全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (5): 703–714　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2016.0066 703
收稿 2016-02-25　　修定 2016-04-14
资助 国家“863”计划项目(2013AA102605-05)、国家自然科学
基金项目(31360272)和国家转基因生物新品种培育科技重
大专项(2016ZX08010003-009)。
* 共同第一作者。
** 通讯作者(E-mail: dgzhao@gzu.edu.cn)。
转杜仲几丁质酶基因EuCHIT1番茄提高对灰霉病的抗性
郭林霞1,*, 董旋1,*, 赵德刚1,2,**
贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院1山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室, 2贵州省山地生
态与农业生物工程2011协同创新中心, 贵阳550025
摘要: 通过农杆菌介导法将杜仲几丁质酶基因EuCHIT1遗传转化‘Micro-Tom’番茄, 经筛选和PCR鉴定获得38株转基因植
株。对野生型和转EuCHIT1番茄几丁质酶活性、灰霉病抗性、保护酶活性以及病程相关蛋白基因表达水平等进行分析, 结
果表明, 转EuCHIT1番茄植株几丁质酶活性为2 059.48 U·g-1 (FW), 较野生型高62.14%, 差异达到极显著水平。对野生型和转
EuCHIT1番茄植株接种灰霉菌后, 转EuCHIT1番茄发病时间比野生型推迟3 d。分别对未接种和接种灰霉菌6 d后的野生型和
转EuCHIT1番茄SOD、POD、CAT活性和MDA含量分析表明, 接菌前, 转EuCHIT1番茄植株中POD活性为2 825.85 U·g-1 (FW),
比野生型高48.63%; MDA含量为21.84 nmol·g-1 (FW), 比野生型低28.25%; 而SOD和CAT活性与野生型相比无显著差异。接
菌后, 转EuCHIT1番茄植株中SOD、POD和CAT活性分别为510.44、5 423.92和603.59 U·g-1 (FW), 分别比野生型高19.48%、
116.08%和53.80%; MDA含量为26.49 nmol·g-1 (FW), 比野生型低37.65%。说明EuCHIT1基因表达增强了番茄植株的抗氧化
能力, 从而减少灰霉病对番茄的损伤。病程相关蛋白基因表达分析表明, 接菌前, 转EuCHIT1番茄中PR-1a、PR-2和PR-5基
因表达量均高于野生型, 分别为野生型的2.23、11.69和1.80倍, PR-NP24表达量与野生型无显著差异; 接菌后, 转EuCHIT1番
茄的PR-1a、PR-2、PR-NP24和PR-5表达量均极显著高于野生型, 分别是野生型的4.35、10.37、16.58和5.02倍。上述研究结
果说明, 转EuCHIT1基因番茄提高对灰霉病抗性, 与保护性酶活性提高以及病程相关蛋白基因表达上调有关。
关键词: 杜仲; 几丁质酶基因; 番茄; 灰霉菌; 抗病性
番茄灰霉病是造成番茄减产、品质下降的一
种世界性重要病害(Morgan 1984), 一般危害造成
减产20%~30%, 严重时可高达50%以上, 对番茄生
产构成极大威胁(纪军建等2012)。自20世纪80年
代开始, 番茄灰霉病在我国发生蔓延, 已成为番茄
生产的限制性障碍(陈双臣等2007)。国外主要通
过控制温度、湿度, 培育壮苗等栽培措施降低番
茄灰霉病的发生(Morgan 1984), 我国目前是以化
学防治为主。长期不合理的化学药剂使用导致病
原菌抗药性增加, 同时也造成了一定程度的农药
污染(侯晓丹等2007)。在病害防治措施中, 培育抗
灰霉病番茄新品种是最经济有效的方法, 而利用
基因工程技术将抗病基因导入番茄中, 是抗病作
物育种的一种新方法。
杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)是我国特有的
传统名贵中药材树种, 具有抗菌消炎等功效。刘
小烛等(1994)从杜仲皮中分离纯化获得杜仲抗真
菌蛋白(eucommia antifungal protein, EAFP), 能显
著抑制木霉、棉花枯萎病、烟草黑茎病和小麦赤
霉病菌丝的生长。Huang等(2002)对杜仲皮蛋白作
进一步研究发现2个具有几丁质结合结构的杜仲
抗真菌蛋白EAFP1和EAFP2, 能抑制来自番茄、棉
花、小麦、烟草和马铃薯等植物病原真菌的生
长。本研究团队前期从杜仲皮中分离纯化获得第
3个杜仲抗真菌蛋白EAFP3, 能有效抑制黄曲霉菌
丝生长(Liu和Zhao 2008)。
几丁质酶可水解真菌细胞壁的主要成分几丁
质。研究表明, 导入几丁质酶基因可增强作物对
灰霉菌等真菌病害的抗性(Punja和Raharjo 1996;
