全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (7): 699~704 699
秋水仙素诱导大青杨同源三倍体
娄玲玲, 赵慧, 祁传磊, 卢倩倩, 王勃, 李开隆*
东北林业大学林学院, 林木遗传育种国家重点实验室, 哈尔滨150040
摘要: 以黑龙江省苇河、带岭的大青杨为亲本, 采用正交设计L16(45)对授粉后的雌花序施加0.2%~0.6%的秋水仙碱溶液进
行染色体加倍试验, 通过流式细胞术和染色体镜检方法检测变异植株的染色体倍性, 共获得12株大青杨同源三倍体。结果
表明, 在授粉36~60 h后用0.5%秋水仙碱溶液浸泡24 h的诱导效果最好。大青杨三倍体植株叶长和叶宽分别高出二倍体
21%和45%; 其叶片气孔长、宽高出二倍体55%和45%, 气孔密度是二倍体的18%。
关键词: 大青杨; 秋水仙素; 同源三倍体
Autotriploid Induction in Populus ussuriensis Kom. by Colchicine
LOU Ling-Ling, ZHAO Hui, QI Chuan-Lei, LU Qian-Qian, WANG Bo, LI Kai-Long*
State Key Laboratory of Forest Genetics and Tree Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract: With the parents of Populus ussuriensis from Dailing and Weihe forest bureau in Heilongjiang, the
female inflorescences were treated with 0.2%-0.6% colchicine after pollinating to induce chromosome doubling
by orthogonal design of L16(4
5), and 12 triploid plants were obtained by flow cytometry and microscopic to
detect chromosomal ploidy. The results showed that the most effective induction was 0.5% colchicine for 24 h
at 36-60 h after pollination. The length and width of triploid leaves were 21% and 45% respectively larger than
those of the diploid ones, and the length and width of triploid stomata were 55% and 45% respectively larger
than those of the diploid ones, and their stoma density was 18% of the diploid.
Key words: Populus ussuriensis; colchicine; autotriploid
大青杨是我国东北林区特有的乡土树种, 其生
长较快, 材质好, 用途广泛, 是造纸及胶合板材的优
质原料。因此以速生、优质、适应性强为目标的
大青杨育种逐渐引起人们重视。现已开展了大青
杨的群体变异及选择(张绮纹等1993)、种间及种源
间杂交(严言等1999)、种质资源收集(苏晓华等
2001)、航天诱变(宋兴舜等2009)等方面的研究。
我国毛白杨天然三倍体的发现以及毛新杨×
毛白杨人工三倍体的选育成功(朱之悌等1995), 进
一步证明杨树三倍体能够取得常规育种难以达到
的效果, 从而为大青杨新品种选育提供了一条新
的途径。王君等(2007)采用秋水仙素诱导获得26
株青杨派杂种三倍体, 2年生实生苗的地径和苗高
平均值分别超出二倍体20%和5%。但关于大青杨
三倍体诱导的研究报道较少。本研究采用康向阳
等(2004a)用秋水仙碱处理授粉后的花序获得三倍
