全 文 ：第 4 卷
以刀 5年
第 4期
7月
中山大学学报 (自然科学版 )
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农杆菌介导转化豆科牧草百脉根影响因子 `
张振霞 , ,2 , 席嘉宾 ` , 张惠霞, , 储成才 4
( 1
. 中山大学生命科学学院 , 广东 广州 51 0 2 75 ; 2 . 韩山师范学院生物系 , 广东 潮州 521 以 ;1
3
. 广东省畜牧技术推广总站 , 广东 广州 51 05 0 ; 4 . 中科院遗传与发育生物学研究所 , 北京 10 101 )
摘 要 : 对农杆菌介导转化豆科牧草百脉根的相关影响因子进行了实验研究 , 结果表明 : 在百脉根农杆菌转化
体系中 , 以农杆菌 AG LI 菌株 、 子叶转化受体 、 3 d 共培养时间以及 25 州L卡那霉素筛选质量浓度为最佳转化条
件 。 研究还发现 , 头抱霉素对农杆菌 AGL I 菌株的抑制作用要强于狡节霉素。
关键词 : 百脉根 ; 遗传转化 ; 农杆菌介导法 ; 影响因子
中图分类号 : 3Q 34 二 13 文献标识码 : A 文章编号 : 05 29 一 65 79 ( 2加5 ) 阵以拍巧一。
百脉根 肠如 co ~ 遥涵时us L
. 是温带地区常见 的
豆科牧草 , 不仅是牲畜的优良饲料 , 还在土壤改
良 、 水土保持以及生态环境保护方面发挥着积极作
用 。 W e bb [ ’〕早在 1986 年尝试了农杆菌转化百脉根
研究 , 王广立等川用富含硫氨酸的 l oKD 玉米醇溶
蛋白、 eB lu c i 等 3[] 用 俘一 玉米醇溶蛋白和 , 一 玉米
醇溶蛋白转化百脉根 , 在转化植物的叶片中检测富
含硫氨基酸的增加等等 。 但是至 目前有关农杆菌转
化百脉根各种影响因素的系统研究方面还未见相关
报道 。 本研究将对农杆菌转化百脉根时的各种影响
因素做较为系统的研究 , 以构建良好的遗传转化系
统 , 提高百脉根的转化效率 , 为进一步用转基因技
术培育和改良百脉根品种的研究提供更有效的研究
手段 。
1 材料和方法
1
.
1 细菌和质粒
本研究使用了大肠杆菌 scE ha icr hi a col i D SH 。 株
系 、 双元载体 四 in 19 以及农杆菌 雌四灰配纪月姗
t nU 爬faC ~ AG IL
、
EHA 105 和 LB A今牡碎 株系。
p BG A 质粒在大肠杆菌 D E匕a 中保存 。 本研究
使用了含 c aM v 35 启动子调控的拟南芥 GA2 0 一 氧
化酶基因 , 大小为 1 . 158 bK , 为 石缸爪 H 扛酶切的片
段 。 另外还使用了含有 p NOS 启动子控制下的 NP 咫
基因 , 大小为 795 饰。
1
.
2 植物材料与处理
供试种子由中科院遗传所吕德阳老师提供 。 种
子处理方法为先用砂纸打磨后用 甲二 70 % 的酒精消
毒 10 而 n , 然后用 甲= 0 . 1%升汞灭菌 20 而 n , 再用
灭菌水冲洗数次后置于 MS 培养基中。 萌发后取刚
展开的子叶和上胚轴以及第 2 、 3 片真叶以及相应
的茎段作为转化受体 。 组织培养条件为 26 ℃ , 每
日光照 12 h , 光强 2 0以) h 。
1
.
3 培养基
细菌培养基包括 比 培养基闭 , 用于培养大肠
杆菌 ; 花B 培养基 5[] , 用于培养农杆菌 。 植物培养
基包括接种培养基 : Ms 困 ; 共培养基 ; 筛选及分
化培养基以及壮苗培养基几种 。
1
.
