全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (7): 648~654648
收稿 2011-03-28　　修定 2011-07-10
资助 黑龙江省博士后科研启动金(LBH-Q08146)和中央高校基
本科研业务费专项资金(DL10CA03)。
* 通讯作者(E-mail: xuzhiru2003@126.com; Tel: 0451-
82191783)。
基因沉默在农业生产中的应用及其相关因子的研究进展
佟玲, 侯杰, 崔国新, 许志茹*, 李玉花
东北林业大学生命科学学院, 哈尔滨15004
摘要: 本文主要介绍了基因沉默在农业生产上的广泛应用, 并对一些与基因沉默相关的因子如miRNA、阿格蛋白(Argo-
naute protein)和Pol IV进行了阐述。
关键词: 基因沉默; miRNA; 阿格蛋白; Pol IV
Application of Gene Silencing in Agricultural Production and Research Prog-
ress of Its Related Factors
TONG Ling, HOU Jie, CUI Guo-Xin, XU Zhi-Ru*, LI Yu-Hua
College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract: This paper mainly introduces the widely application of gene silencing in agricultural production, and
describes a number of factors that are associated with gene silencing, such as miRNA, Argonaute protein and
RNA polymerase IV.
Key words: gene silencing; miRNA; Argonaute protein; Pol IV
基因沉默是近年来在转基因植物中发现的一
种后生遗传现象, 是基因表达调控的一种重要方
式。基因沉默可分为转录水平的基因沉默(tran-
scriptional gene silencing, TGS)和转录后水平的基
因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)。
TGS是由于DNA甲基化、异染色质化及位置效应
等引起。PTGS是RNA水平基因调控的机制之一,
其包括共抑制(cosuppression)、基因静息(quell-
ing)、RNA干涉(RNA interference, RNAi)、病毒诱
导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)
和系统性获得的基因沉默(systemic-acquired silenc-
ing, SAS)等。在农业生产上, 基因沉默作为一种下
调表达技术在作物品质改良研究中得到广泛应
用。近年来, 植物病虫害对农作物造成严重危害, 显
著降低农产品产量和品质, 化学农药对病虫害防治
虽然取得显著的效果, 但有些病毒和害虫对一些长
期使用的药品产生了抗药性, 而基因沉默技术在植
物病虫害治理中具有巨大的应用潜力。然而, 基因
沉默技术同样受到一些因子的制约, 研究并阐明基
因沉默相关因子对基因表达调控作用, 进而可为基
因沉默技术在农业生产上的应用提供理论基础。
1 常见的基因沉默方式
1.1 RNA干涉(RNAi)
RNAi是非常便利的沉默目标基因的途径, 其
机制是利用21~23 bp的小干扰RNA (small interfer-
ing RNA, siRNA)与目标mRNAs特异性的互补配
对而降解目标mRNAs (Tan等2011)。RNAi主要有
以下特征: 第一, RNAi是双链RNA (dsRNA)介导转
录后水平的基因沉默; 第二, 高特异性; 第三, 高效
率(李方华等2010)。使RNAi能高效、特异地阻断
体内特定基因的表达, 从而表现出特定基因缺失
的表型(杨坤等2005)。
1.2 病毒诱导的基因沉默(VIGS)
VIGS是一种有效的基因沉默技术, 该技术有
4个优点: 第一, 方法简单, 通常采用体外转录物的
直接注射、基因枪等方法即可实现; 第二, 能快速
的获得结果, 一般2~3周即可; 第三, 可以沉默多拷
贝基因; 第四, 可以沉默多基因家族(Purkayastha和
Dasgupta 2009)。
1.3 DNA甲基化
DNA甲基化是表观遗传学的重要部分, 同组
蛋白修饰相互作用, 通过改变染色质结构调控基
因的表达(Zhang等2010)。DNA甲基化修饰是真核
佟玲等: 基因沉默在农业生产中的应用及其相关因子的研究进展 649
细胞基因表达调控的特点之一, 通过甲基化和组
蛋白修饰、染色质重组等共同作用, 细胞可以在
不改变DNA核苷酸序列时调控基因在不同细胞和
组织中表达。基因沉默在某些情况下与DNA甲基
化有关, 将与甲基化有关的基因去除, 沉默现象消
除。
1.4 反义RNA技术
反义RNA技术是借助基因重组技术, 根据碱
基互补原理, 用一些与特定RNA或DNA具有互补
序列的小分子RNA, 控制基因表达和参与基因表
达调控。反义RNA技术在农业领域的应用主要有:
第一, 在植物抗病虫中的应用; 第二, 在提高果实
性状及品质中的应用; 第三, 控制雄性不育中的应
用等(张晓辉等2009)。
1.5 hpRNAi技术
利用正义臂及反义臂之间存在一个内含子的
结构可有效的提高基因沉默的效率。这种在植物
中表达的长片段发卡结构的RNA (hairpin RNA,
hpRNA), 在Dicer酶的作用下形成siRNA, 诱导靶
RNA的降解。通过比较不同的RNA干涉技术, 发
现发卡结构RNA是最有效的沉默技术(Wesley等
2001)。
2 基因沉默技术在农业生产中的应用
基因沉默技术在各个领域的应用越来越广泛,
可用于探索未知基因的功能, 又可方便地获得各
种突变的个体。在农作物品质改良和提高作物抗
病虫能力等方面已经显示出其应用潜力。
2.1 在作物品质改良方面的应用
基因沉默技术可以改变植物的某些遗传性状,
主要通过抑制或过表达植物中的某些基因来实
现。利用RNAi技术下调棉花(Gossypium hirsutum L.)
