全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 5期, 2010年 5月466
百脉根嫁接方法的优化及其在结瘤自调控研究中的应用
李晓琳 1, 孙杰 1,*, 陈爱民 2, 王彦章 2
1石河子大学农学院, 石河子大学新疆生产建设兵团绿洲生态农业重点实验室, 新疆石河子 832000; 2中国科学院上海生命
科学研究院植物生理生态研究所, 植物分子遗传国家重点实验室, 上海 200032
提要: 嫁接试验是研究结瘤自调控的有效方法。本文优化了百脉根的嫁接方法, 并应用该方法初步研究了百脉根突变体rel3
根瘤数目减少的机理。结果表明, rel3突变体根瘤数目减少的表型是由来自于茎的信号决定。
关键词: 百脉根; 结瘤自调控; 嫁接
Optimization of a Grafting Method of Lotus japonicus R. and Its Application in
Autoregulation of Nodulation
LI Xiao-Lin1, SUN Jie1,*, CHEN Ai-Min2, WANG Yan-Zhang2
1College of Agriculture, Shihezi University/Key Laboratory of Oasis Eco-agriculture, Xinjiang Production and Construction Group,
Shihezi, Xinjiang 832000, China; 2National Laboratory of Plant Molecular Genetics, Institute of Plant Physiology & Ecology,
Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, China
Abstract: Grafting is one of effective approaches to study autoregulation of nodulation. A grafting method of
Lotus japonicus was modified and the mechanism of decrease in nitrogen-fixing nodules of L. japonicus rel3
mutant was invesigated. The results indicated that the phenotype of reduced nodule number of rel3 mutant was
in control of shoot-derived signals.
Key words: Lotus japonicus; autoregulation of nodulation; grafting
收稿 2009-12-30 修定 　2010-04-12
资助 新疆生产建设兵团绿洲生态农业重点实验室开放课题
(200503)和 “973”项目(2010CB126501)。
致谢 罗达先生提供百脉根突变体种子, 杨军先生帮助修改文
章。
* 通讯作者(E-mai l: sunji e@shzu .edu .cn; T el : 09 93 -
2 0 5 7 2 0 1 )。
在氮素匮乏的土壤中, 豆科植物能与土壤中的
根瘤菌进行共生相互作用。这种共生作用诱导宿
主植物产生一个全新的根部侧生器官——固氮根
瘤。固氮根瘤是豆科植物在氮贫瘠的土壤中生长
所必需的, 但产生过多的根瘤会抑制植物的生长, 因
此, 根瘤的数目受到严格的调控。其中, 主要的外
部因子是乙烯和硝酸盐(Carroll等1985a, b; Ferguson
和Mathesius 2003; Ferguson等 2005; Lohar等
2009)。而宿主植物能够主动地采用一种称为结瘤
的自我调控或反馈调节机制来控制结瘤数目的多
少。该机制由 2个长距离信号途径组成, 一个来自
于根, 一个源自于茎(Caetano-Anollés和Gresshoff
1991; Oka-Kir和Kawaguchi 2006 )。
豆科植物的自我调控系统若被阻断, 则呈现超
级结瘤表型。目前已发现许多超结瘤突变体, 如百
脉根中的 har1 (Wopereis等 2000; Kawaguchi等
2002)。HAR1的直向同源基因GmNARK (Nishimura
等 2002a; Searle等 2003)、SYM29 (Krusell等 2002)
和SUNN (Schnabel等2005)突变后也都表现出超级
结瘤的表型。在大豆(Delves等 1986; 1987)、百
脉根(Nishimura等2002b; Oka-Kira等2005)和蒺藜