体的新方法, 对大青杨进行三倍体诱导试验, 目的
是选择出生长快、抗逆性强的大青杨三倍体, 进
而选育出适合山地林区生长的杨树新品种, 为东
北林区大青杨多倍体育种提供参考。
收稿 2011-04-06　　修定 2011-07-04
资助 黑龙江省“十一五”科技攻关项目(GA06B301-2)和大学生
创新课题(101022542)。
* 通讯作者(E-mail: likailong@126.com; Tel: 0451-82190607-12)。
材料与方法
2009年3月5日于黑龙江省带岭林业局碧水林
场和苇河林业局青山林场, 选择生长健壮、无病
虫害且树龄20年左右的大青杨(Populus ussuriensis
Kom.), 采集雌雄花枝, 然后将花枝低温贮藏在苗
木窑中。
剪取大青杨雄花枝80~100 cm, 将其基部插入
水桶中, 水深大约20 cm。放入温室中培养, 温室
的温度保持在10~20 ℃。每2 d换1次水, 保持花枝
正常生长。在温室中培养8~12 d, 花粉发育成熟,
收集花粉, 储藏在干燥器中。以同样方法水培大
青杨雌花枝, 等柱头发亮时授粉。
由于大青杨雌花枝数量和收集花粉数量的限
制, 无法以1个杂交组合来完成整个正交试验, 而
采用D1×W1和D6×W5两个杂交组合一起进行正交
植物生理学报700
设计三因素秋水仙素诱导试验。按照正交设计
L16(4
5) (表1), 在授粉24、36、48、60 h后分别用
0.2%、0.3%、0.5%、0.6% 4种浓度秋水仙碱来浸
泡4~6个雌花芽, 浸泡时间分别为12、24、36、48
h。同时, 以未处理花序为对照。当蒴果开裂吐絮
时, 套袋收集种子。将种子点播于基质经高温灭
过菌的营养杯中。待苗长到15 cm时, 开始进行倍
性鉴定。
尖放于冰水混合物中, 置4 ℃冰箱中24 h, 然后将
根尖换入卡诺固定液(无水乙醇:冰乙酸=3:1)中, 于
室温下固定处理4 h; 弃去固定液, 然后再用95%的
酒精和浓盐酸(3:1)的溶液处理10 min; 最后采用改
良苯酚品红染色法制片, 将制成的根尖临时压片
放入光学摄像显微镜(Docuval, Carl Zeiss, Germa-
ny)下, 观测染色体条数并拍照。
取二倍体和三倍体大青杨第6片成熟叶, 用蒸
馏水洗干净, 切成4 cm×4 cm, 样品在空气中干燥,
放入样品杯中。在扫描电镜下观察, 拍照。利用
其软件测量10个视野下气孔的长度、宽度, 取平
均值。在10个视野中分别统计气孔个数, 换算成
气孔密度, 取平均值。数据采用SPSS软件处理, 并
进行显著性差异分析。
观测生长60 d左右的大青杨叶片大小、颜色
深浅、植株生长情况, 并测定叶片的长度、宽度
等指标。每一指标测定12个样本, 数据采用SPSS
软件处理, 并进行显著性差异分析。
实验结果
1 三倍体植株的鉴定
从叶片单细胞DNA含量(图1)可以看出, 二倍
体对照植株仅在相对荧光强度值为100的位置上
出现1个单峰; 变异植株在接近150的位置上出现1
个单峰, 在100和150位置以外未出现明显的其他
峰, 即变异植株叶片单细胞DNA含量为二倍体叶
片的1.5倍, 即为三倍体。
将诱变的大青杨植株根尖制成临时压片, 在
光学摄像显微镜观测, 诱变根尖细胞染色体条数
为57, 即三倍体; 正常的二倍体根尖细胞染色体数
为38 (图2)。
2 三倍体大青杨的诱导
大青杨授粉后开始处理时间、秋水仙碱浓度
和处理时间对大青杨三倍体诱导率均有较大影响
(表2和表3)。在雌花序授粉后24 h进行秋水仙素诱
导, 共获得成苗233株, 但未获得大青杨三倍体苗;
授粉36 h后诱导, 共获得成苗216株, 其中有2株三
倍体苗; 授粉48 h后诱导, 共获得成苗167株, 其中
有1株三倍体苗; 授粉60 h后诱导, 共获得成苗209
株, 其中有9株三倍体苗。可见, 三倍体大青杨诱
导的起始处理时间为雌花序授粉后36~60 h。由于
秋水仙素有剧毒, 能够引起蒴果及果序脱落。当
表1 大青杨三倍体的L16 (4
5)正交试验设计
Table 1 The orthogonal test design of P. ussuriensis triploids
编号 杂交组合 授粉后时间/h 秋水仙碱浓度/% 浸泡时间/h
