全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (11): 1113~1120 1113
收稿 2013-07-22　　修定 2013-09-23
资助 中央高校基本科研业务费专项基金项目(DL13CA13)和国家
自然科学基金项目(30900115和31070275)。
* 通讯作者(E-mail: lyhshen@126.com; Tel: 0451-82191733)。
SRK-SCR转基因拟南芥自交不亲和性的研究进展
郝艾馨, 蓝兴国, 王宇, 李玉花*
东北林业大学生命科学学院, 哈尔滨150040
摘要: 十字花科植物自交不亲和性(SI)受S-位点(S-locus)编码的SRK和SCR控制, 它们分别是柱头和花粉中的SI特异识别因
子。野生型拟南芥不具有SI, 而近来通过转基因手段将外源SRK-SCR基因转入野生型拟南芥可以使其表现SI, 由此建立了
一个可用于十字花科SI研究的新型模式植物。本文综述了利用这种转基因拟南芥在SI机制及进化方面取得的进展, 包括SI
新基因的挖掘、候选基因功能分析和拟南芥生殖模式的转变等。
关键词: 自交不亲和性; 拟南芥; SRK; SCR
Advance in Self-Incompatibility of Arabidopsis thaliana with the Transgetic SRK-SCR
HAO Ai-Xin, LAN Xing-Guo, WANG Yu, LI Yu-Hua*
College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract: In the Brassicaceae, self-incompatibility (SI) is controlled by the S-locus receptor kinase (SRK) and
the S-locus cysteine-rich (SCR) protein. These two proteins are the SI specificity determinants in stigma and
pollen, respectively. Recently, the Arabidopsis thaliana with SI phenotype has been achieved by transferring
SRK/SCR allelic pairs from self-incompatible relative species to wild type A. thaliana. The new model plant
was applied in the mechanism and evolution research of SI in Brassicaceae. This review summarizes the ad-
vances in utilizing transgenic A. thaliana SI model, including screening of new SI genes, function analysis of
candidate genes and investigation of evolutionary switches to self-compatibility (SC).
Key words: self-incompatibility; Arabidopsis thaliana; SRK; SCR
在自然界中, 植物为了防止近亲繁殖和维持
遗传多样性, 采取了多种多样的生殖调控手段, 其
中自交不亲和性(self-incompatibility, SI)是最重要
的策略。这一特性在植物的进化过程中起着非常
关键的作用, 并被Darwin (1878)称为“我所遇到的
最令人惊奇的现象” (Cohen 2010)。其中, 对十字
花科芸苔属植物SI的研究较为深入(Nasral lah
2005; Yang等2006; Sanabria等2008; Finnegan等
2011; Takada等2013), 对人工控制SI反应, 利用自
交不亲和系简化育种过程具有重大意义。但芸苔
属植物基因组较为复杂, 遗传转化方法也相对繁
琐, 使得难以对SI的分子机制进行深入研究。
