得基序的注释。以
高频基序为特征向量 , 利用SVM构建基因上调
表达模型(Zhou等2007); 并用此模型分析候选
miRNA基因的1 kb启动子序列[从植物miRNA数据
库PMRD (http://bioinformatics.cau.edu.cn/PMRD/)
下载获得], 符合上调表达的便为预测的抗病相关
miRNAs (Zhou等2007)。蛋白组学实验及结果参
考前文(Yu等2008), 通过NCBI获得下调蛋白的
cDNA序列, 重复上述步骤, 预测抗病相关miR-
NAs。
2.4 茎-环状引物RT-PCR法分析OsmiR1858a的
表达
利用软件Primer Premier 6设计snRNA U6 (登
录号为AC120885)、OsmiR1858a的特异性反转
录引物序列分别为5′-GTGCAGGGTCCGAG-
GTTTTGGACCATTTCTCGAT-3′、5′-GTCG-
TATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACT-
GGATACGACGCCCCA-3′, 逆转录合成各自的特
异性cDNA第一链(Varkonyi-Gasic等2007), 然后以
U6作为内参, 进行实时荧光定量PCR反应(Applied
植物生理学报1120
Biosystem StepOnePlus, Foster, CA, USA) (Zhang等
2015)。OsmiR1858a定量上游引物为5′-GCTCTG-
GAGAGGAGGACGGAG-3′, U6定量上游引物为
5′-GGAACGATACAGAGAAGATTAGCA-3′; 通用
引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′作为共同的定
量下游引物(Chen等2005)。实时荧光定量PCR体
系20 μL含有2 μL一链cDNA模板、0.4 μL 50×ROX
reference dye、10 μL SYBR qPCR Mix (Toyobo,
Osaka, Japan)及5 μmol·L-1的上游特异引物和下游
通用引物。反应条件: 95 ℃ 1 min; 95 ℃ 5 s, 60 ℃
30 s, 40个循环。实验进行2次生物重复, 每个样品
3次技术重复, 所得数据使用SPSS 19.0软件进行显
著性分析。
实验结果
1 白叶枯病抗性相关OsmiR1858a的预测
基因芯片中637个基因下调, 与之配对的有
131个miRNAs, 但其中仅有10个miRNAs至少有2
个靶基因; 在66个上调基因启动子序列中搜索到
31个高频基序, 利用SVM构建了上调基因表达模
型(图1), 反过来用此模型分析基因芯片中上调基
因, 并随机挑选66个无应答基因对模型进行检验,
确定模型符合要求。利用模型分析基于基因芯片
数据预测的10个候选miRNAs启动子序列, 只有
OsmiR1858a、OsmiR1861k和OsmiR812h的启动子
符合该上调模型。
在蛋白质双向电泳鉴定出的差异表达蛋白中,
仅有18个蛋白点下调。利用miRU分析发现有14个
miRNAs存在下调靶蛋白, 随后用图1的上调基因
表达模型分析, 发现只有3个miRNA——Osmi-
R167a*、OsmiR1858a和OsmiR398a符合该模型。
无论是基于基因芯片数据还是蛋白组学结果,
都预测出OsmiR1858a与水稻白叶枯病抗性相关。
使用在线软件PlantCARE分析pre-OsmiR1858a上
游2 kb启动子序列, 发现含有丰富的MYB (TGA-
CY, Y=C/T)、W-box (CTGACY, Y=C/T)、GT-1
binding site (GRWAAW, R=A/G, W=A/T)、GCC-
box (GCCGCC)和ASF-1 binding site (TGACG)顺式
作用元件, 这些元件被证实参与了对生物胁迫的
防御反应(Zhang等2015); 同时还有多种胁迫反