1 D1×W1 24 0.2 12
2 D1×W1 36 0.2 24
3 D6×W5 48 0.2 36
4 D6×W5 60 0.2 48
5 D6×W5 36 0.3 12
6 D6×W5 24 0.3 24
7 D1×W1 48 0.3 36
8 D1×W1 60 0.3 48
9 D6×W5 48 0.5 12
10 D6×W5 60 0.5 24
11 D1×W1 24 0.5 36
12 D1×W1 36 0.5 48
13 D1×W1 60 0.6 12
14 D1×W1 48 0.6 24
15 D6×W5 36 0.6 36
16 D6×W5 24 0.6 48
17 D1×W1 0 0 0
18 D6×W5 0 0 0
　　字母D代表采样地为带岭, W代表为采样地为苇河。
以每个处理组合为单位, 以大青杨苗高生长
和叶片大小为指标, 将超过本处理组合平均值的
植株作为倍性变异的取样材料, 进行流式细胞仪
分析。
分别取样植株的上中下3个部位, 选取生长正
常的展开叶片100 mg, 置于有0.5 mL细胞核提取液
(Partec HR-A)的培养皿中剪碎, 静置3 min, 用30
μm Cell TricsTM过滤到样品管中, 加入2 mL Partec
HR-B溶液静置5 min, 用流式细胞分析仪检测
(Partec-I, Munster, Germany)。所有测试样品细胞
核DNA的含量是以对照为标准的相对值。DNA倍
体的判定标准: DI=1.5±0.1 (1.40~1.60)为三倍体(杜
立颖等2008; 高彩云等2010)。
将切下的二倍体和用秋水仙碱诱导的植株根
娄玲玲等: 秋水仙素诱导大青杨同源三倍体 701
秋水仙素的浓度为0.6%时, 整条果序脱落, 没有获
得种子; 当秋水仙素的浓度为0.2%时, 获得的大青
杨种子最多, 但不能够引起配子加倍未获得三倍
体植株; 当秋水仙素的浓度为0.5%时, 获得三倍体
大青杨最多。秋水仙素处理12 h, 共获得1株三倍
体; 处理24 h, 共获得8株; 处理36 h, 获得1株三倍
体; 处理48 h, 获得2株三倍体。可见, 诱导大青杨
三倍体适宜条件为: 在授粉雌花序60 h后, 用秋水
仙素浓度0.5%处理24 h。
3 三倍体与二倍体大青杨叶片形态和气孔特征比较
由表4可以看出, 三倍体大青杨的叶长、叶
宽、叶长/叶宽与二倍体对照相比, 差异显著, 叶长
和叶宽分别高出二倍体对照21%和45%。
通过扫描电镜观察了三倍体大青杨的叶片表
面形态, 发现其表皮细胞面积较二倍体大青杨显
著增大(表4和图3)。大青杨的三倍体与二倍体在
气孔长度、宽度、密度上也达到了显著差异, 三
倍体植株叶片气孔细胞的长、宽分别高出二倍体
图2 二倍体和三倍体植株的染色体数目
Fig.2 Chromosome numbers of the diploid and triploid plants
表2 秋水仙碱诱导大青杨三倍体的结果
Table 2 The result of P. ussuriensis triploids
induced by colchicine
编号 种子数 成苗数 三倍体体数
1 101 96 0
2 99 87 0
3 100 88 0
4 97 88 0
5 71 45 1
6 96 87 0
7 80 75 1
8 69 46 1
9 45 33 0
10 50 46 8
11 58 50 0
12 100 84 1
13 0 0 0
14 0 0 0
15 0 0 0
16 0 0 0
17 226 205 0
18 272 246 0
图1 二倍体和三倍体植株的DNA含量分布图
Fig.1 DNA distribution histogram of the diploid and triploid plants
植物生理学报702
55%和45%, 气孔密度是二倍体的18%。
三倍体大青杨生长健壮, 叶片增大、增厚, 颜
色较深。叶的形状发生了较大变化, 二倍体大青
杨叶片形状为狭长型, 而三倍体近似为椭圆形(图
4)。一年生的三倍体与二倍体大青杨的苗高分别
为33.3和32.3 cm, 地径则为0.34和0.38 cm, 无显著
差别。