拟南芥(Arabidopsis thaliana)具有遗传背景清
晰、突变体资源丰富、遗传转化方法简单等优势,
是目前植物研究中的模式生物, 然而一些生物现
象在野生型拟南芥中并不存在, 导致其应用受限,
SI就是其中之一。来自世界各地的上百种拟南芥
生态型均表现为自交亲和性(self-compatibility, SC)
(Indriolo等2012), 而Nasrallah等(2002)首次应用转
基因方法, 成功地使野生型拟南芥表现SI。本文主
要针对这种转基因拟南芥SI的分子机制研究进展
作一综述。
1 转基因SI拟南芥的构建
十字花科植物SI受一个单独的基因多态性位
点控制, 即S-位点(S-locus) (Stein等1991)。芸苔属
植物及琴叶南芥(Arabidopsis lyrata, 拟南芥属, 具
有天然SI)的S-位点包含SRK (S-locus receptor ki-
nase)和SCR/SP11 (S-locus cysteine-rich protein/S-
locus protein 11) (Prigoda等2005; Tantikanjana等
2010)。作为SI决定因子, 它们分别编码柱头乳突
细胞上的跨膜受体激酶(Schopfer等1999)和一个小
综　述 Reviews
植物生理学报1114
的定位于花粉包被的富半胱氨酸蛋白, 这二者共
同组成SI信号识别的受体-配体(Shiba等2001; Ku-
saba等2001)。SRK由胞外域(extracellular domain,
S domain)、跨膜域(transmembrane domain, TM)和
具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的膜内域(kinase do-
main)三部分构成(图1-A), 芸苔属植物的S-位点还
包含SLG (S-locus glycoprotein), 它编码一个柱头
上的分泌型糖蛋白(Nasrallah等1985), 并与SRK胞
外域(eSRK)的氨基酸序列极其相似, 转基因试验
表明SLG不具有SI特异性, 只发挥增强SRK活性及
稳定性的功能, 且琴叶南芥SLG缺失(Kusaba等
2001)。由于芸苔属植物是干性柱头, 在授粉过程
中SLG可能参与了花粉的粘附(Takasaki等2000;
Nasrallah 2000)。当“自我”花粉落在柱头上时,
SCR与SRK同源二聚体互相识别, 并使SRK胞内域
自磷酸激活 , 从而启动SI反应(Ivanov等2010;
Iwano和Takayama 2012), 这就是SI反应的上游信
号识别过程。但野生型拟南芥AtSRK为假基因
(pseudogene, ψ), 在第4个外显子处转录提前终止,
致使末端缺失1 150 bp (图1-A), 膜内激酶域结构不
完整(Kusaba等2001), 且AtSCR也无法翻译成具有
功能性的蛋白质(图1-B)。
Bi等(2000)筛选甘蓝型油菜(Brassica napus)
基因组序列, 获得野生型拟南芥中缺失的SLG、
SRK和ARC1, 然后进行转基因试验却并未能使拟
南芥表现SI, 这可能是由于甘蓝型油菜和拟南芥分
属于不同的植物类别, 进化关系较远, 所以导致这
一现象。在此之后, 一种拟南芥近缘物种——琴
叶南芥(Savolainen等2000)走入了科学家的视野,
它被发现于北美和欧洲, 包含完整的SRK和SCR蛋
白结构(图1-A和B), 具有天然的SI, 约500万年前才
与拟南芥发生分离, 基因组大小约为拟南芥的2倍
(Stift等2013)。Nasrallah等(2002)将从Sb单元型琴
叶南芥中分离的SRKb和SCRb分别转入野生型拟
南芥Col-0生态型, 获得独立的SRKb和SCRb转化体
T1, 并且均表现为SC。然后以Col-0::SRKb T1代为
母本, Col-0::SCRb T1代为父本进行授粉试验, 并选
取(与野生型相比)只有少量花粉管萌发的T1代, 各
自进行自交, 即分别获得独立的SRKb、SCRb纯合
体T2代, 经杂交后最终获得Col-0::SRKb-SCRb并能
够形成对“自我”花粉的抑制, 但由于SRKb和SCRb
的插入位点是随机的, 所以这两个基因不连锁。