应元件 , 如干旱诱导元件MBS (TAACTG)、
DRECRTCOREAT (GTCGGC)、低温反应元件
LTRECOREATCOR15 (GTCGG)。此外, pre-Osmi-
R1858a启动子区存在激素反应元件, 如JA反应元
件CGTCA-motif、生长素反应元件ARF (GAGA-
CA)、SA反应元件ASF1MOTIFCAMV (CGTCA)
等。Zhu等(2008)在对发育的水稻籽粒进行高通量
测序时 , 首次发现由21个核苷酸组成的Osmi-
R1858a, 随后有人采用类似的技术在龙眼和甜橙
中也识别出miR1858a, 但关于其响应生物、非生
物胁迫的表达情况尚无报道, 因此本文将重点分
析水稻叶片中OsmiR1858a的表达对胁迫和外源激
素的响应。
2 感抗水稻基因型叶中OsmiR1858a响应白叶枯
病菌侵染的表达变化
2.1 2个抗病性不同的水稻基因型OsmiR1858a受
Zhe173侵染后的表达变化
如图2-A所示, 接种Zhe173后的OsmiR1858a
表达与接种前比较, 在感病基因型‘8411’中无明显
变化, 而在抗病基因型‘SH5’中则先是极显著降低,
后期极显著提高。‘SH5’中OsmiR1858a的表达量
在接种后1、2 d的显著下降可能是因为其组成型
表达较高, 并且Zhe173入侵叶片后3 d内的增殖速
度很慢(Zhang等2015), 完全可以抵御早期的病菌
侵染。2个基因型相比, ‘SH5’中OsmiR1858a的表
达量在接种后3、5 d极显著高于‘8411’的, 从而导
致接种7 d后‘SH5’中的病菌数量极显著低于‘8411’
的(Zhang等2015)。
图1 SVM构建模型图
Fig.1 Construction of SVM model
梅俊等: 水稻叶片中多种胁迫响应基因OsmiR1858a的预测及其表达分析 1121
2.2 2个水稻基因型OsmiR1858a响应不同白叶枯
病菌小种的表达差异
分析了P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9
和P10这9个菲律宾白叶枯病菌小种对2个水稻基
因型OsmiR1858a表达的影响。感病基因型‘8411’
中OsmiR1858a的相对表达水平分别被P8和P10诱
导而极显著和显著上调, 受P6和P9侵染而极显著
下调, 但不受P2、P3、P4、P5、P7小种的影响; 抗
病基因型‘SH5’中OsmiR1858a表达被P3、P4、P6
和P10等4个小种诱导极显著上调、分别受P2和P5
小种侵染而极显著、显著下调(图2-B)。结果说明:
OsmiR1858a的上调并不具有小种特异性; 抗病基
因型中的OsmiR1858a与抗性弱的基因型相比, 表
现出响应更多小种侵染而上调。
图2 OsmiR1858a响应白叶枯病菌的表达变化
Fig.2 Expression response of OsmiR1858a to bacterial blight
A: 水稻‘8411’和‘SH5’的OsmiR1858a响应Zhe173侵染, **表示2个基因型的差异在0.01水平上显著; B: ‘8411’和‘SH5’的OsmiR1858a响
应9个菲律宾小种侵染, *和**表示处理组与对照组差异分别在0.05和0.01水平上显著; C: 4个水稻基因型OsmiR1858a响应Zhe173侵染, *和**
表示与未接种差异分别在0.05和0.01水平上显著。
植物生理学报1122
2.3 抗性不同水稻基因型OsmiR1858a对Zhe173的
响应
为进一步了解OsmiR1858a是否参与对白叶枯
病的广谱抗性, 我们选择了另外4个抗性不同的水
稻基因型, 接种Zhe173后21 d病斑长度由大到小依
次为‘日本晴’ (4.0 cm±0.2 cm)、‘D62B’ (2.2 cm±0.2
cm)、D62B-Xa21 (1.4 cm±0.1 cm)、‘秀水09’ (1.3