两个关键的脂肪酸脱氢酶基因gsSAD -1和gh-
FAD2-1表达, 会提高棉花种子中人体健康所必须
的硬脂酸与油酸含量。将高硬脂酸含量的转基因
株系与高油酸含量的转基因株系杂交 , 获得了
gsSAD-1和ghFAD2-1两个基因表达水平均同时下
降的后代, 证明了不同基因的沉默效应可以累加
(Liu等2002)。
烟草(Nicotiana tabacum L.)叶片和根中含有
的尼古丁是烟草的主要生物碱。尼古丁对动物心
脏、血管、和大脑等器官有不良影响, 还能作用
于人的神经系统, 刺激神经元分泌多巴胺。多巴
胺是导致吸烟者上瘾的主要物质。因此, 有人想
通过转基因技术获得低尼古丁含量的烟草, 为烟
草消费市场提供一种更为健康的香烟, 以减少尼
古丁对身体的危害。尼古丁由吡咯环和嘧啶环组
成, 吡咯烷环来自二氨腐胺, 后者通过鸟氨酸脱羧
酶(ornithine decarboxylase, ODC)的作用利用鸟氨
酸直接合成。而采用RNAi技术可以干涉烟草
ODC基因表达, 由于ODC转录水平下调导致尼古
丁含量降低(Deboer等2011)。
研究表明, 来自内源反向重复序列的siRNA能
通过嫁接导致叶绿素的合成过程中发挥重要作用
的内源谷氨酸-1-半醛转氨酶基因(glutamate-1-
semialdehyde aminotransferase, GSA)沉默(Kasai等
2011)。因此, 通过研究siRNA转运系统和嫁接技
术结合的实用性技术引起人们的关注。以ACC氧
化酶1 (ACO1)过表达的番茄植株枝条嫁接到对
ACO1有强烈沉默作用的植株根茎上, 可观察到嫁
接导致沉默传递信号, 使原来弱的或效率低的沉
默转变成强的沉默。说明PTGS信号可在细胞间及
植株体内传导 , 从而使整个植物表现基因沉默
(Han和Grierson 2008)。通过嫁接传递基因沉默信
号, 为人们提供了研究与沉默传递相关信号分子
的良好体系。
基因沉默技术在植物淀粉合成和改变植物中
淀粉含量等多方面亦有广泛的应用研究。直链淀
粉因其不易被大肠吸收, 可以防止糖尿病和肥胖
症等慢性疾病发生。柴晓杰等(2005)将控制玉米
支链淀粉合成的SBE基因RNAi体系导入玉米(Zea
mays L.)中, 导致SBE基因表达下调, 同时直链淀粉
含量增加。陈忠正等(2007)通过RNAi沉默小麦
(Triticum turgidum L.)中的两种同功酶基因SBEII a
和SBEII b及马铃薯(Solanum tuberosum L.)中的
SBE I和SBE II基因, 也引起直链淀粉含量大幅度增
加。
咖啡是世界上主要的饮料之一, 但其所含的
咖啡因会刺激兴奋, 容易引起高血压并诱发心脏
病。因此, 制咖啡时去除咖啡因成为重要的制作
工艺环节。Ogita等(2003)利用RNAi技术抑制咖啡
因合成相关的可可碱合成酶基因(CaMXMT1), 咖
啡因含量下降了70%。
植物生理学报650
马铃薯块茎贮存在低温环境中能阻止其萌
芽、也减少病害导致的损失。但低温贮藏使块茎
中还原糖含量迅速上升, 淀粉含量下降, 导致高温
加工时还原糖与游离的氨基酸发生Maillard反应,
产生一种褐色并略带苦味的物质, 严重影响炸薯
条和炸薯片的外观品质和食用品质。酸性转化酶
(acid invertase, AcInv)是植物体内降解蔗糖为还原
糖(葡萄糖和果糖)的关键酶, Bhaskar等(2010)的研
究证明沉默马铃薯中酸性转化酶基因AcInv, 降低
其还原糖含量, 对马铃薯低温糖化改良具有良好
的应用前景, 已成为培育铃薯优良加工品种的一
种重要途径。
2.2 在植物抗病虫基因工程中的应用
植物病毒病是重要的植物病害, 每年致使作
物产量大量减产, 基因沉默技术在这方面的应用
可以帮助人们揭开植物的抗病机制, 为培育出所
需要的优质抗病植株奠定基础。植物抗病虫基因
工程的目的在于通过基因操作向植物导入一些有
用基因, 增强植物对病虫的抗性。
植物中存在一种天然的siRNA介导的病毒防
御机制。在病毒侵染细胞时, 其基因组复制过程
中形成的双链RNA或二级结构折叠形成的部分双
链RNA可以被Dicer酶降解产生siRNA, 抑制病毒
的扩散(Pantaleo等2007; Aliyari和Ding 2009)。如
果在病毒基因组中插入一段植物基因序列, 则其
产生的siRNA可以有效干涉植物内源基因的表达,
即病毒诱导的基因沉默。因此, 通过对不同DNA
病毒和RNA病毒进行修饰, 人们已经开发了多种
VIGS载体, 这些载体在诱导植物基因沉默方面得
到广泛的应用 , 也更利于开发植物中的抗病基