之后, Nasrallah等(2004)又将琴叶南芥的SRK和
SCR基因整合到同一植物表达载体中, 通过转基因
获得了SRK与SCR连锁的拟南芥转基因SI系, 为研
究不同拟南芥生态型S-位点的进化提供了便利。
Boggs等(2009)分离并转化Capsella grandiflora中
的CgSRK、CgSCR, 也获得了SI拟南芥。Tsuchi-
matsu等(2010)将从叶芽鼠耳芥(Arabidopsis halleri)
中分离的AhSCR转入野生型拟南芥Wei-1生态型,
图1 拟南芥ψSRK和ψSCR序列
Fig.1 The ψSRK and ψSCR sequences of A. thaliana
根据文献(Kusaba等2001)修改。A: ψSRK编码截短开放阅读框(open reading frame, ORF), 矩形和折线分别表示外显子和内含子; B: 琴
叶南芥SCRb和拟南芥ψSCR编码氨基酸序列比对, 灰色部分代表相似氨基酸残基。
郝艾馨等: SRK-SCR转基因拟南芥自交不亲和性的研究进展 1115
也能使其恢复了SI, 这是因为Wei-1自身就具有完
整的内源性SRKa。这些研究均再次表明SRK和
SCR在SI反应中具有决定性作用, 并且也证明野生
型拟南芥除去上游识别元件(SRK或SCR)的缺失
外, 仍具备抑制“自我”花粉的SRK下游信号级联
反应系统。
2 SI相关基因的挖掘
虽然通过转基因的方法已成功地使野生型拟
南芥表达SI, 但是以不同生态型作为转化受体获得
的At::SRK-SCR的SI强度及稳定性存在极大差异:
(1)一些生态型(如: C24、Cvi)的转化体与天然SI
植物相似, 表达强烈且发育稳定的SI; (2)一些生态
型(如: Col-0、RLD)的转化体表达短暂且不稳定的
SI, 与自然情况下常见的假性SC (pseudo-self-com-
patible)类似, 表现为晚花期SI被打破; (3)还有一些
生态型只表达较弱的甚至不表达SI (Nasrallah等
2004; Rea等2010)。这些现象一方面说明后两类
拟南芥生态型中除去S-位点基因的缺失外还存在
其他SI基因的功能性缺失, 或受其他因素调控; 另
一方面, 后两者的SI特点使得其应用也显得尤为
重要。
分别以不同生态型为转化受体获得的SRK-
SCR转基因拟南芥(At::SRK-SCR), 其SI差异必然由
生态型间的多态性背景引起 , L iu等 (2007)将
C24::SRK-SCR分别与Col-0和RLD杂交, 图位克隆
到同一基因位点, 其中包含一个低丰度表达的基
因At4g21350 (也称PUB8), 其与S-位点连锁并具有
ARM-repeat和U-Box结构域, 与ARC1相比仅缺少
一个UND (U-box N-terminal domain)结构域, 它能
通过结合SRK的启动子区域抑制其转录, 但具体机
制还不清楚, 这是应用At::SRK-SCR首次发现的
SRK转录水平调节基因, 也是形成假性SC的一个
关键的自然变异。
以Col-0生态型为转化受体获得的Col-0::SRK-
SCR植株只在成熟蕾期和早花期表达强烈的SI, 晚
花期SI消失, 这种短暂的SI则刚好可以应用于突变
体分析。首先, 由于晚花期SI打破使得Col-0::SRK-
SCR植株仍能产生大量种子, 同时通过典型的化学
诱变(如EMS诱变)和T-DNA插入突变能够产生影
响SI的突变体, 包括早期SI的缺失和晚期SI的加
强。Tantikanjana等(2009)的研究就利用这些优势
拓展了对SRK的功能注释, 他们将EMS诱变后的
Col-0::SRK-SCR植株进行SI筛选, 获得了一个与亲
本相比SI增强的rdr6突变体(rdr6::SRK-SCR), RDR6
是一个参与合成反式作用干扰小RNA (trans-acting
siRNA, ta-siRNA)的蛋白, 也是SI的负调控因子, 这
种隐性的SI增强型突变体能同时表现SI增强和雌
蕊的伸长, 并使柱头突出, 同时他们发现这些表
型仅与SRK的功能有关 (而非SCR), 因为只有
rdr6::SRK具有这些表型, 并与其转录水平呈正相
关。此外, 通过氨基酸替换试验构建丧失SRK激酶
活性的rdr6突变体, 发现该突变体在维持SI的同时