Tabei等1998)。Punja和Raharjo (1996)将烟草几丁
质酶基因导入胡萝卜, 转基因植株对灰霉菌等真
菌病害抗性显著增强, 其病斑大小和发病率显著
低于野生型。Tabei等(1998)把来源于水稻的几丁
质酶基因rcc2整合到黄瓜基因组中, 发现转基因黄
瓜能有效抵御灰霉菌的侵染。Chen等(2009)将水
稻几丁质酶基因CHI转化番茄, 发现转基因番茄较
野生型对灰霉病有较强的抗性, 表明几丁质酶基
因的导入能够有效提高植物对灰霉菌的抗病性。
Broglie等(1991)将菜豆几丁质酶基因CH5B导入烟
草, 转基因烟草植株较野生型对立枯丝核菌表现
出较高抗性。Datta等(2001)将水稻几丁质酶基因
RC7导入水稻, 转基因水稻对水稻纹枯病表现出一
植物生理学报704
定的抗性, 但不同转基因株系之间由于几丁质酶
蛋白水平不同, 对水稻纹枯病的抗性也不同。Ko-
vacs等(2013)将2个水稻几丁质酶基因rcc2和rcg3
通过农杆菌介导转化法转化香蕉, 转基因香蕉对
黑条叶斑病具有较高抗性, 说明几丁质酶基因的
表达可以提高植物对其他真菌病害的抗病性。随
着对几丁质酶抗病作用机理研究的深入, 以及转
基因技术的完善和成熟, 通过基因工程技术培育
出抗病的转几丁质酶基因作物, 将成为防治真菌
病害的有效途径。本研究将杜仲几丁质酶基因
EuCHIT1转化番茄, 以期获得抗灰霉病的转基因
植株, 创制抗病番茄新种质, 并对其抗病性和抗
病机理进行研究, 为抗灰霉病番茄育种提供理论
指导。
材料与方法
1 实验材料
野生型番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)为
‘Micro-Tom’。杜仲几丁质酶基因EuCHIT1 (KJ-
413008.1)由本研究团队克隆并保存(基因克隆部分
另行发表)。质粒pCAMBIA1301, 大肠杆菌(E. coli)
菌株DH5α和农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌
株LBA4404由贵州大学农业生物工程研究院保存,
灰霉菌(Botrytis cinerea)由贵州省烟草科学研究院
惠赠。One Step Cloning Kit购自Vazyme公司;
KOD-Plus-Neo购自TOYOBO东洋坊(上海)生物科
技有限公司; BglII、BstEII、KpnI、Premix Ex
Taq、Trizol、反转录试剂盒均购自TaKaRa公司;
植物总DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公
司; SYBR Green PCR Master Mix购自ABI公司; 所
用引物均由Invitrogen公司合成; 超氧化物歧化酶
(superoxide dismutase, SOD)、过氧化物酶(peroxi-
dase, POD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)和丙二醛
(malondialdehyde, MDA)测定试剂盒均购自苏州科
铭生物技术有限公司。
2 实验方法
2.1 植物表达载体构建
采用一步克隆法构建35S启动子驱动的杜仲
几丁质酶基因EuCHIT1植物表达载体pCAM-
BIA1301-35S-EuCHIT1 (图1)。使用BglII和BstEII
2种限制性内切酶酶切质粒pCAMBIA1301 (赵楠
等2006), 酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离, 回
收质粒pCAMBIA1301大片段(9.8 kb)。根据本实
验室克隆的杜仲几丁质酶基因EuCHIT1序列, 参照
Vazyme公司试剂盒说明书要求设计扩增引物, 分
别在引物5′端添加线性化pCAMBIA1301末端15 bp
同源序列以及BglII和BstEII限制性酶切位点, 上游
引物P1: 5′-ACTCTTGACCATGGTAGATCTTATG-
GCGAAGACTAGTAGAAACGCAC-3′, 下游引物
P2: 5′-GGGGAAATTCGAGCTGGTCACCTATG-
GAACCCATAAATCTCAGGAAG-3′, 以本实验室
保存的pGEM-T-EuCHIT1质粒为模板, 进行PCR扩
增, 扩增基因片段长度为1 029 bp。使用KOD-
Plus-Neo进行扩增, 扩增反应条件如下: 94°C 2
min; 98°C 10 s, 55°C 30 s, 68°C 30 s, 35个循环; 4°C
保温。反应完毕, 取4 μL扩增产物跑1.0%琼脂糖凝
胶电泳, 紫外灯下检测结果。剩余扩增产物经琼
脂糖凝胶回收后与线性化pCAMBIA1301质粒由
ExnaseII进行重组反应, 转化大肠杆菌DH5α。在
含100 mg·L-1 Kan的LB平板培养基上筛选阳性克