因。大麦条斑花叶病毒(barley stripemosaic virus,
BSMV)具有α、β和γ三重RNA基因组, 该病毒可以
从大麦(Hordeum vulgare L.)叶脉进入叶表皮和叶
肉, 从而进行系统性的传播。由该病毒改造而成
的VIGS载体被广泛地用于大麦抗病基因和小麦抗
真菌病相关基因的功能研究(Scofield和Nelson
2009)。
dsRNA在其他病毒的相关研究中, 也具有广
泛的应用, Waterhouse等(1998)将马铃薯Y病毒(po-
tato virus Y, PVY)辅助因子基因(helper-component,
HC-Pro)转入马铃薯后, 发现马铃薯对PVY产生很
强的抗性。Ma等(2004)设计了水稻矮缩病毒的
RNA干扰序列, 并将其导入水稻中, 引起了水稻对
矮缩病毒具有很强的抗性。牛颜冰等(2011)将携
带有烟草花叶病毒 ( T M V )部分移动蛋白基因
(ΔMP)和黄瓜花叶病毒(CMV)部分复制酶基因
(ΔRep)的表达载体, 采用农杆菌浸润法转化普通烟
草, 获得同时抗CMV和TMV病毒的转基因烟草植
株。
基因沉默技术在植物抗虫基因工程方面也具
有广泛的应用, 线虫中的转录因子MjTis11能导致
线虫胚死亡, 把以该基因为靶基因构建的RNAi载
体转化烟草, 在烟草体内表达能沉默该基因的dsR-
NA, 线虫摄食含该基因dsRNA的细胞质, dsRNA就
会从植物传输到线虫体内, 在线虫体内使靶基因
沉默, 增强植物抗线虫能力。
3 基因沉默相关因子
基因沉默作为一种重要的基因表达调节机制,
其作用方式还受到许多因子的影响, 如: miRNA、
siRNA、hpRNA、Argonaute蛋白、RNA聚合酶
IV、依诺沙星和3D8 VL等, 本文主要针对几种重
要的因子及其在农业生产中的应用进行详细介
绍。
3.1 miRNA
真核生物中存在两种主要的非编码RNA (non-
coding RNA), 它们在真核生物中发挥重要的调控
作用。一类是微RNA (microRNA, miRNA), 另一
类是小干扰RNA (siRNA)。miRNAs是一系列内源
性的小的非编码的调节RNAs, 大小为19~25 nt, 它
是由发卡状的前体经Dicer酶切割后产生的, 在体
内与蛋白质形成核糖核蛋白复合体(miRNP)。最
近的研究发现 , 转录后的基因沉默机制中也有
miRNA参与 , 它们在RNAi途径中发挥作用。
Zhang等(2006a)鉴定出了19个植物物种中的481个
miRNAs, 它们属于37个miRNA家族, 从苔藓、裸
子植物、单子叶植物到双子叶植物, 这些miRNA
家族中的大多数在这些植物中是保守的。对41个
miRNA家族的进一步研究发现, 9个miRNA家族
(miR156/157、172、170/171、165/166、159/319、
396、168、160和390)在多数植物物种中是高度保
守的; 10个miRNA家族(miR394、164、169、
167、162、398、414、393、397和163)在5~9个植
佟玲等: 基因沉默在农业生产中的应用及其相关因子的研究进展 651
物物种中是中度保守的; 另外的16个miRNA家族
(miR95、408、399、158、403、161、406、
173、419、415、413、416、417、418、420和
426)在2~4个植物物种中是低度保守的。miRNAs
能通过抑制转录或者诱导目标mRNA的降解来调
节基因的表达。在植物中, miRNAs参与植物生长
发育、生殖、抗逆等众多过程, 被调控的基因涉
及信号蛋白、酶类、转录因子等。在玉米中 ,
miR172调控性别决定和分生组织活动(Lauter等
2005); 在马铃薯中, miR172启动开花和诱导块茎
的形成(Martin等2009)。miR156是植物中最早被
鉴定的miRNA基因家族之一, 在植物界中高度保
守, 己经在45个不同的植物物种中被鉴定(Zhang等
2006b)。在miR156家族成员中 , miR156b和
miR156c是位于 l号染色体上的串联miRNAs,
miR156b的过表达将导致植物高度的降低和水稻
分孽数的增加(Xie等2006)。
一些miRNAs在植物抗逆和植物激素通路等
信号转导方面也发挥着重要作用(刘萌和周晓阳
2011)。对于抗营养缺乏胁迫, miRNA能调节植物
磷、硫等元素的代谢平衡。研究发现, 拟南芥(Ar-
abidopsis thaliana L.)在受到低磷胁迫时, miR399
