全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 6期，2009年 6月 579
收稿 2009-02-23 修定 　2009-05-20
资助 国家自然科学基金(30 1 70 7 7 2)。
* 通讯作者(E-mail: shenhl-cf@nefu.edu.cn; Tel/Fax: 0451-
8 2 1 9 1 0 4 4 )。
低温预处理对水曲柳体细胞胚胎发生的影响
李楠 1,2, 孔冬梅 2,3, 沈海龙 1,2,*
1东北林业大学林学院, 哈尔滨 150040; 2东北林业大学林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室, 哈尔滨 150040; 3山西
大学生命科学与技术学院, 太原 030006
提要: 用4 ℃低温预处理未成熟的水曲柳种子0~30 d, 取出种子内的合子胚为外植体诱导体胚发生, 研究低温预处理影响体
胚发生的结果表明: 低温预处理过的外植体其体胚发生总数和子叶胚发生数均低于未作低温预处理的; 随着预处理时间的
延长, 畸形胚发生数和发生比率与总的体胚发生数和发生率的变化趋势基本相同; 处理20 d的正常胚发生数和发生比率的
绝对数虽然很低, 但远高于不作低温预处理的。说明4 ℃低温预处理对水曲柳体胚发生没有促进作用, 对畸形胚的发生也
不能控制, 总的来讲, 适当的低温处理有一定的改善正常体胚发生的潜力。
关键词: 水曲柳; 低温预处理; 体胚发生; 畸形胚
Effect of Low Temperature Pretreatment on Somatic Embryogenesis of
Fraxinus mandshurica Rupr.
LI Nan1,2, KONG Dong-Mei2,3, SHEN Hai-Long1,2,*
1School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 2Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement
and Biotechnology of Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 3College of Life Science and
Technology, Shanxi University, Taiyuan, Shanxi 030006, China
Abstract: The effects of low temperature pretreatment on somatic embryogenesis of Fraxinus mandshurica
were investigated by using zygotic embryos from immature seeds that pretreated under 4 ℃ for 0–30 d as
explants. The results showed that the total somatic embryos and cotyledonary somatic embryos induced from
the pretreated explants were lower than those of control; the fluctuation trends of abnormal somatic embryos
and their ratio to total somatic embryos along with the pretreatment time changes were similar to those of total
somatic embryos and induction ratio; however, although the absolute normal somatic embryos and its ratio to
total somatic embryos were very low in the 20 d treatment, they were much higher than those of control. This
indicated that 4 ℃ low temperature pretreatment had no improvement effect on F. mandshurica somatic em-
bryogenesis and abnormal somatic embryo control, but the proper treatment had the potential to improve normal
somatic embryogenesis.
Key words: Fraxinus mandshurica; low temperature pretreatment; somatic embryogenesis; abnormal somatic