cm±0.3 cm), 那么对Zhe173小种的抗性则是从弱到
强 , ‘日本晴’为高度敏感 , ‘D62B’为中度抗病 ,
D62B-Xa21 (1.4 cm±0.1 cm)和‘秀水09’为高抗性基
因型(Zhang等2015)。用实时定量PCR技术分析
OsmiR1858a在遭受Zhe173侵染前后的表达变化,
结果如图2-C所示, 抗性基因型OsmiR1858a的组成
型表达水平比敏感基因型的显著高。抗性不同基
因型的OsmiR1858a表达对Zhe173响应不同, 高度
敏感基因型‘日本晴’的仅在5 d显著上调 , 中抗
‘D62B’的在1 d后就极显著上调, 随后一直维持在
较高水平; D62B-Xa21因OsmiR1858a的组成型表
达很高, 在接种后先是极显著下调, 到第5天恢复
至接种前水平; ‘秀水09’的在接种后1 d就极显著上
调, 尤其以2 d和5 d的表达上升幅度最大, 使得其表
达水平与携带广谱抗病基因的转基因材料D62B-
Xa21的相当。与高度敏感基因型‘日本晴’比较, 中
抗、高抗基因型‘D62B’、D62B-Xa21和‘秀水09’
的OsmiR1858a无论是接种前的组成型表达还是在
受Zhe173侵染后的4个时间点, 均呈极显著上调。
多个水稻基因型的OsmiR1858a受多个BB小种诱
导上调, 即OsmiR1858a受BB诱导上调不具有基因
型或者小种特异性, 故推测其在调控水稻的白叶
枯病菌广谱抗性中起作用。
3 非生物胁迫下OsmiR1858a的表达变化
低温、高盐、干旱和氧化胁迫是常见的非生
物胁迫因子, 我们分析了抗病基因型‘SH5’叶片中
的OsmiR1858a在这4种胁迫下的表达情况。如图
3-A所示, 4 ℃低温胁迫下, OsmiR1858a的表达随
着处理时间的延续呈持续下降趋势; 与对照组比
较, OsmiR1858a的表达水平在2 h时极显著上升,
但在12、24 h时极显著下降。高盐胁迫下, Osmi-
R1858a的表达迅速下调, 12 h内均极显著低于对照
处理组, 直到24 h时恢复至对照组水平。模拟干旱
处理下, OsmiR1858a的表达变化呈单峰曲线; 与对
照组相比, 2 h极显著下降, 6 h时极显著上升至最大
值, 随后又极显著降低。MV是除草剂百草枯的主
要成分, 具有强氧化性, 喷施MV能够诱导叶片产
生活性氧, 造成水稻光氧化胁迫。OsmiR1858a的
表达水平在氧化胁迫早期(6 h内)与对照组无显著
差异, 于后期则大幅上升(图3-B)。
4 激素处理下OsmiR1858a的表达响应
激素在植物对逆境的适应性中发挥重要作用,
参与信号转导途径或者通过改变多种代谢来提高
植物的抗性(Navarro等2006; Sunkar等2012)。因为
pre-OsmiR1858a启动子区存在生长素、SA和JA激
素反应元件, 我们向水稻‘SH5’幼苗叶面上分别喷
施外源SA、NAA和JA, 分析它们对OsmiR1858a表
达的影响, 结果见图3-B、C: 与对照组比较, SA使
OsmiR1858a的表达水平在2、6、12 h极显著下降;
NAA和JA分别在处理后6、9 h诱导OsmiR1858a极
显著上调, 两者均在12 h使OsmiR1858a表达极显
著下降。
讨　　论
大多数miRNA参与胁迫响应的机理尚不明
确, 鉴定胁迫相关miRNA并解析其在胁迫中的作
用, 对揭示复杂的调控网络具有重要的意义。随
着研究的深入, 一般认为植物遭受胁迫时, 体内一
些miRNA的表达会上调, 进而下调作为胁迫响应
负调控因子的靶基因; 某些miRNA会下调, 使作为
胁迫响应抵抗因子的靶基因积累, 从而提高植物
对逆境的适应性(Sunkar等2012)。
胁迫可诱导植物细胞中活性氧分子快速大量
积累, 而CSD作为最主要的超氧化物歧化酶, 可清
除体内的超氧自由基, 进而缓解逆境对植物生长
的危害(Torres等2006)。因此不难理解以CSD1和
CSD2为靶基因的miR398在多种胁迫响应中扮演