苜蓿(Penmetsa等 2003)中, 嫁接试验被广泛地用来
研究茎对结瘤自我调控的影响。嫁接实验结果表
明, 这些超级结瘤突变体中源自于茎的信号存在缺
陷。百脉根结瘤数增多的突变体 klv与野生型的相
互嫁接实验证明突变体中源自于茎的长距离信号被
削弱(Oka-Kira等 2005)。根瘤数减少的百脉根突
变体 lot1与野生型植株的相互嫁接实验证明, lot1
的结瘤表型是由根信号决定的。突变体 lot1与超
技术与方法 Techniques and Methods
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级结瘤突变体 har1相互嫁接后形成中间数目的根
瘤, lot1har1的双突变形成的根瘤数也在单突变植
株结瘤数之间, 另外 lot1突变体中HAR1基因的相
对表达水平与野生型一样, 证明LOT1可能是在不
同于HAR1所作用的自我调控信号转换途径上起作
用的(Ooki等 2005)。
本实验室对百脉根EMS诱变突变体进行共生
表型筛选鉴定, 获得一个结瘤数目减少的突变体
rel3 (未发表资料)。本文通过突变体 rel3与野生型
相互嫁接, 来研究其根瘤数目减少的表型是受茎信
号还是根信号决定的。
材料与方法
1 植物材料与菌株
植物材料为百脉根(Lotus japonicus R.)野生型
Gifu B-129和突变体 reduced leaflet 3 (rel3)。rel3
突变体是经EMS诱变的百脉根突变体(Gifu遗传背
景), rel3突变体除了基部小叶缺失、小叶变窄、
花不育等非共生表型外, 经鉴定其共生的表型也存
在缺陷, 突变体形成的根瘤数仅为野生型的一半左
右。组成型表达LacZ活性的百脉根中慢生根瘤菌
NZP2235/HemA::LacZ为本实验室保存。
2 培养基和营养液
植物培养基为MS培养基; 根瘤菌的培养基为
TY培养基; 嫁接植株结瘤过程浇灌的无氮营养液为
B+D营养液(Broughton和Dilworth 1971)。
3 实验方法
嫁接试验是研究茎分枝的控制、开花和抗病
性等的重要方法之一, 本文对百脉根的嫁接方法进
行了改进和优化。
3.1 种子灭菌萌发 百脉根种子置于37 ℃培养箱干
燥 24~48 h, 促进种子后熟。然后, 将种子置于液
氮中速冻 60 s, 取出种子; 75%乙醇对种子表面消
毒 60 s, 7%次氯酸钠消毒 15 min, 无菌水清洗 6~8
次。将消毒后的种子铺到1%的水琼脂平板上, 28 ℃
下倒置暗培养约 36 h至出现 1 cm左右的胚根。
3.2 突变体的筛选 由于突变体 rel3是隐性纯合不
育的, 所以必须通过杂合子保种。后续试验也是从
杂合子分离的植株中筛选出突变体进行研究。将
萌发好的种子, 铺到覆有一层滤纸的MS培养基上
(培养基上加一层滤纸更易于后续幼苗的移动) (图
1-a), 在 23 ℃/18 ℃ (昼 /夜)、16 h /8 h (昼 /夜)、
光照强度为 200 μmol·m-2·s-1 光周期条件下培养。
5 d后子叶全部展开, 杂合子与野生型的子叶相似,
子叶呈椭圆, 边缘略向下(图1-b左); 突变体的子叶
狭长, 边缘略上卷, 整个子叶下卷呈拱形(图 1-b
右)。通过辨别子叶筛选出 rel3并重新移置MS培
养基上, 对野生型做同样的处理, 然后培养 3 d。
3.3 突变体与野生型相互嫁接 用手术刀将嫁接苗
从子叶下方色素沉积的部位切开(图 1-b箭头所示
部位), 立刻将茎沉浸在无菌水中(图 1-d)。把长为
0.5~0.8 mm、直径为 0.8 mm的无菌聚乙烯管套
在根上(图1-e), 然后将不同植株的茎再插入聚乙烯
管, 并使茎与根的切口在管内紧密接触(图 1-f)。
之前报道的嫁接多在纸袋或滤纸上进行(Nishimura
等 2002b; Oka-Kira等 2005), 本文直接在培养基上
进行嫁接以减少嫁接过程中对幼苗根系的损伤。
以野生型和 rel3突变体为材料, 相互嫁接分析了
rel3突变体根瘤减少的表现是受根信号还是茎信号
调控。嫁接分 4种组合: 突变体的茎嫁接到野生型
的根上(rel3/WT)、野生型的茎嫁接到突变体的根
上(WT/rel3)和突变体、野生型的自身嫁接(rel3/
rel3、WT/WT)。嫁接好的材料用滤纸遮住子叶
以下部分进行避光, 同时滤纸起到保湿和固定作
用。在 23 ℃/18 ℃ (昼 /夜)、16 h /8 h (昼 /夜)、
光照强度为 200 μmol·m-2·s-1的条件下培养 2周。
3.4 结瘤试验 取培养 7、10、14 d的野生型自
身嫁接幼苗进行嫁接结瘤, 分析不同苗龄进行嫁接
结瘤的成功率。将嫁接后培养 2周的苗剪掉聚乙
烯管口长出的侧根(图2-a), 移到无菌蛭石(蛭石: 珍
