全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 3期, 2010年 3月 241
收稿 2009-11-06 修定 　2010-02-10
资助 国家自然科学基金(30 8 70 1 8 5)。
* 通讯作者(E-mail: wangyong@nankai.edu.cn; Tel: 022-
2 3 5 0 4 3 8 8 )。
紫萍叶状体衰老过程中的内肽酶谱变化和外源L-丝氨酸对内肽酶谱的影响
刘清岱 1,2, 朱晔荣 2, 李洪涛 2, 王勇 2,*
1天津科技大学食品工程与生物技术学院, 天津 300457; 2南开大学生命科学学院, 天津 300071
提要: 采用双向凝胶电泳技术分析紫萍叶状体衰老期间内肽酶同工酶的变化以及外源L-丝氨酸对内肽酶影响的结果表明,
在衰老的紫萍叶状体中检测到9种内肽酶同工酶, 丝氨酸内肽酶EP3可能在叶状体衰老的早期起作用, 而半胱氨酸内肽酶
EP9在第 6天出现, 是衰老后期活性最强的内肽酶。培养液中加入外源的 L-丝氨酸后, 叶状体蛋白质含量下降加剧, 与衰
老相关的内肽酶EP3、EP4和EP9的活性明显增强或提前出现。
关键词: 紫萍; 叶状体; 衰老; 内肽酶; L-丝氨酸
Changes of Endopeptidase Isoenzymes in Spirodela polyrrhiza Thallus during
Senescence and Effect of Exogenous L-Serine on Endopeptidase Isoenzymes
LIU Qing-Dai1, 2, ZHU Ye-Rong2, LI Hong-Tao2, WANG Yong2,*
1College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China; 2College of
Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071, China
Abstract: Changes in endopeptidase isoenzymes of Spirodela polyrrhiza thallus during senescence and L-serine
induced senescence were investigated by two-dimensional electrophoresis. Nine endopeptidases were detected.
Changes of these enzymes activities during senescence showed that EP3 (a serine protease) might play a
significant role in early stage and the EP9 (a cysteine protease), appeared on the 6th day, was the most active
endopeptidase in the late stages of senescence. L-serine treatment of the thallus enhanced the appearance and
increase in the activities of three senescence-related endopeptidases (EP3, EP4, EP9), along with its significant
promotion of decline in protein content.
Key words: Spirodela polyrrhiza; thallus; senescence; endopeptidase; L-serine
蛋白质降解是植物叶片衰老过程中最显著的
事件之一, 其中内肽酶是影响叶片中蛋白质水平的
蛋白酶之一(Buchanan-Wollaston和 Ainsworth
1997)。在植物叶片衰老阶段, 同一组织内所含有
的内肽酶种类及其活性都会发生变化。近年来, 在
黄瓜、香菜和大麦等植物叶片中都曾检测到不同
种类的蛋白酶(Delorme等 2000; 周相娟等 2002;