在保持体内磷的稳定性中起到重要作用(Sunkar等
2007); miR395在低硫胁迫下被诱导表达, 而在高
硫的条件下不表达(Lappartient等1999)。在受到赤
霉素(GA)、茉莉酸(JA)、脱落酸(ABA)等植物激
素诱导的组织中能检测到miR159、miR393、
miR160和miR164的存在。赤霉素和脱落酸能够诱
导miR159表达, 从而负调控miR159的靶标RNA,
转基因植物中miR159的过量表达导致开花时间延
迟, 进而影响花的发育过程(Achard等2004)。
生长素反应因子(auxin response factor, ARF)
属于转录因子家族, ARF家族的ARF10、ARF16和
ARF17等都是miR160的靶标基因, miR160对ARF
家族基因的调控在植物叶的形态建成、根冠细胞
的正常分化、花器官发育等方面起到重要的作用
(Wang等2005)。拟南芥miR164家族包括3个成员
miR164a、miR164b和miR164c, 分别由MIR164A、
MIR164B和MIR164C这3个基因编码, 其靶基因为
NAC家族6个转录因子(CUC1、CUC2、NAC1、
At5g07680、At5g39610和At5g61430) (Rhoades等
2002)。miR164通过调控这些靶基因影响生长素
梯度、侧根的起始以及花瓣的数量。例如 :
miR164c通过调控转录因子CUC1与CUC2进而控
制花瓣的数目; miR164a和miR164b抑制目标基因
NAC1, 以控制侧根正常的生长发育(Guo等2005)。
miRNA同一家族的不同成员在植物生长发育过程
中行使不同的生物学功能, 说明miRNA的表达调
控具有多种模式。这些研究结果表明, miRNA介
导的RNA沉默在植物内源基因的表达调控层面发
挥作用, 因而在农业生产上具有更加广泛的应用
潜力。
3.2 Argonaute (AGO)蛋白
Argonaute蛋白是RNA诱导的沉默复合物
(RNA-induced silencing complex, RISC)的核心元
件, 是一种在生物体中广泛分布且结构保守的蛋
白质家族, 被比喻成“RISC中的切片机”。AGO是
RNAi所必需的, 参与靶目标mRNA的断裂、翻译
抑制或染色质修饰等, 从而影响基因沉默(Chen和
Yin 2005)。基因组分析表明, AGO家族的成员较
多, 果蝇中有5种, 人类有8种, 拟南芥中有10种, 而
线虫中则多于20种。例如: 果蝇中的AGO21、
AGO22和PIWI, 人类细胞中的PIWI亚族(4个)和
e IF2C/AGO亚族 (4个 ) , 拟南芥中的AGO1、
AGO2、AGO3、AGO4、AGO6和AGO7, 线虫中
的RDE-1、ALG-1、ALG-2、SAGO-1和SAGO-2
等, 其成员与多种生物的RNAi有关, 在生物体发育
过程中发挥功能作用(燕飞和成卓敏2005)。所有
的AGO蛋白都包含有一个与miRNA/siRNAs结合
的PAZ (Piwi Argonaute Zwille)结构域以及一个具
有剪切活性的PIWI结构域 , 这两个结构域对于
AGO蛋白的功能至关重要。AGO蛋白中的PAZ结
构域主要负责微小RNA的识别, PIWI结构域则在
靶mRNA的剪切过程中发挥重要作用。AGO蛋白
选择性地与miRNA/siRNAs结合。PAZ结构域在该
族蛋白与Dicer互作过程中不是必需的, 而PIWI结
构域中的PIWI-box区可直接与Dicer的RNaseⅢ结
构域相互作用, 能促进miRNA/siRNAs的释放(Hut-
vagner和Simard 2008)。
在秀丽线虫中, 缺乏RDE1的突变体不能进行
siRNA指导的RNAi, 但是其miRNA途径却是正常
的(Tabrar等1999)。果蝇的S2细胞系中, 在缺乏
植物生理学报652
AGO2的胚中RNAi被抑制。与此相反, AGO1对于
siRNA介导的RNA降解是非必须的, 但对于积聚稳
定成熟的miRNAs是必须的。人的AGO2能够介导
对靶RNA的剪切, 而AGO1、AGO3和AGO4却没
有表现出切除的活力。由此表明, 虽然阿格蛋白
家族成员具有类似的结构 , 但AGO2很可能是
s iRNA引发的RISC中的一个必须组分 (L iu等
2004)。
AGO蛋白在农业中也具有广泛的应用, 它和
小RNA共同调控植物的组织发育, 共同应对逆境
以及外源病毒的入侵。在拟南芥中鉴定的10个
AGO蛋白的编码基因, 其中AGO7与特异的miR390
相互作用后直接切割TAS3前体RNA的非蛋白编码