并没有表现出柱头的突出, 且与rdr6::SRK-SCR相
比, SRK的转录水平更高, 这说明柱头的突出仅与
SRK自身的催化活性有关。这一突变体揭示了
SRK在SI表型及雌蕊发育中未曾被发掘的双重作
用, 为植物生理及形态上的协同进化提供了分子
生物学证据, 花结构的改变(包括柱头的突出)往往
伴随着繁殖模式的转换。Strickler等(2013)运用同
样的方法获得了一个在成熟蕾期SI缺失的nrpd1a
突变体, NRPD1a编码植物特异性RNA聚合酶, 能
与RDR2 (RNA-dependent RNA polymerase)一起调
控基因组甲基化水平, 并参与某些siRNA (silencing
RNA)的形成。该突变体花柱、花丝和花瓣中SRK
表达上调且全基因组甲基化水平下降, 所以推测
Col-0::SRK-SCR中NRPD1a可能通过甲基化导致
SRK沉默, 然而试验结果又表明该突变体柱头中
SRK表达下调, 推翻了这一推测, 所以Strickler等推
测这种差异可能是由SRK的转录水平在不同组织
及生态型中的差异引起的, 于是以多种拟南芥生
态型(包括C24、Cvi、Hodja、Kas、Sha、Col-0和
Rld)为转化受体对nrpd1a突变体和SRK启动子活性
进行分析, 发现其在不同组织及生态型中均有很
大差异, 而具体作用机制还不清楚, 但Strickler等认
为NRPD1a类似于之前报导的PUB8 (Liu等2007)和
3号染色上的一个SI修饰基因(Boggs等2009)都能
调节SRK的转录, 并且转基因SRK也受多水平调控,
说明拟南芥生殖模式在向SC转换的过程中, 不仅
伴随着SRK和SCR基因的失活, 往往还包含不同生
态型中随机出现的SI修饰元件的突变(Strickler等
2013), 这也为进一步解析不同生态型At::SRK-SCR
转化体SI表达差异提供了线索。这些研究成果均
植物生理学报1116
说明对SI正调控因子、效应因子, 甚至雌蕊发育的
调节可能都有siRNA的参与, 所以siRNA靶向基因
的鉴定对于阐明SI机制具有至关重要的作用。
3 SI候选基因功能分析
已知SCR-SRK的直接相互作用决定SI反应首
要的信号识别, 那么如何维持这种相互作用的高
度特异性以及新的S单元型如何产生一直都是被
关注的问题, 所以从结构上探究是这两个蛋白中
的哪一部分决定识别特异性就成为研究的关键。
已知SRK的特异性由其胞外域决定(Goring和Roth-
stein 1992; Shiu和Bleecker 2001), 但具体是哪些氨
基酸残基负责这一特性还需在植物中进行大量的
功能试验验证, 包括SRK区域替换及位点定向突
变。然而受繁琐、低效转基因方式和遗传背景的
限制, 这些分析在芸苔属植物和琴叶南芥中进行
都是不切实际的, 但拟南芥的转化能通过农杆菌
介导的沾花法简单、高效地完成, 因此科学家利
用At::SRK-SCR进行了大量的研究。Boggs等
(2009)将eSRK转入拟南芥C24生态型, 发现eSRK中
约100个多态性残基可能负责SI中配体的特异性识
别, 并分别定位于两个不连续的类凝集素亚功能
域内, 包含hvI、hvII和hvIII三个高变区(hypervari-
able regions), 以此为基础通过位点定向诱变构建
一系列突变体, 最终确定只有6~7个氨基酸残基保
守性地被特异性识别所需, 且都集中在类凝集素
功能域2 (lectin-like domain 2, LLD2)的hvI和hvII
中, 于同功SRK中保守。eSRK三维模型中这两个
区域能形成一种类似于“口袋”的结构, 从而结合
SCR, 而hvIII并没有这种特征(Naithani等2007)。
虽然SRK和SCR的相互识别是“自我”花粉抑
制的关键, 但整个自交不亲和反应的完成还需要
其他元件的参与, MLPK (M-locus protein kinase)
(Kakita等2007)和ARC1 (arm repeat containing 1)
(Stone等2003; 蓝兴国等2010)是已知的两个重要
的SI正调控因子, Samuel等(2009)以ARC1的UND
结构域为诱饵, 运用酵母双杂交的方法得到一个
与其相互作用的蛋白Exo70A1。Exo70A1参与调
控胞吐和囊泡运输, 促进微管网络的解聚(Synek