4 转化方法
将农杆菌单菌落接种于 20 mL 的花 B 液体培
养基 (含卡那霉素 50 呵mL ) 中 , 28 ℃ (巧。 r/
ha n) 培养 2 一 3 d , 重悬至 0 1巧仪) = 0 . 6 一 0 . 9 ; 将培
养 6 一 7 d 的百脉根无菌子叶 , 取 21 3 部分浸人 M S
液体培养基悬浮的农杆菌培养液中摇动 20 而 n 后 ,
取出用无菌滤纸吸干多余菌液 , 将子叶接种于共培
养基上进行光培养 ; 培养 3 d 后转人筛选培养基
上 , 进行转化体的筛选培养 。 培养条件为温度 25
一 26 ℃ , 日光照 12 h , 光强 2 以X) h 。 4 周后统计
分化率 。 每 4 周换一次新鲜培养基 , 继代 3 次以
上 。 最后将再生苗转人壮苗培养基以诱导生根 。 数
周后将植株移栽至温室中。
1
.
5 实验处理
百脉根子叶对卡那霉素筛选剂的敏感性实验设
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、
10
、
2 5
、
50
、
7 5
、
10 gnI/ L 6个卡那霉素的筛选质量浓度 , 培养基为 M s 培养基 。 实验转化以 咧 2
基因 ( n eo n l y c i n hP os hP to s fe arS 。 2) 作为筛选基因 ;
` 收稿 日期 : 2X( M 一肠 一 24
基金项目 : 珠海市科技计划 (代〕 为 31以犯6 ) 资助项 目
作者简介 : 张振霞 ( 1卯5 年生 ) , 女 , 副教授 , 博士后 ; E一二1: 二84 1 @ 163 . C om
第 4期 张振霞等 :农杆菌介导转化豆科牧草百脉根影响因子
对于头抱霉素和梭节霉素的抑菌效果研究用 30
n喇 L的头抱霉素和竣节霉素作为抑菌剂来研究其
抑制效果 ;不同农杆菌菌株对百脉根分化率的影响
实验采用 AG LI、 E H A 150、 LB A今牡碎 3种根癌农杆
菌菌株进行实验 。 共培养天数对百脉根分化率的影
响实验设 2、 3、 4 d 3个处理 。 不同转化受体材料
设百脉根的叶 、 子叶 、 茎段和胚轴几种材料处理 。
表 2不 同菌株对百脉根转化率的影响
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位以而~ 石朋 ife ic e cn y of L
. 印川衣以山 su
农杆菌菌株 转化数 /个 分化数 /个 分化率 /%
AGL I 们 8 20 . 0土 1 . 7 5
1王阵4( 碎 40 5 1 2 . 5 士 2 . 5
EHA 105 粼 ) 3 7 . 5土 1 . 0
2 结果与分析
2
.
1 百脉根子叶对卡那霉素筛选剂的敏感性
表 l 表明 , 当卡那霉素的处理质量浓度为 25
, 1 19 /L 和 50 1119 /L 时 , 百脉根子叶都具有比较理想的
分化效果 ; 而当处理质量浓度为 or 呵 L 时 , o %
的分化率使得无法产生有效的筛选效果 ; 当卡那霉
素的处理质量浓度为 75 m g /L 时 , 百脉根子叶的分
化率太低 ; 而当卡那霉素的质量浓度升至 10 呵 L时 , 百脉根子叶的外植体出现褐化 、 坏死现象 , 分
化率为零 。
表 1 百脉根对卡那霉素筛选剂的敏感性
T习】 . I E任ce t of se lce ivt e 毋 nt k a nam cy in on e o妙lde o n of
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. 功爪如话以“ ,
卡那霉素质量浓度 转化数 分化数 分化率
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表 3 不 同共培养天数对百脉根转化率的影响
T习〕 . 3 E任茂 t of het ds y s for o c ul恤 初山 A . t助可流 ic sn
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共培养天数 d/ 转化数尹个 分化数 /个 分化率2%
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4 40 2 5
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2
.