Parrott等 2005)。
紫萍叶状体是研究植物叶片衰老的一个极佳
材料(Zhu等 2004; Liu等 2006)。由于其叶状体缺
少合成细胞分裂素的能力, 在长日照条件下培养时,
数天内即逐渐衰老以至死亡。但当培养液中添加
细胞分裂素后, 叶状体的衰老不仅受到抑制, 而且
其叶绿素含量、光合作用、鲜重和干重都会增加
(Li等 2003)。
早在 1970年, Shibaoka和 Thimann就发现 L-
丝氨酸具有和细胞分裂素相拮抗的作用, 能够诱导
离体燕麦叶片的衰老。我们前期的研究也表明, 光
呼吸的前期代谢物 L-丝氨酸有显著拮抗细胞分裂
素和诱导衰老的作用(Zhu等 2004)。本文以紫萍
叶状体为材料, 采用检测蛋白酶活性的双向电泳技
术研究了紫萍衰老过程中内肽酶的变化以及 L-丝
氨酸对内肽酶变化的影响。
材料与方法
实验材料为浮萍科(Lemnaceae)紫萍属紫萍
[Spirodela polyrrhiza (L.) Schleid.]的 P143品系。
叶状体的分离和具体的培养方法参照Zhu等(2004)
文中的方法。在长日照条件下(16 h光照、8 h黑
暗, 光照强度约为45 μmol·m-2·s-1), 将去除根和囊的
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叶状体置于培养液中进行培养, 每隔 2 d取样 1次
用于分析测定。
紫萍叶状体粗酶液的提取参考Jiang等(1999)
文中的方法。样品经液氮处理后, 加入 2倍体积
的蛋白提取缓冲液(50 mmol·L-1 Tris-HCl, pH 7.5)
充分研磨和匀浆后以 13 000×g于 4 ℃条件下离
心 20 min, 取上清液备用。蛋白质含量测定参
照Bradford方法进行, 以牛血清白蛋白作为标准
蛋白。
内肽酶同工酶分析采用双向电泳的方法(刘清
岱等 2005)。粗酶液的上样量为 15 μg, 第一向采
用等电聚焦电泳, 第二向采用明胶 -SDS-PAGE, 经
复性、酶反应和氨基黑染色等步骤, 分析凝胶上的
蛋白酶活性斑点。
做蛋白酶抑制剂对紫萍内肽酶活性影响的实
验时, 在内肽酶同工酶分析的复性缓冲液和酶反应
缓冲液中分别加入以下蛋白酶抑制剂(张鹏等
2007): 2 mmol·L-1丝氨酸型内肽酶抑制剂(PMSF)、
2 mmol·L- 1金属型内肽酶抑制剂(EDTA)和 25
μmol·L-1半胱氨酸型内肽酶抑制剂(E-64)。
结果与讨论
1 紫萍叶状体衰老过程中可溶性蛋白质含量的变
化
由图1可见, 紫萍叶状体可溶性蛋白质含量随
着培养时间的延长而呈下降趋势。在培养第 4天,
图 1 紫萍叶状体中可溶性蛋白质含量的变化
Fig.1 Change of soluble protein content
in S. polyrrhiza thallus
可溶性蛋白质的降解速度较快。当培养液中加入
1 mmol·L-1 的 L-丝氨酸时, 可溶性蛋白质含量下降
速度明显增大; 第12天的可溶性蛋白质含量已降低
至新鲜叶状体的 32%。
2 紫萍叶状体衰老过程中内肽酶同工酶的变化
由图 2可见, 在紫萍叶状体的衰老过程中, 新
鲜的叶状体中仅检测到3个活性较低的内肽酶活性
斑点, 即 EP1、EP2和 EP3。叶状体在长日照条
件下继续培养 2 d后, 出现新的内肽酶 EP4, 同时
EP3的活性明显增强。内肽酶谱变化最明显的时
图 2 紫萍叶状体衰老过程的内肽酶同工酶谱变化
Fig.2 Change of electropherogram of endopeptidase (EP)
isoenzymes of S. polyrrhiza thallus during senescence
a: 新鲜的叶状体; b: 培养 2 d; c: 培养 4 d; d: 培养 6 d; e: 培养
10 d; f: 培养 12 d。
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期是培养第 4天的叶状体, 凝胶上共出现 8个内肽
酶活性斑点, 其中 EP5、EP6、EP7和 EP8是新出
现的内肽酶。随后内肽酶含量下降, 第 6天后凝胶
上仅有 4个清晰的内肽酶。在叶状体衰老的后期