序列, 从而产生反式作用的小的干扰RNA (trans-
acting siRNA, tasiRNAs) (Vaucheret 2008)。AGO7
基因参与了植物发育的不同过程, 在拟南芥中, 其
控制植物叶片从幼叶到老叶的转变 (Hunter等
2003), 在百脉根(Lotuscorniculatus L.)中控制复叶
的发育(Yan等2010); 水稻中AGO7同源基因是
SHL4 (SHOOTLESS4), 控制茎尖分生组织(SAM)的
起始(Nagasaki等2007)。
3.3 RNA聚合酶IV
高等植物细胞核内有5个主要的多亚基的RNA
聚合酶, 其中RNA聚合酶I、II和III (Pol I、II和III)
是转录所必须的(Ream等2009); 另外两个非典型
的RNA聚合酶是Pol IVa和Pol IVb, 它们是小RNA
介导的基因沉默途径所必须的, 被定名为细胞核
内的RNA聚合酶IV (Pol IV) (Herr和Baulcombe
2004)。内源RNA介导的DNA甲基化和转基因沉
默等都需要Pol IVa和Pol IVb的参与(Pikaard等
2008)。NRPD1a和NRPD1b分别是Pol IVa和Pol
IVb中最大的亚基, 而NRPD2a和NRPD2b分别是
Pol IVa和Pol IVb中的第二大亚基。NRPD1a和
NRPD1b具有羧基末端结构域(CTDs), 此CTD是叶
绿体4.5S rRNA形成过程所必须的。NRPD1b的
CTD包括一个富含色氨酸和甘氨酸(WG-GW)区
域, 另外, 谷氨酸和丝氨酸(Q-S)丰富的区域也出现
在该CTD末端。WG-GW的修饰可能与阿格蛋白
的相互作用有关(El-Shami等2007)。Q-S区域的作
用现在还不清楚, 其功能可能是增加分子间的相
互作用。CTD介导的相互作用能控制很多过程,
如转录的激活、延伸及一些mRNA的加工步骤
(Phatnani和Greenleaf 2006; Hahn 2004; Shilatifard
2004)。
拟南芥有4个内源性的Dicer酶(DCLs)、6个
RNA依赖的RNA聚合酶(RDRs)和10个阿格蛋白
(AGOs), 这些蛋白均参与miRNA和siRNA介导的
转录水平和转录后水平的基因沉默(Brodersen和
Voinnet 2006; Baulcombe 2004; Chapman和Car-
rington 2007)。在转录水平的基因沉默即RNA介
导的DNA甲基化途径(RdDM)中, 由RDR2产生的
双链RNA经DCL3切割后形成的siRNAs被转载到
AGO4-RISC或AGO6-RISC复合物中, 从而使DNA
上与siRNAs序列互补的胞嘧啶甲基化(Zheng等
2007)。事实上, Pol IVa和Pol IVb是在RNA介导的
DNA甲基化过程中起作用。
Huettel等(2007)筛选了一些基因, 这些基因的
突变能抑制RdDM途径引起报告基因的沉默。在
筛选去阻遏的沉默转基因位点时鉴定了能导致沉
默缺陷(silencing-defective, sde)的突变体, 对这些
突变体进行分析, 鉴定出了NRPD1a的等位基因
sde4, 该实验同时证明了Pol IVa和Pol IVb的突变体
虽然都能导致胞嘧啶的去甲基化, 但是Pol IVa的
突变体能抑制siRNAs的产生, 而Pol IVb的突变体
则无此功能。由此表明, Pol IVa和Pol IVb可能在
RdDM的不同步骤起作用。Pol IVa是多种RNA沉
默途径所必须的, 包括RdDM途径和nat-siRNA
(natural antisense transcript-derived siRNAs)途径,
这些沉默途径能长距离的传播沉默信号(Katiyar-
Agarwal等2007), 而Pol IVb主要在RdDM途径中发
挥作用。实验同时揭示了插入突变形成的nrpd2中
基因沉默也消失, 不形成24 nt的siRNAs, 胞嘧啶甲
基化被抑制。说明nrpd2及nrpd1能抑制胞嘧啶的
甲基化。
Pol IVa和Pol IVb在农业生产中的应用主要体
现在对植物发育方面的调控, 影响植物的开花时
间。在筛选能破坏RNA介导基因沉默突变体的过
程中, 鉴定出两个与开花时间有关的调节子FCA和
FPA, FCA和FPA是Pol IV介导基因沉默中siRNA的
目标基因(Swiezewski等2007)。在短日照条件下,
开花在nrpd1a和nrpd1b中明显延迟。同样的情况
也出现在突变体nrdr2、dcl3、ago4和drm中(Pon-