隆, 提取重组质粒使用KpnI酶切验证。
2.2 番茄遗传转化
参照本课题组前期番茄遗传转化方法(赵岑
等2012)略有改动, 取饱满的番茄种子于自来水下
冲洗30 min后, 在超净工作台上用75%酒精浸泡30 s,
倒掉废液, 再加入有效氯为10%的NaClO溶液浸泡
20 min, 无菌水洗涤5次后播种于MS培养基(MS+
30.0 g·L-1蔗糖+8.0 g·L-1琼脂粉)上, 培养条件为光
照培养室28°C, 光/暗为16 h/8 h的光周期培养。待
8~10 d后, 子叶展开真叶未长出时, 切取子叶和下
图1 pCAMBIA1301-35S-EuCHIT1的T-DNA结构
Fig.1 T-DNA structure of pCAMBIA1301-35S-EuCHIT1
郭林霞等: 转杜仲几丁质酶基因EuCHIT1番茄提高对灰霉病的抗性 705
胚轴作为外植体, 其中子叶去除叶尖和叶柄后将
其切成2~3块, 下胚轴去除茎尖生长点后切成6~8
mm小段。将切下的外植体接种于预培培养基
(MS+20.0 g·L-1蔗糖+2.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1
IBA+100 μmol·L-1 AS+8.0 g·L-1琼脂粉)上, 置于
28°C, 恒温箱暗培养。2 d后将其置于农杆菌重悬
液(MS+20.0 g·L-1蔗糖+2.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1
IBA+100 μmol·L-1 AS)侵染8 min (OD600=0.5), 接种
于共培养基(MS+20.0 g·L-1蔗糖+2.0 mg·L-1 6-BA+
0.5 mg·L-1 IBA+100 μmol·L-1 AS+8.0 g·L-1琼脂粉)
上 , 置于28°C暗培养3 d。转移至筛选培养基
(MS+20.0 g·L-1蔗糖+2.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1
IBA+10 mg·L-1 Hyg+100 mg·L-1 Tim+8.0 g·L-1琼脂
粉) (赵楠等2006)中, 在28°C, 光/暗为16 h/8 h的光
周期培养。待抗性芽长至1~2 cm时自基部切下, 去
除表面愈伤组织, 移至生根培养基(1/2MS+10.0
g·L-1蔗糖+0.2 mg·L-1 IBA+100 mg·L-1 Tim+6.0 g·L-1
琼脂粉)进行生根培养。待再生苗长至5 cm后炼
苗, 并移栽至预先处理好的混合土(黄土:营养土:
珍珠岩=2:1:1, 混匀后用0.3%的KMnO4消毒)中
培养。
2.3 转基因番茄植株PCR鉴定
按天根生化科技有限公司植物总DNA提取试
剂盒步骤提取抗性植株D N A。在距 p C A M -
BIA1301质粒BglII酶切位点上游105 bp的35S启动
子区内设计一条上游引物P3: 5′-GACGTAAGG-
GATGACGCACAAT-3′, 在EuCHIT1基因序列内部
设计一条下游引物P4: 5′-TATGGAACCCATA-
AATCTCAGGAAG-3′。PCR扩增产物大小为1 098
bp。使用Premix Ex Taq进行扩增, 扩增条件为:
98°C 10 s, 55°C 30 s, 72°C 1 min, 30个循环; 4°C保
温。反应完毕, 取4 μL扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶
中电泳, 紫外灯下检测结果。
2.4 EuCHIT1基因表达对番茄几丁质酶活性的影响
分别取3株不同植株5~6叶期的野生型和转
EuCHIT1番茄植株至上向下数第3片叶测定番茄中
总几丁质酶活性。参照Li等(2009)和Zeng等(2015)
的方法制备胶体几丁质和提取粗蛋白。称取0.1 g
番茄叶片用液氮研磨至粉末状, 加入2 mL蛋白提
取缓冲液(0.05 mol·L-1 NaAc, pH 5.0; 100 μmol·L-1
PMSF), 至冰上提取1 h, 13 400×g, 4°C离心15 min,
取上清, 4°C保存备用。几丁质酶活性测定参照
Mauch等(1984)的方法。反应混合物中含400 μL粗
蛋白提取液、400 μL 0.1mol·L -1磷酸钾缓冲液
(KPB, pH 6.4)和400 μL胶体几丁质(10 mg·mL-1),
37°C水浴1 h, 13 400×g, 常温离心15 min, 取上清。
向上清中加入100 μL 1%蜗牛酶溶液, 37°C水浴30
min, 加入200 μL饱和硼酸钠溶液(pH 10.2), 沸水浴
3 min, 冷却至室温, 加入 3 mL 1%二甲氨基苯甲醛,
37°C水浴20 min。取200 μL至96孔板中, 测定其在
540 nm波长下的吸光值。一个几丁质酶活性单位
(U)定义为每克鲜植物组织37°C下反应1 h, 水解胶