embryos
水曲柳是我国东北地区珍贵的硬阔叶用材树
种, 同时也有很高的观赏价值, 是国家渐危物种。
水曲柳的人工造林和繁殖已经引起人们的高度重
视, 组织培养技术用于水曲柳的无性快速繁殖研究
已取得了一定的进展(谭燕双和沈海龙 2003; 张惠
君和罗凤霞 2003; 张丽杰等 2007)。作为离体培养
条件下形态发生和植株再生的途径之一的植物体胚
发生, 因其高效转化为完整植株的能力、高度的遗
传稳定性和用于良种繁育的潜力而受到广泛关注。
水曲柳的体胚诱导虽然取得成功, 但是由于体胚诱
导率低和畸形胚发生率高等原因, 致使完整的体胚
发生体系的建立和应用受到影响(孔冬梅等2006; 孔
冬梅和沈海龙2008)。低温预处理是植物体胚发生
研究中为改善体胚发生而广泛采用的比较有效的措
施之一, 但关于低温预处理对水曲柳体胚发生的效
应至今尚未见报道。本文以水曲柳未成熟合子胚
为外植体诱导体胚发生, 并研究低温预处理与水曲
柳体胚发生的关系, 为探讨改善水曲柳体胚发生的
措施提供参考。
植物生理学通讯 第 45卷 第 6期，2009年 6月580
材料与方法
水曲柳(Fraxinus mandshurica Rupr.)未成熟种
子于2007年7月23日采集于东北林业大学哈尔滨
实验林场发育良好的母树。采集的种子立即装入
纸袋, 带回实验室置于4 ℃冰箱内低温处理10、20
和 30 d; 以未作低温处理的种子为对照。处理后
进行材料灭菌和诱导培养。
种子去翅后用自来水冲洗 1 d、70%酒精浸
泡20~30 s后, 在超净工作台上用0.2%的NaClO溶
液灭菌 15 min, 之后用无菌水漂洗 5次, 备用。
从灭过菌的种子中剥取种胚, 再从每个种胚上
切取一片子叶用作外植体, 切下的子叶将其远轴面
朝下, 接种于培养基上进行体胚诱导培养。诱导培
养基为 1/2MS (MS培养基所有成分均减半), 附加
1.5 mg·L-1 NAA、0.5 mg·L-1 6-BA、400 mg·L-1水
解酪蛋白、70 g·L-1蔗糖、6 g·L-1琼脂, 高压灭菌
前调节 pH值至 5.8。采用暗培养, 培养室温度为
(25±2) ℃, 相对湿度为 60%~70%。
每处理重复 3次, 每个重复接种 10个外植体,
培养6周时记录体胚发生情况, 按下列公式统计各
项数据, 并将结果用 SPSS 13.0软件进行方差分析
和多重比较(LSD法)。体胚发生数(个)=体细胞胚
总数 /发生体胚的外植体数; 畸形胚发生数(个)=
畸形胚总数 /发生体胚的外植体数; 子叶胚发生数
(个)=子叶形体细胞胚总数 /发生体胚的外植体数;
正常胚发生数(个)=子叶期正常体细胞胚数 /发生
体胚的外植体数; 畸形胚率(%)=子叶期畸形胚数 /
子叶胚发生总数 ×100; 体胚发生率(%)=发生体细
胞胚的外植体数 /接种的外植体数×100; 子叶胚率
(%)=子叶形体细胞胚数/体胚发生总数×100; 正常
胚率(%)=子叶期正常体细胞胚数 /子叶胚发生总
数 ×100。
实验结果
1 低温预处理对水曲柳体胚发生数的影响
图1表明, 水曲柳体细胞胚的发生数随着低温
预处理时间的延长而呈下降趋势。未经低温预处
理的外植体, 其体胚发生数量最多(平均每个外植体
产生 2.99个体细胞胚), 其次为预处理20 d的(平均
每个外植体产生体胚 2.32个), 低温预处理 10 d和
30 d的外植体平均发生体胚数均较低(分别为 1.56
个和 0.57个)。方差分析显示, 低温预处理时间对
水曲柳体胚发生数的影响极显著(P<0.01)。多重
比较(图 1)表明, 未作低温预处理与低温预处理 10
d及 30 d之间、低温预处理 20 d与 30 d之间的差
异显著(P<0.05), 低温预处理 30 d与未作低温预处
理、低温预处理 10 d及 20 d之间差异极显著
(P<0.01)。以未经低温预处理的外植体诱导体细
胞胚发生数最高, 而低温预处理 30 d的最低。
此外, 外植体培养6周的多数体细胞胚发育至
子叶期的方差分析显示, 低温预处理对子叶胚发生
数的影响显著(P<0.05)。不作低温预处理的发生
数最多(每个外植体 2.50个), 且与低温预处理 10 d
和 30 d间差异显著(P<0.05), 处理 20 d的子叶胚的
发生数次之(每个外植体 1.42个), 处理 10 d和 30 d
的不产生子叶胚, 说明未经低温预处理的外植体上
有较多的体胚能够整齐一致地发育至子叶胚阶段。
2 低温预处理对畸形胚发生数的影响
由于体细胞胚的形态在子叶胚时期最容易分
辨, 所以我们只对子叶期的体细胞胚进行畸形胚和
正常胚数量的统计。由图 1可以看出, 水曲柳畸形
胚发生数随着低温预处理时间的延长而变化的趋势
与体胚发生数及子叶胚发生数的相同, 即畸形胚发
生数随着体胚发生数的增多而增多, 随着体胚发生
数的减少而减少。方差分析和多重比较(图 1)显
示, 低温预处理时间对水曲柳畸形胚发生数的影响
显著(P<0.05), 未作预处理与低温预处理 10 d和低
温预处理 30 d的之间差异显著(P<0.05)。