珠岩 =3:1)中(图 1-g), 保湿遮光培养 3 d后接菌
(OD600=0 .5)。将过夜培养的根瘤菌 NZP2235/
HemA::LacZ悬浮液, 4 ℃离心(4 000×g) 10 min收
集菌体, 0.9%生理盐水重悬菌体, 然后 4 ℃离心10
min收集菌体, 再用生理盐水或B+D无氮营养液重
悬菌体使OD600在 0.3~0.8之间, 每棵植株淋菌 1
mL, 结瘤期间, 定期浇 B+D无氮营养液。接菌 3
周后分析结瘤情况。实验重复 3 次。
结果与讨论
1 嫁接植株成功结瘤的分析
豌豆的分裂根试验表明, 宿主植物一部分根上
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的结瘤会影响另一部分根后续的结瘤(Kosslak和
Bohlool 1984)。在实验过程中发现, 嫁接苗培养 2
周后, 可以看到部分嫁接植株的聚乙烯管口有新长
出的侧根(图 2-a), 这些侧根来自接穗或砧木。为
了避免来自接穗的侧根影响后续结瘤效果, 将嫁接
苗移入蛭石前需剪掉新生的侧根。在结瘤 3周后,
发现仍有部分植株的聚乙烯管口有侧根并且结瘤
(图 2-b)。因此, 本文仅对嫁接成活并且其聚乙烯
管口没有侧根(图 2-c)或存在侧根但其侧根上并未
结瘤植株作结瘤情况统计。这样就排除了来自接
穗的新生侧根对作为砧木的整个根系结瘤所产生的
影响。在嫁接过程中, 不移动作为砧木的根, 对平
皿中培养基上的幼苗直接进行嫁接, 从而减少了嫁
接过程中对根的损伤, 并使嫁接植物处于一个丰富
的营养条件和稳定的湿度环境中, 嫁接的成活效率
达到90%以上, 最终成功嫁接结瘤植株的比率达到
55.89%。通过实验发现, 聚乙烯管接穗与砧木的
接口处固定的越紧密, 成活的效率越高, 长出侧根
的比率也越低, 最终嫁接成功结瘤的比率越高。
2 不同苗龄野生型自身嫁接植株结瘤的比较
不同苗龄嫁接植株结瘤的分析结果显示, 培养
7、10、14 d进行嫁接的成功率均达到了 90%以
上, 但嫁接后结瘤的成功率分别为 51.5%、63.45%
和 52.72%。这表明培养 10 d的幼苗最适合嫁接。
图 1 百脉根的嫁接流程图
Fig.1 Flow chart of L. japonicus grafting experiments
a: 灭菌萌发后 2 d的种子; b: 用于嫁接的子叶, 箭头指示切割的部位; c: 嫁接时作砧木的根; d: 嫁接时作接穗的茎; e: 嫁接时作砧
木的根, 箭头指聚乙烯管的位置; f: 嫁接后的植株; g: 嫁接植株的蛭石结瘤。
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3 野生型与 rel3突变体嫁接结瘤分析
图3显示, rel3突变体自身嫁接(rel3/rel3)平均
每株结瘤约 19个, 野生型自身嫁接(WT/WT)平均
每株约 32个根瘤。以 rel3突变体的茎做接穗与野
生型的根做砧木相互嫁接(rel3/WT)后接种, 平均结
瘤约21个, 比rel3突变体自身嫁接(rel3/rel3)的结瘤
数稍有增加, 但与野生型自身嫁接(WT/WT)的结瘤
数间存在显著差异。而野生型的茎为接穗与 rel3
突变体的根为砧木嫁接(WT/rel3)后接种, 平均结瘤
约 29个, 与野生型自身嫁接(WT/WT)的结瘤数无
明显差异, 但与突变体自身嫁接(rel3/rel3)的结瘤数
相比存在显著差异。这表明, 突变体 rel3根瘤数目
减少的表型受到茎信号调控。在百脉根中, 发现包
含21个亮氨酸重复序列(leucine-rich repeats, LRRs)
图 2 成功嫁接植株的结瘤分析
Fig.2 Analysis of successful grafting plants inoculated with NZP2235/HemA::LacZ
a: 嫁接 2周后的植株; b: 结瘤不成功的嫁接植株; c: 结瘤成功的嫁接植株。
的受体激酶HAR1参与了结瘤自我调控和硝酸盐对
结瘤的抑制, 被公认为是存在于茎中接收来自根部
结瘤信号的受体(Okamoto等 2009)。那么REL3是
与HAR1相互作用还是在其调控途径之外起作用
的, 还有待于进一步研究和探索。
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图 3 突变体 rel3与野生型相互嫁接后结瘤数
Fig.3 Nodule number of mutual grafting plants
with rel3 and wild type
不同小写字母表示在 0 .0 5 水平有显著差异。
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