体几丁质生成1 μg N-乙酰葡萄糖胺的酶量。重复
测定3次。
2.5 植株灰霉病抗性鉴定
采用离体叶片接种法(Kovacs等2013), 分别剪
取30株不同植株5~6叶期的野生型和转EuCHIT1番
茄植株各30片生理状态一致相同部位的叶片至
0.7%的水琼脂培养基上, 用湿润无菌脱脂棉包裹
叶柄, 取50 μL孢子浓度为5×105 cfu·mL-1的灰霉菌
分生孢子悬浮液于叶片正面, 置于20°C条件下培
养。以无菌水接种为对照, 测定接菌后4 d野生型
和转基因番茄叶片病斑直径, 作为灰霉病感染程
度的指标(Liu等2016)。重复测定3次。
2.6 保护酶活性的测定
分别取3株不同植株5~6叶期未接种和接种灰
霉菌6 d后的野生型和转EuCHIT1番茄植株至上向
下数第3片叶, 参照苏州科铭生物技术有限公司试
剂盒说明书测定SOD、POD、CAT活性和MDA含
量。分别测定样品在560、470、240、532和600
nm波长下的吸光值, 计算SOD、POD、CAT活性
和MDA含量。重复测定3次。
2.7 病程相关蛋白基因表达分析
根据NCBI和SGN数据库中报道的番茄病程
相关蛋白基因Pathogenesis-related protein 1a (PR-1a)、
Pathogenesis-related protein 2 (PR-2)、Thaumatin-like
protein NP24 (PR-NP24)、Thaumatin-like protein 5
(PR-5)序列和番茄内参基因Clathrin adaptor com-
plexes (CAC)序列, 设计各基因的real-time PCR扩
增引物, 以番茄CAC为内参基因(Exposito-Rodri-
guez等2008), 分析各基因相对表达量。设计的引
物序列见表1。分别取3株不同植株5~6叶期的未
植物生理学报706
接种和接种灰霉菌6 d后的野生型和转EuCHIT1番
茄植株至上向下数第3片叶0.1 g, 采用Trizol法提取
总RNA, 参照TaKaRa公司说明反转录为cDNA。
利用SYBR Green实时定量PCR染料法对接菌前、
后野生型和转基因番茄中病程相关蛋白基因进行
real-time PCR分析。参照ABI公司说明书, 按照
ΔΔCT法计算各基因的相对表达量。每个样品设置
3个重复。
实验结果
1 EuCHIT1基因表达载体构建及对番茄的遗传转化
采用一步克隆法构建35S启动子驱动的杜仲
几丁质酶基因EuCHIT1植物表达载体pCAM-
BIA1301-35S-EuCHIT1 (图1)。提取阳性大肠杆菌
质粒, 使用KpnI进行酶切鉴定, 酶切产物经电泳检
测显示, 重组质粒被KpnI切为9 211 bp和1 577 bp两
条DNA片段(图2-A), 与预期结果相符。将验证正
确的重组质粒转化根癌农杆菌LBA4404感受态细
胞, 对筛选获得的单菌落使用引物P3、P4进行菌液
PCR鉴定, 电泳结果显示获得一条1 098 bp的特异
性条带(图2-B), 与目的片段大小一致。
以‘Micro-Tom’番茄无菌苗子叶和下胚轴为外
植体(图3-A), 采用根癌农杆菌介导法将含有质粒
载体pCAMBIA1301-35S-EuCHIT1的农杆菌菌液
对番茄进行感染, 共培养3 d (图3-B)后转入筛选培
养基上培养2~3周(图3-C), 外植体边缘出现绿色愈
伤组织, 经继代培养诱导产生抗性芽(图3-D), 将
1~2 cm的抗性芽自基部切下, 于生根培养基上诱
导生根(图3-E), 待再生苗长至5 cm后炼苗并移栽
至预先处理好的混合土中培养(图3-F)。
表1 番茄病程相关蛋白基因real-time PCR引物序列
Table 1 Primer sequences of pathogenesis-related protein genes for real-time PCR
基因名称 登录号 引物序列(5′→3′)
CAC SGN-U314153 CCTCCGTTGTGATGTAACTGG
ATTGGTGGAAAGTAACATCATCG
PR-1a X71592.1 GATGTGGGACGATGAGAAGCAATG
GTTGCATCGAACCCTAGCACAACCT
PR-2 M80608.1 CAGATTTCACTTCCGTATGCTCTT
CCATCCACTCTCTGACACAACTAT
PR-NP24 AF093743.1 GAGGGGAACTAAGATGGCACGTAT
CTCCACCACAATCACCAGTCTGAC
PR-5 AJ277064.1 TGTCATCCAATTCAATGCACAGCC
CAGTAGGACCACATGGACCGTGAT
图2 pCAMBIA1301-35S-EuCHIT1重组质粒酶切鉴定及农杆菌菌液PCR鉴定
Fig.2 Enzyme digestion and PCR identification for Agrobacterium strains of pCAMBIA1301-35S-EuCHIT1