佟玲等: 基因沉默在农业生产中的应用及其相关因子的研究进展 653
tier等2005)。
4 展望
综上所述, 基因沉默是生物在进化过程中利
用不同机制调节基因表达 , 在防卫外源DNA侵
入、病毒侵染、DNA转座和DNA重排过程中普遍
存在。转基因沉默与基因表达调控、细胞信号传
导密切相关, 可以为培育植物抗病新品种和增加
外源基因表达稳定性等提供新途径, 也可用于人
类疾病的基因治疗。对基因沉默机制的深入研究,
有助于在分子水平上揭示基因表达调控机制, 从
而用于基因功能的研究。虽然自基因沉默现象发
现以来, 共抑制、反义抑制、hpRNAi及VIGS等
RNA沉默技术不同程度上满足了抑制基因表达的
需要, 但这方面的研究还有待于进一步深入。基
因沉默过程中仍然有很多基本问题没有解决, 如
甲基化酶如何与沉默信号及其他内源蛋白相互协
同特异性地对染色体进行修饰; 系统沉默信号由
哪些成分组成, 如何进行传递; 基因沉默与系统防
御信号(如水杨酸)之间存在何种相关性等等。因
此, 未来的植物基因沉默技术应该向更精确、可
控、可反馈调节的方向发展。
参考文献
柴晓杰, 王王武, 关淑艳, 徐亚维(2005). 应用RNA干扰技术降低
玉米支链淀粉含量. 植物生理与分子生物学学报, 31 (6):
625~630
陈忠正, 郭健, 李斌, 文海涛, 赵亮(2007). RNAi沉默淀粉分支酶
sbe3基因对水稻直链淀粉的影响. 食品科学, 28 (7): 291~295
李方华, 侯玲玲, 苏晓华, 郑扬, 庞全海, 关伟军, 马月辉(2010).
RNA干扰的研究进展及应用. 生物技术通讯, 21 (5): 740~745
刘萌, 周晓阳(2011). miRNA在调节植物抗逆等生理功能中的作用.
山东林业科技, (2): 102~105
牛颜冰, 王德富, 姚敏, 闫钊, 由文鑫(2011). 应用RNA沉默技术获
取抗黄瓜花叶病毒(CMV)和烟草花叶病毒(TMV)转基因烟
草. 作物学报, 37 (3): 484~488
燕飞 , 成卓敏 (2005). RNA干扰机制研究进展 . 遗传 , 27 (1):
167~172
杨坤, 王琦, 李艳红(2005). RNA干涉及其在植物功能基因组学研
究中的应用. 植物生理学通讯, 41 (2): 215~218
张晓辉, 邹哲, 张余洋, 李汉霞, 叶志彪(2009). 从反义RNA到人工
miRNA的植物基因沉默技术革新. 自然科学进展, 19 (10):
1029~1037
Achard P, Herr A, Baulcombe DC, Harberd NP (2004). Modulation of
floral development by a gibberellin-regulated microRNA. Devel-
opment, 131 (14): 3357~3365
Aliyari R, Ding SW (2009). RNA-based viral immunity initiated by
the Dicer family of host immune receptors. Immunol Rev, 227
(1): 176~188
Baulcombe D (2004). RNA silencing in plants. Nature, 431 (7006):
356~363
Bhaskar PB, Wu L, Busse JS, Whitty BR, Hamernik AJ, Jansky SH,
Buell CR, Bethke PC, Jiang J (2010). Suppression of the vacu-
olar invertase gene prevents cold-induced sweetening in potato.
Plant Physiol, 154 (2): 939~948
Brodersen P, Voinnet O (2006). The diversity of RNA silencing path-
ways in plants. Trends Genet, 22 (5): 268~280
Chapman EJ, Carrington JC (2007). Specialization and evolution
of endogenous small RNA pathways. Nat Rev Genet, 8 (11):
884~896
Chen F, Yin JQ (2005). Gene expression regulators—microRNAs.