讨　　论
1 秋水仙碱处理的杨树多倍体诱导
目前, 杨树三倍体的人工诱导主要是通过不
同倍性体杂交、诱导2n配子杂交以及对授粉后的
雌花序进行秋水仙碱处理等途径来实现。其中不
同倍性体杂交是最为简单有效的方法, 但首先要
有四倍体植株的存在, 而四倍体的培育需要较长
时间。
第二条途径为诱导2n配子杂交, 包括2n花粉
和2n大孢子的诱导。2n花粉的利用需要克服单倍
性花粉竞争的问题, 三倍体诱导得率低。康向阳
等(2004b)采用60Co辐射处理, 从而刺激2n花粉的萌
发, 抑制或杀死部分单倍性花粉, 三倍体得率提高
到3.8%。李开隆等(2006)对大青杨雄花序处理获
表3 大青杨三倍体的正交试验数据分析
Table 3 Analysis of orthogonal test of P. ussuriensis triploid
水平
种子数 成苗数 三倍体数
授粉后时间 秋水仙碱浓度 处理时间 授粉后时间 秋水仙碱浓度 处理时间 授粉后时间 秋水仙碱浓度 处理时间
1 63.8 99.3 54.3 58.3 89.8 43.5 0 0 0.3
2 67.5 79.0 61.3 54.0 63.3 55.0 0.5 0.8 2.0
3 53.5 63.3 59.5 41.8 53.3 53.3 0.3 2.3 0.3
4 56.8 0 66.5 52.3 0 54.5 2.3 0 0.5
R (极差) 14.0 99.3 12.2 16.5 89.8 11.5 2.3 2.3 1.7
表4 二倍体和三倍体大青杨叶片和气孔的特征
Table 4 Characteristics of leaves and stomata between triploid and diploid of P. ussuriensis
倍性 叶长/cm 叶宽/cm 叶长/宽 气孔长/μm 气孔宽/μm 气孔密度/mm2
二倍体 11.46±0.99b 5.72±0.63b 1.99±0.18a 21.88±2.36b 15.84±2.20b 617.1±66.7a
三倍体 13.95±1.42a 8.34±0.93a 1.68±0.11b 33.94±3.99a 22.92±1.88a 112.9±20.2b
　　数据采用平均值±标准差, 同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。
图3 二倍体和三倍体大青杨的气孔比较
Fig.3 Comparison of stomata morphology between diploid and triploid plants
图中的标尺长度均为50 μm。
娄玲玲等: 秋水仙素诱导大青杨同源三倍体 703
图4 二倍体和三倍体大青杨叶子形态的比较
Fig.4 Comparison of leaf morphology between diploid and triploid plants
得了2n花粉, 但授粉后没有得到三倍体。而另一
方面, 2n大孢子的诱导处理时机的把握较为困难,
李云等(2001)采用0.25%~0.5%浓度的秋水仙碱溶
液处理毛新杨雌花芽诱导其雌配子染色体加倍,
经杂交获得13株三倍体植株毛白杨。我们也对大
青杨雌花序进行加倍处理, 但由于大多数雌花序
脱落而未获成功。
第三条途径是对授粉后的雌花序进行秋水仙
碱处理。康向阳等(2004a)以银腺杨等为母本, 毛
白杨为父本, 在授粉后一定时间采用秋水仙碱溶
液处理花序, 检出21株银腺杨×毛白杨三倍体, 证
明授粉后24~36 h是施加秋水仙碱诱导白杨三倍体
的有效时期, 获得了最高达57.1%的三倍体得率。
王君等(2007)以‘哲引3号’杨为母本, 小青杨和北京
杨为父本, 对授粉后24~96 h的雌花序用0.3%~
0.5%的秋水仙碱溶液处理, 获得了26 株青杨杂种
三倍体, 其中授粉54~66 h后用0.5%秋水仙碱溶液
浸泡18~30 h后, 三倍体得率高达66.7%。本试验对
授粉后大青杨雌花序进行秋水仙碱处理, 获得12
株三倍体, 其中在授粉雌花序60 h后采用0.5%秋水
仙碱处理24 h, 获得大青杨三倍体8株。
综上所述, 对授粉后的雌花序进行秋水仙碱
处理是诱导产生杨树三倍体的有效途径, 杨属不