重要角色, 它也是目前研究最为透彻的植物胁迫
响应miRNA。拟南芥在高铁、高铜、强光照、
MV、盐害、臭氧等非生物与病原菌的生物胁迫
下, 基因CSD1的表达始终受到miR398的调控, 二
者呈现动态的、相反的变化对应关系。CSD2的表
达变化却并不总是与CSD1的变化保持一致, 如过
量的铜或铁、强光照、MV胁迫下CSD2表达上调,
病原菌和臭氧胁迫下表达则下调(Sunkar和Zhu
梅俊等: 水稻叶片中多种胁迫响应基因OsmiR1858a的预测及其表达分析 1123
2004; Sunkar等2006, 2012), 说明CSD2的表达并不
完全受miR398的调控。具有miR398抗性的CSD突
变体中, CSD1和CSD2基因表达上调, 但CSD1和
CSD2蛋白量却下降, 暗示miR398可能抑制这2个
基因的翻译从而对靶标进行负调控(Sunkar等2012)。
Flg22可诱导拟南芥miR393的积累 , 由于
miR393特异性的靶向生长素受体TIR/AFB, 抑制
TIR/AFB转录本可下调生长素信号途径, 从而提高
了拟南芥对番茄细菌性叶斑病菌DC3000的抗性
(Navarro等2006)。Flg22还能诱导miR160a的积累,
抑制其靶基因ARF16和ARF17的表达, ARF蛋白与
生长素反应元件结合, 激活或者抑制原初生长素
反应基因的转录, 超表达miR160a能够促进胼胝质
沉积, 从而增强了基础性抗病性(Li等2010)。
本文采用茎-环状引物实时荧光定量PCR技术
全面分析了生物信息学预测出的OsmiR1858a在白
叶枯病、低温、盐害、干旱、氧化胁迫下的表达
变化, 抗病基因型中的OsmiR1858a组成型表达高
图3 抗病基因型‘SH5’的OsmiR1858a表达响应非生物胁迫和外源激素
Fig.3 Expression of OsmiR1858a in resistant genotype ‘SH5’ to abiotic stresses and exogenous hormones
*和**表示处理组与对照组间差异分别在0.05和0.01水平上显著。
植物生理学报1124
于感病基因型的, 并且能够响应更多小种侵染而
上调(图2), OsmiR1858a的上调并不具有水稻基因
型、白叶枯病菌小种特异性, 而是与广谱抗性相
关。OsmiR1858a还响应低温、干旱、氧化胁迫而
上调(图3), 暗示其在应对多种胁迫时具有融合功
能的作用(Sanan-Mishra等2009)。胁迫下植物生长
的减缓可能是由控制生长素感知和信号转导的
miRNAs所调节的(Sunkar等2012), 并且pre-Osmi-
R1858a启动子区含有生长素、SA和JA反应元件,
继续分析发现OsmiR1858a表达确实受外源生长
素、JA诱导上调, 但响应SA而下调。表明Osmi-
R1858a涉及复杂的生物和非生物胁迫调控。至于
OsmiR1858a如何负调控靶基因以应对多种胁迫的
机理, 尚有待于深入研究。
参考文献
黄佳男, 王长春, 胡海涛, 马伯军, 严成其, 杨玲(2008). 疣粒野生稻
抗白叶枯病新基因的初步鉴定. 中国水稻科学, 22: 33~37
钱韦, 谢中稳, 葛颂, 洪德元(2001). 中国疣粒野生稻的分布、濒危
现状和保护前景. 植物学报, 43: 1279~1287
Bartel DP (2004). MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism,
and function. Cell, 116: 281~297
Chen C, Ridzon DA, Broomer AJ, Zhou Z, Lee DH, Nguyen JT,
Barbisin M, Xu NL, Mahuvakar VR, Andersen MR et al (2005).
Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.