Chin Sci Bull, 50 (13): 1281~1292
Deboer KD, Dalton HL, Edward FJ, Hamill JD (2011). RNAi-medi-
ated down-regulation of ornithine decarboxylase (ODC) leads
to reduced nicotine and increased anatabine levels in transgenic
Nicotiana tabacum L. Phytochemistry, 72 (4-5): 344~355
El-Shami M, Pontier D, Lahmy S, Braun L, Picart C, Vega D, Hakimi
MA, Jacobsen SE, Cooke R, Lagrange T (2007). Reiterated
WG/GW motifs form functionally and evolutionarily conserved
ARGONAUTE-binding platforms in RNAi-related components.
Genes Dev, 21 (20): 2539~2544
Guo HS, Xie Q, Fei JF, Chua NH (2005). MicroRNA164 directs
NAC1 mRNA cleavage to downregulate auxin signals for lateral
root development. Plant Cell, 17 (5): 1~11
Hahn S (2004). Structure and mechanism of the RNA polymerase II
transcription machinery. Nat Struct Mol Biol, 11 (5): 394~403
Han Y, Grierson D (2008). Enhancement of post-transcriptional gene
silencing by grafting. Plant Signal Behav, 3 (1): 30~33
Herr AJ, Baulcombe DC (2004). RNA silencing pathways in plants.
Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 69: 363~370
Huettel B, Kanno T, Daxinger L, Bucher E, van der Winden J, Matzke
AJM, Matzke M (2007). RNA-directed DNA methylation medi-
ated by DRD1 and Pol IVb: A versatile pathway for transcrip-
tional gene silencing in plants. Biochim Biophys Acta, 1769
(5-6): 358~374
Hunter C, Sun H, Poethig RS (2003). The Arabidopsis heterochronic
gene ZIPPY is an ARGOAUTE family member. Curr Biol, 13
(19): 1734~1739
Hutvagner G, Simard MJ (2008). Argonaute proteins: key players in
RNA silencing. Nat Rev Mol Cell Biol, 9 (1): 22~32
Kasai A, Bai S, Li T, Harada T (2011). Graft-transmitted siRNA signal
from the root induces visual manifestation of endogenous post-
transcriptional gene silencing in the scion. PLoS One, 6 (2): 1~6
Katiyar-Agarwal S, Gao S, Vivian-Smith A, Jin H (2007). A novel
class of bacteria-induced small RNAs in Arabidopsis. Genes
Dev, 21 (23): 3123~3134
Lappartient AG, Vidmar JJ, Leustek T, Glass AD, Touraine B (1999).
Inter-organ signaling in plants: regulation of ATP sulfurylase
and sulfate transporter genes expression in roots mediated by
phloem-translocated compound. Plant J, 18 (1): 89~ 95
Lauter N, Kampani A, Carlson S, Goebel M, Moose SP (2005). mi-
croRNA172 down-regulates glossy15 to promote vegetative
植物生理学报654
phase change in maize. Proc Natl Acad Sci USA, 102 (26):
9412~9417
Liu J, Carmell MA, Rivas FV, Marsden CG, Thomson JM, Song JJ,
Hammond SM, Joshua-Tor L, Hannon GJ (2004). Argonaute2 is
the catalytic engine of mammalian RNAi. Science, 305 (5689):
1437~1441
Liu Q, Singh S, Green A (2002). High-oleic and high-stearic cotton-
seed oils: nutritionally improved cooking oils developed using
gene silencing. J Am Coll Nutr, 21 (3): 205~211
Martin A, Adam H, Diaz-Mendoza M, Zurczak M, Gonzalez-Schain
ND, Suarez-Lopez P (2009). Graft-transmissible induction of po-
tato tuberization by the microRNA miR172. Development, 136
(17): 2873~2881
Ma ZL, Yang HY, Wang R, Tien P (2004). Construct hairpin RNA to
fight against rice dwarf virus. Acta Bot Sin, 46 (3): 332~336
Nagasaki H, Itoh J, Hayashi K, Hibara K, Satoh-Nagasawa N, Nosaka
M, Mukouhata M, Ashikari M, Kitano H, Matsuoka M et al
(2007). The small interfering RNA production pathway is re-
quired for shoot meristem initiation in rice. Proc Natl Acad Sci
USA, 104 (37): 14867~14871
Ogita S, Uefuji H, Yamaguchi Y, Koizumi N, Sano H (2003). Produc-
ing decaffeinated coffee plants. Nature, 423 (6942): 823
Pantaleo V, Szittya G, Burgya J (2007). Molecular bases of viral RNA
targeting by viral small interfering RNA-programmed RISC. J
Virol, 81 (8): 3797~3806
Phatnani HP, Greenleaf AL (2006). Phosphorylation and functions of
the RNA polymerase II CTD. Genes Dev, 20 (21): 2922~2936
Pikaard CS, Haag JR, Ream T, Wierzbicki AT (2008). Roles of RNA
polymerase IV in gene silencing. Trends Plant Sci, 13 (7):