同种生殖发育进程的特异性及其对秋水仙碱作用
的敏感性差异略有差异。
2 多倍体杨树植株的形态特征
多倍体表现在叶、花、果实、种子、气孔、
花粉粒甚至整个植株, 都较二倍体大些, 叶和花的
颜色要深些等等, 这已经被许多早期从事多倍体
研究的科学家所证实。但是, 多倍体的“巨大性”一
般并不是细胞数量的增加, 而是细胞体积和容积
的增大以及细胞表面积和体积比值的减小。气孔
保卫细胞和花粉粒的大小已被用作鉴别染色体加
倍的间接形态指标(李树贤2008)。如毛白杨三倍
体TB-7在株高、叶片面积、叶片厚度、栅栏组织
厚度和气孔长度等方面都明显优于对照和其亲本,
表现了较为突出的多倍体巨大性 (李凤兰等
1994)。祁传磊等(2010)报道了三倍体大青杨的栅
栏组织厚度大, 栅栏组织与海绵组织厚度比值高
出二倍体50%, 三倍体大青杨的最大净光合速率高
出二倍体21%。本试验表明, 三倍体大青杨在叶片
气孔的长度、宽度和密度方面的表现也与三倍体
毛白杨的结果类似。
Bailian和Gary (1993)研究表明, 三倍体杂种山
杨无性系材积生长量明显高于对照二倍体。朱之
悌等(1995)选育的毛白杨回交三倍体(B301) 8年生
的单株材积高于自然二倍体毛白杨2.5倍。王君等
(2007)也指出, 无论是以北京杨还是以小青杨为父
本, 其子代群体中的三倍体植株平均生长情况均
优于相同杂交组合的二倍体植株。本研究诱导的
植物生理学报704
三倍体大青杨一年生苗高和地径与二倍体对照差
异不显著, 可能是苗龄太小, 生长不充分所得的初
步结果, 因此需进一步对其扩繁、田间对比试验
后再得出结论。
参考文献
杜立颖, 冯仁青(2008). 流式细胞术. 北京: 北京大学出版社
高彩云, 潘惠新, 贾恒, 范辉, 方炎明(2010). 美洲黑杨×小叶杨杂种
多倍体诱导研究. 西北植物学报, 30 (1): 50~55
康向阳, 张平冬, 高鹏, 赵芳(2004a). 秋水仙碱诱导白杨三倍体新途
径的发现. 北京林业大学学报, 26 (1): 1~4
康向阳, 朱之梯, 林惠斌(2004b).　白杨不同倍性花粉的辐射敏感
性及其应用. 遗传学报, 27 (1): 72~82
李凤兰, 张志毅, 张民侠(1994). 白杨染色体加倍技术研究及三倍体
育种(Ⅲ)－加倍体某些形态特征的观察. 北京林业大学学报,
16 (2): 15~18
李开隆, 肖静, 刘桂丰, 李志新(2006). 秋水仙素处理诱导大青杨2n
花粉方法的优化. 核农学报, 20 (4): 282~286
李树贤(2008). 植物染色体与遗传育种. 北京: 科学出版社
李云, 朱之悌, 田砚亭, 张志毅, 康向阳(2001). 秋水仙碱处理白杨雌
花芽培育三倍体植株的研究. 林业科学, 37 (5): 68~74
祁传磊, 靳春莲, 李开隆, 李志新, 赵慧(2004). 不同倍性大青杨
的光合特性及叶片解剖结构比较. 植物生理学通讯, 46 (9):
917~922
宋兴舜, 吴迪, 刘雪梅, 李开隆, 宋福南, 杨传平(2009). 大青杨航
天诱变植株早期抗氧化酶生化指标测定. 林业科学, 45 (7):
145~149
苏晓华, 黄秦军, 张香华, 张绮纹, 王冰, 姚盛智(2010). 中国大青杨
基因资源研究. 林业科学研究, 14 (5): 472~478
王君, 康向阳, 李代丽, 景艳春, 杨伟光(2007). 授粉后施加秋水仙
碱处理诱导青杨派异源三倍体. 北京林业大学学报, 29 (5):
18~21
严言, 王恩海, 张守祥, 占福顺, 刘培林(1999). 大青杨、香杨种间及
种源间的交配. 东北林业大学学报, 27 (3): 20~25
张绮纹, 苏晓华, 姜兴林(1993). 大青杨群体变异及其选择的研究.
林业科学, 29 (1): 57~62
朱之悌, 林慧斌, 康向阳(1995). 毛白杨异源三倍体B301等无性系
选育的研究. 林业科学, 31 (6): 499~505
Bailian L, Gary WW (1993). Hybrid aspen performance and genetic
gains. North J App For, 10 (3): 117~121