等2006; Samuel等2011; 杨佳等2012)。在芸苔属SI
研究中, ARC1-Exo70A1是已知唯一的SRK下游信
号通路, 但ARC1反义基因的转化只能部分打破SI
(Stone等1999), 所以重组型拟南芥的SI是否能被其
他基因所替代, 是否也依赖于ARC1-Exo70A1都需
要进一步分析。拟南芥中ARC1的同源基因是一个
高度退化的假基因, 具有139 bp的片段缺失且不含
启动子。于是将ARC1近源基因AtPUB17的突变体
与Col-0::SRK-SCR杂交, 其纯和子代与Col-0::SRK-
SCR一致, 均为SI表型; MLPK近缘基因AtAPK1b的
突变体与Col-0::SRK-SCR杂交后也得到同样的
结果, 并没有使SI缺失或弱化(Indriolo等2012;
Kitashiba等2011), 这说明PUB17和APK1b在SI中并
不发挥功能, 推测可能是由于它们在SI中的作用被
其他过量表达的基因活性掩盖, 同时Exo70A1的过
量表达也不会打破或减弱At::SRK-SCR的SI (Indri-
olo等2012; Kitashiba等2011) (图2)。这些基因在芸
苔属及拟南芥中的功能差异表明SRK-SCR的相互
作用在这两个群体中触发不同的信号级联反应,
这很可能是由于生物在进化的过程中基因组加倍
后形成功能冗余, 于是发生了变异 , 包括假基因
的出现和新基因的产生。
4 拟南芥生殖模式的转变
SRK与SCR紧密连锁, 染色体上S-位点内及其
附近基因的重组率远低于其他区域, 这有利于在
进化中保持识别特异性和产生新的S单元型(Ka-
mau和Charlesworth 2005)。同时, SRK与SCR的协
同进化一直都是科学界关注的问题, Guo等(2011)
应用拟南芥、琴叶南芥和Capsella rubella (拟南芥
的近缘物种, 具有SC表型)不同品种中的SRK和
SCR进行系统进化分析, 首次为SRK和SCR的协同
进化提供了遗传学证据, 除此之外, 还发现基因的
复制、倒位和正向选择在这两个基因的进化和产
生新识别特异性的过程中发挥重要的作用。拟南
芥的祖先是SI的, 在漫长的进化过程中, 为了进一
步适应环境, 拟南芥生殖模式逐渐向SC过度, 且多
项研究认为S-位点的失活是其向SC转变的一个关
键步骤(Tsuchimatsu等2010; Tang等2007; Guo等
2009)。但S-位点内基因的突变也并非完全同步,
前文提到某些拟南芥生态型本身就具有完整的内
源性SRK基因(如Wei-1), 只需转化功能性SCR基因
就能获得SI (Tsuchimatsu等2010), 说明SRK和SCR
的变异也存在先后顺序。Shimizu等(2008)的工作
证明S-位点中任意一个等位基因的缺失都对拟南
郝艾馨等: SRK-SCR转基因拟南芥自交不亲和性的研究进展 1117
芥向SC的进化非常关键 , 并且这种缺失大多由
SCR的变异引起。Tsuchimatsu等(2010)研究发现,
欧洲95%的拟南芥生态型中SCR基因末端都存在
213 bp的倒位(图3), 将这种倒位逆转就能使拟南芥
的雄性SI恢复, 也再次证明SCR的变异先于SRK,
这可能是SCR作为SI雄性决定因子的特性导致的,
它能通过花粉和种子两种途径产生变异, 而SRK的
变异只能在种子中产生。
上文提到, At::SRK-SCR中MLPK、ARC1和
Exo70A1的同源基因并没有发挥作用, 这很可能是
因为芸苔属和拟南芥属分属于不同的谱系, 早在
二至四千万年前就发生了分离, 所以参与拟南芥SI
反应的同源基因(或近缘基因)在向芸苔属植物进
化的过程中并没有发生复制, 或者说是SRK的下游
信号通路发生了改变(Kitashiba等2011)。并且, 以
不同地理位置上的拟南芥生态型作为转化受体所
获得的SI强度及稳定性存在差异, 所以Indriolo等
(2012)提出SRK下游信号ARC1的功能在十字花科
中并不保守 , 或者还存在其他备用信号级联蛋
白。但所调查的357个拟南芥生态型均不存在完
整的ARC1基因, 同时, 利用RNA干涉(RNAi)技术
使琴叶南芥中ARC1转录水平下降将导致SI现象的
打破, 说明ARC1在十字花科植物中具有保守的功
能, 虽然Indriolo没有找到ARC1的替代物, 但他认