A: 重组质粒酶切鉴定, M: λDNA/HindIII, 1: KpnI单酶切; B: 含有pCAMBIA1301-35S-EuCHIT1农杆菌菌液PCR检测, M: DNA DL2000,
2: pCAMBIA1301-35S-EuCHIT1的PCR扩增。
郭林霞等: 转杜仲几丁质酶基因EuCHIT1番茄提高对灰霉病的抗性 707
剪取经由潮霉素筛选获得的抗性植株叶片,
提取DNA进行PCR鉴定。转基因植株可扩增得到
1 098 bp的特异性条带, 而野生型植株没有扩增出
特异性条带(图3-G), 说明杜仲几丁质酶基因Eu-
CHIT1已经整合到番茄基因组中, 统计共获得38株
转基因番茄植株。
2 EuCHIT1基因表达对番茄几丁质酶活性的影响
对野生型和转EuCHIT1番茄的几丁质酶活性
进行分析, 结果表明转EuCHIT1番茄植株中几丁质
酶活性为2 059.48 U·g-1 (FW), 而野生型植株中几丁
质酶活性为1 270.16 U·g-1 (FW), 比野生型高62.14%,
差异达到极显著水平(图4)。说明EuCHIT1基因在
番茄中的表达可以增加番茄植株中几丁质酶活性。
图3 农杆菌介导的番茄愈伤遗传转化过程及PCR鉴定
Fig.3 The process of genetic transformation of tomato and PCR identification
A: 培育无菌苗; B: 共培养; C: 筛选培养; D: 抗性芽分化; E: 抗性苗生根; F: 抗性植株移栽; G: 转基因植株的PCR鉴定; M: DNA
DL2000; P: 质粒; WT: 野生型植株; 1~6: 转基因植株。
图4 野生型及转EuCHIT1番茄植株中几丁质酶活性
Fig.4 Chitinase activities in wild-type and
transgenic tomato plants
WT: 野生型植株 ; TP: 转基因植株 ; **表示差异极显著
(P<0.01); *表示差异显著(P<0.05); 下同。
植物生理学报708
3 EuCHIT1基因表达对番茄灰霉病抗性的影响
分别对野生型和转EuCHIT1番茄离体叶片接
种灰霉菌, 在接种灰霉菌2 d后, 野生型番茄叶片出
现水浸状病斑, 而转基因番茄叶片未出现病斑(图
5-A); 接菌4 d后, 转基因番茄叶片开始出现病斑(图
5-B); 接菌5 d后, 野生型番茄叶片病斑已扩散到其
他未接菌小叶, 而转基因番茄叶片病斑未扩散到
其他未接菌小叶(图5-C); 野生型番茄叶片在接菌8
d后叶片全部染菌, 而转基因番茄则在接菌10 d后
叶片才出现全部染菌现象。在接菌4 d后对叶片病
斑直径统计结果表明, 转基因番茄叶片病斑直径
平均为6.93 mm, 野生型叶片病斑直径为9.40 mm,
转基因叶片上的病斑直径比野生型小26.28%, 差
异达到极显著水平(图6)。转EuCHIT1番茄不仅发
图5 野生型及转EuCHIT1番茄对灰霉病的抗病性
Fig.5 The inoculation of wild-type and transgenic tomato plants
A: 接菌2 d后的叶片; B: 接菌4 d后的叶片; C: 接菌5 d后的叶片。
郭林霞等: 转杜仲几丁质酶基因EuCHIT1番茄提高对灰霉病的抗性 709
病时间比野生型推迟3 d, 同时对灰霉菌具有显著
抑制作用, 说明转EuCHIT1番茄比野生型更能抗番
茄灰霉病。
4 EuCHIT1基因表达对番茄保护酶活性的影响
通过对未接种和接种灰霉菌6 d后的野生型和
转EuCHIT1番茄植株中SOD、POD、CAT活性和
MDA含量分析表明, 接菌前, 转EuCHIT1番茄植株中
POD活性为2 825.85 U·g-1 (FW), 比野生型高48.63%,
差异达到显著水平(图7-B); MDA含量为21.84 nmol·g-1
(FW), 比野生型低28.25%, 差异达极显著水平(图
7-D); 而SOD和CAT活性与野生型相比无显著差异
(图7-A和C)。接菌后, 转EuCHIT1番茄植株中SOD
和CAT活性分别为510.44 U·g-1 (FW)和603.59 U·g-1
(FW), 比野生型高19.48%和53.80%, 差异达显著水
平(图7-A和C); POD活性为5 423.92 U·g-1 (FW), 比
野生型高116.08%, 差异达极显著水平(图7-B); MDA
含量是26.49 nmol·g-1 (FW), 比野生型低37.65%, 差
异达到显著水平(图7-D)。说明EuCHIT1基因在番
茄的表达可以增强番茄植株的抗氧化能力, 从而
减少灰霉病对番茄的损伤。
5 EuCHIT1基因表达对番茄病程相关蛋白基因表
达的影响
对未接种和接种灰霉菌6 d后的野生型和转
EuCHIT1番茄中病程相关蛋白基因表达分析表明,
接菌前, 转EuCHIT1番茄植株中PR-1a、PR-2和