(第 10天和第 12天), 内肽酶谱变化又趋于稳定,
EP3、EP4和 EP9 3种同工酶均出现在酶谱上。
EP9是最后出现的内肽酶(第6天), 这是叶状体衰老
后期活性最强的内肽酶(第 12天)。
EP3、EP4、EP9是叶状体衰老后期的 3种
活性较强的内肽酶, 新鲜的叶状体中EP3活性较低,
而EP4和EP9是衰老过程中新出现的内肽酶, 据此
我们认为, 这3种内肽酶均是与衰老相关的蛋白酶,
它们在紫萍叶状体衰老中起作用。为进一步确定
叶状体内肽酶的类型, 我们又采用蛋白酶抑制剂对
内肽酶的特性进行分析的结果(图3)表明: EP3是丝
氨酸蛋白酶, EP4是金属蛋白酶, EP9是半胱氨酸
蛋白酶。采用这种方法初步确定其它几种活性较
弱的内肽酶均为丝氨酸蛋白酶。
图 3 3种蛋白酶抑制剂对紫萍叶状体内肽酶同工酶谱的影响
Fig.3 Effects of three protease inhibitors on the electropherogram of endopeptidase isoenzymes of S. polyrrhiza thallus
a: 对照; b: EDTA处理; c: PMSF处理; d: E-64处理。
在紫萍叶状体衰老的不同时期, 内肽酶的种类
有较大的差异。叶状体衰老的早期, 丝氨酸内肽酶
EP3是活性最强的内肽酶。第 4天出现的内肽酶
EP5、EP6、EP7和 EP8等均为丝氨酸蛋白酶。
丝氨酸型内肽酶是一类蛋白酶家族, 参与植物超敏
反应、信号转导、衰老、蛋白质降解与加工等
一系列过程。在黄瓜叶片于暗中诱导衰老过程中,
共检测到6条内肽酶同工酶, 其中4条为丝氨酸类型
内肽酶(张鹏等 2006)。本文体系中检测出的丝氨
酸内肽酶数量较多, 且 EP3在第 2天就有较强的活
性。Wang等(2004)认为丝氨酸内肽酶是椰菜小花
采后衰老的早期活性较强的蛋白酶, 1 d后其活性
即达到了最大值。根据实验可以认为, 丝氨酸内肽
酶可能是紫萍叶状体衰老的早期起作用的蛋白酶。
一般认为紫萍叶状体衰老可以分为可逆衰老
和不可逆衰老两个阶段(Liu等 2006)。叶状体进入
不可逆衰老阶段后, 内肽酶的数量趋于稳定, 可检
测到 EP3、EP4、EP9 3种活性较强的内肽酶。
而不可逆衰老阶段叶状体蛋白质的含量下降可能与
这三种内肽酶的关系密切。
此外, 半胱氨酸蛋白酶是报道最多的随着衰老
活性而增强的蛋白酶, 是参与植物细胞程序性死亡
(PCD)中的重要蛋白酶。半胱氨酸蛋白酶 EP9出
现在衰老的第6天, 即紫萍叶状体进入不可逆的衰
老阶段; 而在衰老的后期, EP9活性明显增强。这
说明半胱氨酸蛋白酶在紫萍叶状体衰老的后期作用
明显, 可能参与细胞程序性死亡的过程。
3 L-丝氨酸对紫萍内肽酶谱的影响
由图 4可见, 3种与叶状体衰老相关的内肽酶
EP3、EP4、EP9均受外源的 L- 丝氨酸的促进。
L-丝氨酸处理后第 4天的内肽酶谱与衰老后期的
酶谱类似, 凝胶上出现 EP3、EP4和 EP9 3个内肽
酶的活性斑点, 其中丝氨酸内肽酶EP3的活性相对
较强。随着衰老时间的延长, 半胱氨酸蛋白酶EP9
是活性最强的内肽酶。在紫萍叶状体的衰老体系
中, EP9一般出现在第 6天(图 2), 而经 L-丝氨酸处
理的 EP9在第 2天就出现。一般认为在植物中发
现的编码半胱氨酸蛋白酶的基因启动子中常含有胁
迫响应元件, 例如与衰老相关的基因SAG12启动子
带有响应衰老信号(Gan和Amasino 1995)。据此
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图 4 L-丝氨酸诱导紫萍叶状体衰老过程中
的内肽酶同工酶谱变化
Fig.4 Changes of electropherogram of endopeptidase
isoenzymes of S. polyrrhiza thallus during
senscence induced by L-serine
a: 培养 2 d; b: 培养 4 d; c: 培养 6 d; d: 培养 8 d。
可以认为紫萍中半胱氨酸蛋白酶EP9的提前出现,
说明衰老信号可以受 L-丝氨酸诱导。
参考文献
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