为一定存在其他独立的SRK下游信号, 并认为包括
拟南芥在内的十字花科植物生殖模式从SI向SC进
图2 SRK-SCR转基因拟南芥(A)和芸苔属植物(B) SI模式图
Fig.2 The SI model of A. thaliana with transgenic SRK-SCR (A) and Brassica (B)
实线和虚线分别表示信号转导和转录水平的相互作用; 灰色代表拟南芥中与芸苔属植物同源或近缘的蛋白质, 且无保守功能。
图3 拟南芥和琴叶南芥S-位点的进化
Fig.3 The evolution of S-locus in A. thaliana and A. lyrata
根据文献(Guo等2011)修改。
植物生理学报1118
化的过程中, ARC1及其替代物的变异发生在前, 经
历一个假性SC的状态, S-位点的变异在后, 从而为
某些拟南芥生态型中ARC1缺失却保留完整的SRK/
SCR提供了证据。当人为地通过向野生型拟南芥
转化SRK-SCR从而逆向进行这一过程时, 能同时获
得3类SI表型, 也更合理地解释了这种SI强度具有
依赖于生态型的特点, 是由不同地理生态型下游
信号元件的独立变异所引起的(Indriolo等2012)。
但总体来讲, 在对“自我”花粉产生抑制时, 不论是
信号级联的积累还是生理和形态的变化, 都与十
字花科植物异交与自交繁殖模式间的转换有关
(Strickler等2013)。
5 结语
十字花科植物SI的研究在过去30年中取得了
许多研究成果, 尤其是近10年来随着SI转基因拟
南芥的建立以及具有天然SI表型的拟南芥属近缘
种(琴叶南芥和Capsella rubella)全基因组测序工作
的完成, 在SI信号转导及生殖模式的进化方面取得
了众多突破性进展, 对SRK的功能研究已经十分透
彻, 而对SRK调控及其下游信号转导的过程仍知之
甚少。虽然对MLPK、ARC1及Exo70A1的研究已
经取得一定进展, 但其同源基因在SRK-SCR转基因
拟南芥中的功能仍需进一步验证和深入的研究。
此外, 已知THL1可以作为SRK的转录抑制物负向
调控SI (Cabrillac等2001; Haffani等2004), KAPP和
SNX1也能与SRK发生互作, 但它们在SI中的确切
功能还不清楚(Vanoosthuyse等2003)。所以未来
SRK下游信号元件的发掘将继续作为SI研究的重
点。依据之前的研究结果, 本研究组应用2D-DIGE
与质谱结合的方法, 分析自交不亲和系植物授粉
前后的差异磷酸化蛋白谱和磷酸化程度差异蛋白
谱, 以期获得与ARC1-Exo70A1并行的其他SRK下
游支路, 并已经取得一定进展(未发表资料)。
应用拟南芥简便的遗传转化方法、丰富的突
变体资源和高效的图位克隆能力, 通过已知突变
体与At::SRKb-SCRb杂交, 评价候选基因在SI反应
中功能的方法已经成形。这些候选基因可以是已
知参与芸苔属SI的同源或近缘基因, 也可以是参与
其他信号转导途径的基因。因为不同信号转导途
径之间往往存在着交叉和重叠, 例如: 植物抗病防
御(pathogen resistance, PR)和SI (Nasrallah 2005;
Jones和Dangl 2006; Sanabria等2008), 这二者的信
号识别受体同属于类受体蛋白激酶(receptor-like
kinase, RLK)家族, 而且都具有钙和胼胝质在细胞
间接触位点的积累以及肌动蛋白细胞骨架与分泌
囊泡的变化, 所以通过这一方法与RNAi等技术结
合验证PR相关基因在SI中的功能已经成为SI研究
的新方向。然而, 一个基因的敲除往往不足以改
变SI表型, 所以对于多个候选基因的干涉也是必要
的。SRK-SCR转基因拟南芥属的分析已基本阐明
了拟南芥的进化过程, 为了解S-位点基因的进化提
供了重要的资源。但更为重要的是, 当十字花科
植物的生殖方式在异交与自交间转换的同时发生
了哪些生理与形态的变化, 为下一步的研究指导
了方向。At::SRK-SCR的建立为SI的研究翻开了新
的篇章, 在未来的分子遗传研究中将有望继续发
挥其优势, 推动SI机制和进化方面的探索并取得更
为丰富的科研进展。
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