390~397
Pontier D, Yahubyan G, Vega D, Bulski A, Sawz-Vasquez J, Hakimi
MA, Lerbs-Mache S, Colot V, Lagrange T (2005). Reinforce-
ment of silencing at transposons and highly repeated sequences
requires the concerted action of two distinct RNA polymerases
IV in Arabidopsis. Genes Dev, 19 (17): 2030~2040
Purkayastha A, Dasgupta I (2009). Virus-induced gene silencing: A
versatile tool for discovery of gene functions in plants. Plant
Physiol Biochem, 47 (11-12): 967~976
Ream TS, Haag JR, Wierzbicki AT, Nicora CD, Norbeck AD, Zhu JK,
Hagen G, Guilfoyle TJ, Pasa-Tolic L, Pikaard CS (2009). Sub-
unit compositions of the RNA-silencing enzymes Pol IV and Pol
V reveal their origins as specialized forms of RNA polymerase
II. Mol Cell, 33 (2): 192~203
Rhoades MW, Reinhart BJ, Lim LP, Burqe CB, Bartel B, Bartel DP
(2002). Rediction of plant microRNA targets. Cell, 110 (4):
513~520
Scofield SR, Nelson RS (2009). Resources for virus induced silencing
in the grasses. Plant Physiol, 149 (1): 152~157
Shilatifard A (2004). Transcriptional elongation control by RNA poly-
merase II: a new frontier. Biochim Biophys Acta, 1677 (1-3): 79~86
Sunkar R, Chinnusamy V, Zhu J, Zhu JK (2007). Small RNAs as big
players in plant abiotic stress responses and nutrient deprivation.
Trends Plant Sci, 12 (7): 301~309
Swiezewski S, Crevillen P, Liu F, Ecker JR, Jerzmanowski A, Dean C
(2007). Small RNA-mediated chromatin silencing directed to the
3 region of the Arabidopsis gene encoding the developmental
regulator, FLC. Proc Natl Acad Sci USA, 104 (9): 3633~3638
Tabrar H, Sarkissian M, Kelly WG, Fleenor J, Grishok A, Timmons L,
Fire A, Mello CC (1999). The rde-1 gene, RNA interference, and
transposon silencing in C. elegans. Cell, 99 (2): 123~132
Tan PH, Yu SW, Lin VC, Liu CC, Chien CFC (2011). RNA interfer-
ence-mediated gene silence of the NR1 subunit of the NMDA
receptor by subcutaneous injection of vector-encoding short hair-
pin RNA reduces formalin-induced nociception in the rat. Pain,
152 (3): 573~581
Vaucheret H (2008). Plant ARGONAUTES. Trends Plant Sci, 13 (7):
350~358
Wang JW, Wang LJ, Mao YB, Cai WJ, Xue HW, Chen XY (2005).
Control of root cap formation by microRNA-targeted auxin re-
sponse factors in Arabidopsis. Plant Cell, 17 (8): 2204~2216
Waterhouse PM, Graham MW, Wang MB (1998). Virus resistance and
gene silencing in plants can be induced by simultaneous expres-
sion of sense and antisense RNA. Proc Natl Acad Sci USA, 95
(23): 13959~13964
Wesley SV, Helliwell CA, Smith NA, Wang MB, Rouse DT, Liu Q,
Gooding PS, Singh SP, Abbott D, Stoutjesdijk PA et al (2001).
Construct design for efficient, effective and high-throughput
gene silencing in plants. Plant J, 27 (6): 581~590
Xie K, Wu C, Xiong L (2006). Genomic organization, differential ex-
pression, and interaetion of SQUAMOSA promoter-binding-like
transcripition factors and microRNA156 in rice. Plant Physiol,
142 (1): 280~293
Yan J, Cai X, Luo J, Sato S, Jiang Q, Yang J, Cao X, Hu X, Tabata S,
Gresshoff PM et al (2010). The REDUCED LEAFLET genes en-
code key components of the trans-acting small interfering RNA
pathway and regulate compound leaf and flower development in
Lotus japonicus. Plant Physiol, 152 (2): 797~807
Zhang B, Pan X, Anderson TA (2006a). Identification of 188 con-
served maize microRNAs and their targets. FEBS Lett, 580 (15):
3753~3762
Zhang B, Pan X, Canno CH, Cobb GP, Anderson TA (2006b). Conser-
vation and divergence of plant microRNA gene. Plant J, 46 (2):
243~259
Zhang D, Ai D, Tanaka H, Hammock BD, Zhu Y (2010). DNA methy-
lation of the promoter of soluble epoxide hydrolase silences its
expression by an SP-1-dependent mechanism. Biochim Biophys
Acta, 1799 (9): 659~667
Zheng X, Zhu J, Kapoor A, Zhu JK (2007). Role of Arabidopsis
AGO6 in siRNA accumulation, DNA methylation and transcrip-
tional gene silencing. EMBO J, 26 (6): 1691~1701