5 不同转化受体材料对转化率的影响
表 4 表明 , 在 4 种百脉根受体材料对转化率的
影响中 , 以子叶作为转化受体的最终分化率为最高
(达 20 % ) , 叶的次之 ( 12 . 5% ) , 而以茎段作为受
体 的 分 化 率 为 最 低 ( 5 . 0 % ) , 胚 轴 的 次 低
( 7
.
5% )
。
表 4 不同受体类型对百脉根转化率的影响
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受体类型 转化数 /个 分化数 /个 分化率 /%
子叶 40 8 220 . 0士 1 . 0
胚轴 40 3 7 . 5土 1 . 5
茎段 4() 2 5 . 0士 0 . 95
叶 40 5 12 . 5土 2 . 25
2
.
2 头抱霉素和梭苇舞素的抑菌效果
研究发现 , 筛选培养 4 d 后 , 在含梭节霉素的
培养基上 , 接种农杆菌 A G l 和 E HA 105 菌株的部
分外植体发生污染 , l 周后外植体全部感染 , 2 周
后全部褐化坏死 。 而在含头抱霉素的培养基中 , 2
种菌株均未感染子叶外植体 , 外植体全部生长正
常 。 同时还发现 , 头抱霉素对 A G L I 菌株的抑制效
果要好于对 EHA 105 菌株 。
2
.
3 不同农杆菌菌株对百脉根分化率的影响
表 2 表明 , 接种 A GL I 菌株时 , 百脉根的转化
率远远高于接种 EHA 105 和 L B为种时 菌株 , 达 20 % ,
而后两者的转化率仅分别为 7 . 5%和 12 . 5% 。
2
.
4 共培养天数对转化率的影响
从表 3可以看出 , 在 3 个培养天数的处理中 ,
以 3 d 的共培养效果为最好 , 有 20 % 的外植体可以
分化为再生苗 , 比共培养时间为 Z d 和 4 d 的分化
率高 1倍和 4倍以上 。
3 讨 论
esD
g典笋es 等困认为卡那霉素筛选浓度过高会
影响转化体愈伤的发生和胚状体的诱导 , 百脉根子
叶转化受体也有类似的反应 。 过高的筛选剂浓度虽
然能更有效的得到转化细胞 , 但同时也严重影响转
化细胞的生长和再生能力 。 通过对筛选剂质量浓度
和筛选时间两方面因素的综合考虑 , 本研究认为选
择 25 州L 的卡那霉素浓度作为百脉根子叶转化受体的筛选浓度比较适宜 。
不同抗生素对不同农杆菌的抑菌效果与不同植
物材料有一定的关系。 如王丹等 v[] 人的研究认为竣
苇青霉素比头抱霉素更适合用于农杆菌介导的马铃
薯叶圆片的遗传转化 。 本研究结果表明 , 就百脉根
子叶受体而言 , 头抱霉素对农杆菌两个供试菌株
A GL I 和 E H A 105 都有良好的抑制效果 , 而狡节霉
中山大学学报 (自然科学版 )第 4卷
素则效果不佳 。
研究发现 , 3 d 时间的共培养足以使卡那霉素
抗性基因 喇 n 在百脉根植物基因组中整合并表达 ;
Z d 的共培养时间偏短 , 外源基因不能完全 、 有效
地在植物基因组上整合 ; 但 4 d 共培养时间有点偏
长 , 农杆菌生长过于旺盛 , 以至转化受体转移至筛
选培养基上时农杆菌已很难抑制 , 反而影响了转化
率 。 这与 Ch al ” u 等 s[] 在紫花首楷上 的研究结果 相
似 。
本研究结果来表明 , 百脉根的子叶显然比其它
组织有相对较强的组织分生能力 , 同时 , 就百脉根
的转化而言 , 采用子叶作为转化外植体 , 一方面取
材不受季节限制 , 操作简单 , 便于重复 , 另一方面
转化体系具有再生速度快 , 频率高 , 移栽成活容易
等优点 。
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