PR-5基因表达量均高于野生型, 其中PR-1a和PR-2
表达量分别是野生型的2.23倍(图8-A)和11.69倍
(图8-B); PR-5表达量是野生型的1.80倍(图8-D); 而
PR-NP24表达量与野生型无显著差异(图8-C)。接
菌后, 转EuCHIT1番茄植株的PR-1a、PR-2、PR-
NP24和PR-5表达量均极显著高于野生型, 分别是
图6 接菌4 d后野生型及转EuCHIT1番茄叶片病斑平均直径
Fig.6 Mean diameter of necrotic lesion in Botrytis cinerea-in-
oculated tomato blade 4 d after inoculation
图7 灰霉病对野生型和转EuCHIT1番茄保护性酶活性的影响
Fig.7 Determination of protective enzymes in Botrytis cinerea-inoculated tomato plants
A: SOD活性; B: POD活性; C: CAT活性; D: MDA含量。
植物生理学报710
野生型的4.35、10.37、16.58和5.02倍(图8)。说明
EuCHIT1基因在番茄中的表达可以提高番茄植株
中病程相关蛋白基因的表达, 从而增强转基因番
茄植株的抗病性。
讨　　论
利用基因工程技术获得抗灰霉病植物, 已在黄
瓜(Tabei等1998)、葡萄(Renault等2000)等植物中有
所应用, 主要是转化几丁质酶基因、病原相关蛋
白、多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PGIP等(Tabei等
1998; Bi等1999; Powell等2000)。Kishimoto等
(2004)将Class III几丁质酶基因CHI2导入黄瓜, 对
转基因黄瓜进行灰霉病抗性鉴定表明, 转CHI2基
因黄瓜对灰霉病抗性比野生型强, 且叶片中几丁
质酶活性高于野生型, 但CHI2的表达不稳定, 其抗
性随接种时间的延长而降低。类似研究在油菜(蓝
海燕等2000)、小麦(刘伟华等2003)等作物中也获
得了成功, 但大多存在外源基因在受体植株中表
达不稳定、抗病效果不显著的缺点(毛碧增等2003;
陈双臣等2007)。寻找新的、抗真菌病害能力强的
基因, 通过转基因技术导入植物中, 是一条解决植
物真菌病害的有效途径。本研究将杜仲几丁质酶
基因EuCHIT1转化‘Micro-Tom’番茄, 获得转Eu-
CHIT1番茄植株, 接种灰霉菌后, 与野生型植株相
比, 转EuCHIT1番茄不仅发病时间比野生型推迟,
而且对灰霉菌具有显著的抑制作用, 说明转Eu-
CHIT1番茄比野生型更能抗番茄灰霉病。
植物抵御病害时, 细胞内会产生一系列活性
氧簇(reactive oxygen species, ROS), 如O2·¯、H2O2等
活性氧积累, 打破自由基产生和清除的平衡, 使植
物细胞膜系统受损, 造成细胞膜通透性增大、离
子外渗, 致使植株死亡等(黄世文等2008)。SOD、
POD和CAT是植物细胞抵御病害的主要保护性酶
类, 在清除自由基、阻止自由基形成和缓解植物
病害方面起到重要作用(Bowler等1992; Sancho等
1996; 刘西莉等2000)。麦麦提艾力·热合曼等
(2014)对番茄幼苗喷洒灰霉菌激活蛋白后72 h发
现, 实验组番茄幼苗中POD酶活性比对照组提高
106%。秦利军等(2014)对NrCN基因超量表达的烟
草植株接种TMV后发现, 在接种TMV的0~3 d内, 转
NrCN烟草植株中的SOD和POD酶活性显著高于野
生型植株, 在接种TMV后5 d, 转NrCN烟草植株中
图8 野生型和转EuCHIT1番茄植株中病程相关蛋白基因相对表达量分析
Fig.8 Relative expression level of pathogenesis-related protein genes in tomato plants
A: PR-1a相对表达量; B: PR-2相对表达量; C: PR-NP24相对表达量; D: PR-5相对表达量。
郭林霞等: 转杜仲几丁质酶基因EuCHIT1番茄提高对灰霉病的抗性 711
的CAT酶活性达到最高值, 表明转NrCN烟草植株
能够通过提高保护酶活性来增强植株对病害的抗
性。研究表明, 在接菌前, 转EuCHIT1番茄植株中
POD活性显著高于野生型; 而SOD和CAT活性与野
生型相比无显著差异。接菌后, 转EuCHIT1番茄植
株中SOD、POD和CAT活性显著高于野生型。
MDA是膜脂过氧化的重要产物之一, 其积累会加
剧细胞膜损伤 , 可作为膜脂过氧化作用的指标
(Marnett 2002; 王彩霞等2014)。Liu等(2016)研究
发现, 对转SpMYB烟草植株接种尖孢镰刀菌4周后,
转基因植株中的SOD和POD酶活性均高于野生型,
MDA含量显著低于野生型。研究表明, 在接菌前