图 1 低温预处理时间对水曲柳体胚发生数的影响
Fig.1 Effect of low temperature pretreatment on induction
number of somatic embryos of F. mandshurica
图中小写字母表示在 P<0.05水平上差异显著; 大写字母表
示在 P< 0 .0 1 水平上差异极显著。
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此外, 经低温预处理后, 畸形胚率均在80%以
上, 其中低温预处理 10 d和 30 d的畸胚率达到
100%, 即所形成的子叶胚全部呈畸形。低温预处
理时间对水曲柳畸形胚发生率的影响差异不显著
(P>0.05) (图 2)。可见, 处理 30 d之内的低温预处
理对降低水曲柳畸形胚的发生没有控制作用。
但方差分析表明, 低温预处理时间对水曲柳体胚发
生率的影响不显著, 说明 4 ℃低温预处理 10、20
和 30 d不能提高水曲柳体胚发生率。
此外, 未作低温预处理和低温预处理 10、20
和 30 d的子叶胚率分别为76.69%、61.90%、74.10%
和 53.33%, 其变化趋势与体胚发生率的相同。
3 低温预处理对正常胚发生数的影响
方差分析显示, 低温预处理时间对正常胚发生
数的影响不显著。由图 1可以看出, 经低温预处理
的外植体正常胚发生数很少, 未低温预处理的为每
外植体 0.02个, 低温预处理 20 d的为每外植体
0.17个, 而低温预处理 10 d和 30 d的正常子叶胚
均未发生。不过, 低温预处理 20 d的虽然体胚发
生数和子叶胚发生数均低于未作低温预处理的, 但
正常胚发生数则比其高, 且是所有处理中最高的, 是
未作低温预处理的 850%。另由图 2可以看出, 未
作低温预处理和低温预处理 20 d的正常胚发生比
率虽然很低(分别为1.79%和15.63%), 但是处理20
d的正常胚发生比率远高于未作低温预处理的(是
其 873%)。
4 低温预处理对各种体细胞胚发生率的影响
经过低温预处理的外植体培养 6周时的体胚
发生率达到最大值。由图 3可以看出, 随着低温预
处理时间的延长, 水曲柳体胚发生率呈现下降—升
高—下降的趋势, 与体胚发生数的变化趋势相同。
不经低温预处理的体胚发生率最高, 达到 22.22%。
讨　　论
作为促进脱分化和再分化的一项有效措施, 低
温预处理早已广泛用于植物组织培养中。如低温
处理可提高水稻花药(赵成章 1980)和籼稻花培(沈
清景 1983)愈伤组织诱导率和绿苗分化率, 以及小
麦成熟胚愈伤组织分化能力。一般认为, 低温预处
理是通过改变组织中激素水平或游离氨基酸含量而
发生作用的(Sunderland等1984; 徐武等1997; 黄剑
华等 2001)。已有的研究表明, 低温预处理对一些
植物体胚诱导和成苗也有作用。如接种前将大豆
幼荚于4 ℃低温中预处理3~4 d可以提高其未成熟
子叶的体胚诱导频率(王萍等 2002)。适当的低温
预处理可改善大豆和平贝母(袁澍等2003)及欧洲甜
樱(Reidiboym-Talleux等2000)体胚发生和植株的再
生, 还可提高羽衣甘蓝(冯辉等2007)和甘蓝型油菜
(朱彦涛等 2005)小孢子的产胚率。鸭茅草的叶片
在 4 ℃低温下预培养 1~7 d后再转入 21 ℃中培养
时, 叶片体胚发生可以得到促进, 每个外植体的苗数
量增加, 体胚苗的质量也可以得到改善(Tomaszewski
Jr等 1994)。低温预处理可以提高甘蓝型油菜小孢
子的胚胎发生能力, 但胚发生的同步性降低(郭世星
图 3 低温预处理时间对水曲柳体胚发生率的影响
Fig.3 Effect of low temperature pretreatment on induction
rate of total somatic embryos of F. mandshurica
图 2 低温预处理时间对水曲柳畸形体胚率
和正常体胚率的影响
Fig.2 Effect of low temperature pretreatment on induction
ratios of abnormal and normal somatic
embryos of F. mandshurica
植物生理学通讯 第 45卷 第 6期，2009年 6月582
等 2005)。花楸经 2~5 ℃预处理 3~7 d, 其幼胚的
体胚发生能力下降(沈海龙等 2008)。这说明不同
植物对低温预处理的反应并不相同。
本文结果表明, 对接种前的外植体用4 ℃低温
处理 10、20和 30 d后, 水曲柳体胚总体发生和子
叶胚发生没有得到促进, 畸形胚发生也未得到控
制。这与前人的结果不一致, 但与沈海龙等(2008)
报道的花楸中结果相似。不过, 4 ℃低温预处理 20
d的正常体胚发生数和发生比率的绝对数虽然很低,
但比未作低温预处理的高, 这是值得关注的, 应该
深入研究。
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