Nucleic Acids Res, 33: e179
Jensen ST, Liu JS (2004). BioOptimizer: a Bayesian scoring function
approach to motif discovery. Bioinformatics, 20 (10): 1557~1564
Li Y, Zhang Q, Zhang J, Wu L, Qi Y, Zhou JM (2010). Identifica-
tion of microRNAs involved in pathogen-associated molecular
pattern-triggered plant innate immunity. Plant Physiol, 152:
2222~2231
Liu X, Brutlag DL, Liu JS (2001). BioProspector: discovering con-
served DNA motifs in upstream regulatory regions of co-
expressed genes. Pac Symp Biocomput, 6: 127~138
Liu XS, Brutlag DL, Liu JS (2002). An algorithm for finding pro-
tein-DNA binding sites with applications to chromatin-immu-
noprecipitation microarray experiments. Nat Biotechnol, 20 (8):
835~839
Lv DK, Bai X, Li Y, Ding XD, Ge Y, Cai H, Ji W, Wu N, Zhu YM
(2010). Profiling of cold-stress-responsive miRNAs in rice by
microarrays. Gene, 459: 39~47
Navarro L, Dunoyer P, Jay F, Arnold B, Dharmasiri N, Estelle M,
Voinnet O, Jones JD (2006). A plant miRNA contributes to anti-
bacterial resistance by repressing auxin signaling. Science, 312:
436~439
Sanan-Mishra N, Kumar V, Sopory SK, Mukherjee SK (2009). Clon-
ing and validation of novel miRNA from basmati rice indicates
cross talk between abiotic and biotic stresses. Mol Genet
Genomics, 282: 463~474
Sunkar R, Kapoor A, Zhu JK (2006). Posttranscriptional induction of
two Cu/Zn superoxide dismutase genes in Arabidopsis is medi-
ated by downregulation of miR398 and important for oxidative
stress tolerance. Plant Cell, 18 (8): 2051~2065
Sunkar R, Li YF, Jagadeeswaran G (2012). Functions of microRNAs
in plant stress responses. Trends Plant Sci, 17: 196~203
Sunkar R, Zhu JK (2004). Novel and stress-regulated microRNAs and
other small RNAs from Arabidopsis. Plant Cell, 16: 2001~2019
Thijs G, Moreau Y, De Smet F, Mathys J, Lescot M, Rombauts S,
Rouze P, De Moor B, Marchal K (2002). INCLUSive: integrated
clustering, upstream sequence retrieval and motif sampling. Bio-
informatics, 18 (2): 331~332
Torres MA, Jone JD, Dang JL (2006). Reactive oxygen species signal-
ing in response to pathogens. Plant Physiol, 141: 373~378
Varkonyi-Gasic E, Wu R, Wood M, Walton EF, Hellens RP (2007).
Protocol: a highly sensitive RT-PCR method for detection and
quantification of microRNAs. Plant Methods, 3: 12
Xia K, Wang R, Ou X, Fang Z, Tian C, Duan J, Wang Y, Zhang M
(2012). OsTIR1 and OsAFB2 downregulation via OsmiR393
overexpression leads to more tillers, early flowering and less tol-
erance to salt and drought in rice. PLoS ONE, 7: e30039
Yu CL, Yan SP, Wang CC, Hu HT, Sun WN, Yan CQ, Chen JP, Yang
L (2008). Pathogenesis-related proteins in somatic hybrid rice
induced by bacterial blight. Phytochemistry, 69: 1989~1996
Zhang B, Pan X, Cobb GP, Anderson TA (2006). Plant microRNA: a
small regulatory molecule with big impact. Dev Biol, 289: 3~16
Zhang S, Mei J, Wang T, Wang CC, Zhang WL, Yang L (2015). Iden-
tification and expression analysis of OsmiR1861k in rice leaves
to Xanthomonas oryzae pv. oryzae. J Gen Plant Pathol, 81:
108~117
Zhou X, Wang G, Zhang W (2007). UV-B responsive microRNA
genes in Arabidopsis thaliana. Mol Syst Biol, 3: 103
Zhu QH, Spriggs A, Matthew L, Fan L, Kennedy G, Gubler F,
Helliwell C (2008). A diverse set of microRNAs and microR-
NA-like small RNAs in developing rice grains. Genome Res, 18:
1456~1465