和接菌后, 转EuCHIT1番茄植株中的MDA含量均
显著低于野生型。说明由于EuCHIT1在转基因番
茄植株中的表达, 提高了其体内的SOD、POD及
CAT活性, 从而使转基因番茄植株具有较高的保护
酶活性和活性氧清除能力, 能够更加高效的清除
体内的自由基并阻止自由基的形成, 防止膜脂过
氧化积累较多的MDA, 减少细胞膜受损程度。
病程相关蛋白(pathogenesis related protein,
PRs)是一类植物在受到病原菌侵染时诱导产生的
水溶性蛋白, 与植物抗病性密切相关(Kavroulakis
等2006)。研究表明, 病程相关蛋白在植物防御系
统中被诱导表达, 并参与植物对病原菌的防卫反
应(Aime等2008)。Benito等(1998)对野生型番茄叶
片接种灰霉菌后发现, PR-1a和PR-2在诱导后大量
表达。Qin等(2015)对转NrCN烟草接种TMV 48 h
后发现, 转基因烟草植株中PR-1a表达量大幅度提
高。研究表明, 在接种灰霉菌后6 d, 转EuCHIT1番
茄植株的PR-1a和PR-2表达量均极显著高于野生
型, 说明PR-1a和PR-2表达量上调可以提高转基因
番茄对灰霉病的抗病性。Pressey (1997)从番茄果
实中分离获得PR-NP24蛋白, 实验表明PR-NP24蛋
白对灰霉菌的生长具有抑制作用。李俊州等
(2014)报道内生细菌EBS05可诱导番茄植株中
PR-1和PR-2持续增量表达, 并激活PR-5基因表达,
从而提高番茄对番茄黄化曲叶病毒的抗性。研究
表明, 接菌前, 转EuCHIT1番茄植株中PR-5基因表
达量比野生型高; 而PR-NP24表达量与野生型无显
著差异。接菌后, 转EuCHIT1番茄植株的PR-NP24
和PR-5表达量均极显著高于野生型。说明PR-NP24
和PR-5表达量提高可以增强转基因番茄的抗病
性。转EuCHIT1番茄植株对灰霉病具有抗性的原
因可能是由于转入EuCHIT1基因后提高了转基因
植株中病程相关蛋白基因的表达量, 从而提高了
转基因番茄植株对灰霉病的抗性。
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Transgenic tomato plants expressing a Eucommia ulmoides chitinase gene Eu-
CHIT1 and their resistance to Botrytis cinerea
GUO Lin-Xia1,*, DONG Xuan1,*, ZHAO De-Gang1,2,**
1The Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region, Ministry of Education,
2Guizhou 2011 Collaborative Innovation Center for Mountain Ecology and Agro-Bioengineering, College of Life Sciences and In-
stitute of Agro-Bioengineering, Guizhou University, Guiyang 550025, China
Abstract: We tansformed Eucommia ulmoides chitinase gene EuCHIT1 into tomato ‘Micro-Tom’ via Agrobac-
terium-mediated method and obtained 38 transgenic plants by screening and PCR identification. The chitinase
activities, resistance to Botrytis cinerea, protective enzyme activities and relative expression level of pathogen-
esis-related protein genes in wild-type and transgenic plants were investigated. The results indicated that chiti-
nase activities in transgenic plants were 62.14% higher than that in wild-type, reached to 2 059.48 U·g-1 (FW).
The transgenic plants not only delayed the occurring of Botrytis cinerea disease 3 d compared to wild-type, but
also exhibited higher resistance to pathogens infected. The SOD, POD, CAT activities and MDA contents in
wild-type and transgenic plants were determined before and 6 days after inoculation with Botrytis cinerea. The
results showed that the POD activities in transgenic plants were 48.63% higher than that in wild-type, reached
to 2 825.85 U·g-1 (FW); MDA contents in transgenic plants were 28.25% lower than that in wild-type, reached
to 21.84 nmol·g-1 (FW) before inoculating pathogen. The SOD and CAT activities had not significant difference
between wild-type and transgenic plants. However, after inoculating to Botrytis cinerea, the SOD, POD and
CAT activities in transgenic plants were 19.48%, 116.08% and 53.80% higher than that in wild-type, respective-
ly, reached to 510.44, 5 423.92 and 603.59 U·g-1 (FW). And the MDA contents in transgenic plants were 37.65%
lower than that in wild-type, reached to 26.49 nmol·g-1 (FW), which indicated that transgene EuCHIT1 en-
hanced the antioxidant capacity, and reduced damage. Relative expression level of pathogenesis-related protein
genes PR-1a, PR-2 and PR-5 in transgenic plants were respectively 2.23, 11.69 and 1.80 folds than that in wild-
type before inoculating pathogen. The relative expression level of PR-NP24 in transgenic plants had no signifi-
cant difference compared to wild-type. However, after inoculating Botrytis cinerea, the expression level of PR-
1a, PR-2, PR-NP24 and PR-5 in transgenic plants was up-regulated 4.35, 10.37, 16.58 and 5.02 folds than wild-
type, respectively. The results suggested that EuCHIT1 increased relative expression level of pathogenesis-
related protein genes in transgenic plants, thereby enhanced disease resistance of transgenic plants.
Key words: Eucommia ulmoides; chitinase gene; tomato; Botrytis cinerea; disease resistance
Received 2016-02-25 Accepted 2016-04-14
This work was supported by the National “863” Projects (Grant No. 2013AA102605-05), the National Natural Science Foundation of China (Grant
No. 31360272) and the Genetically Modified Organisms Breeding Major Projects of China (Grant No. 2016ZX08010003-009).
*Co-first author.
**Corresponding author (E-mail: dgzhao@gzu.edu.cn).