全 文 ：【实验研究】
杜仲、千年健对去卵巢大鼠骨质疏松症的
治疗作用及其机理探讨

张 颖1，Gary Guishan Xiao2，荣培晶3，刘梅洁1，汪文莱1，王少君1，于智敏1，
刘 红1，潘静华1，于 峥1，赵宏艳1，鞠大宏1△
(1．中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700;2． Osteoporosis Research Center，
Creighton University ，USA;3．中国中医科学院针灸研究所，北京 100700)
摘要:目的:探讨具有温补肾阳作用的单味中药杜仲、千年健对去卵巢所致大鼠骨质疏松症的治疗作用及其机理。方法:将
72 只雌性 Wistar 大鼠随机分为空白对照组、假手术组、模型组、阳性对照组、杜仲组以及千年健组 6 组。给药 3 个月后，采用骨组
织形态计量学方法对不脱钙骨切片进行形态计量，免疫组化和原位杂交法检测大鼠胫骨 OB 和 MSC OPG、RANKL 蛋白及其 mRNA
表达。结果:与模型组相比，杜仲组、千年健组胫骨 TBV %显著增高，TRS%明显降低，千年健组 TFS%、MAR、OSW 明显降低，杜仲
组无显著性变化;千年健组 OB 和 MSC OPG 蛋白及其 mRNA 的表达显著升高，RANKL 蛋白及其 mRNA 表达明显降低;杜仲组 OB
和 MSC RANKL 蛋白及其 mRNA 表达明显降低。结论:千年健不仅可以增加 OB 和 MSC OPG 蛋白及其 mRNA 表达，还能抑制
RANKL 蛋白及其 mRNA 的表达，而杜仲是通过抑制 OB 和 MSC RANKL 蛋白及其 mRNA 表达达到治疗骨质疏松症作用的。
关键词:杜仲;千年健;骨质疏松症;OPG;RANKL
中图分类号:R285． 5 文献标识码:B 文章编号:1006-3250(2011)09-960-03
基金项目:科技部科研院所社会公益研究专项(2005DIB1J168)
绝经后骨质疏松症(PMOP)是一种与衰老有关
的常见病，主要发生在绝经后妇女。由于雌激素缺
乏导致骨量减少及骨组织结构变化，伴有骨脆性增
加及易导致骨折的一种慢性疾病，属中医“痹证”、
“骨痿”等范畴。中药杜仲、千年健均有补肾健骨的
作用。如《神农本草经》记载杜仲药效为“补中，益
精气，坚筋骨……久服轻身耐老”。《饮片新参》记
载千年健的功效为“强筋骨，治肢节酸疼”。基于以
上认识，本实验以去卵巢大鼠为模型，以探讨杜仲和
千年健对骨质疏松症的治疗作用和机理。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 动物 选用雌性 Wistar 大鼠 72 只，清
洁级，体重 230g ～ 270g，由中国人民解放军军事医
学科学院实验动物中心提供(动物许可证号 SCXK-
(军)2002-001)。动物于中国中医科学院中医基础
理论研究所清洁级实验动物室内饲养(实验动物室
许可证号 SYXK(京)-2005-0024)。
1． 1． 2 药物 杜仲购自四川省宜宾市中宏药
业有限公司，经中国中医科学院中药研究所生药室
鉴定，为 杜 仲 科 (Eucomiaceae) 杜 仲 属 杜 仲
Eucommia ulmoides Oliv． 的干燥树皮。千年健购自
广西平安堂药业有限责任公司，经中国中医科学院
中药研究所生药室鉴定，为天南星科(Araceae )千
年健属千年健 Homalomena occulta(Lour．)Schott 的
干燥根茎。以上各药加水煎煮，药液浓缩至 1g 生
药 /ml 的浓度。
1． 1． 3 主要试剂 大 鼠 护 骨 素 (Osteopro-
tegerin，OPG)、细胞核因子-κB 受体活化因子配基
(Receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)免疫组
化试剂盒:美国 Santa cruze;大鼠 OPG、RANKL 原位
杂交试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供;
盐酸四环素由欣惠泽奥科技有限公司公司提供。
1． 1． 4 主要仪器 OM2563 冰冻切片机:美国
TBS 公司;Reicheit-Jung2040 切片机:德国;Qwin 图
像分析仪系统:德国 Leica 公司;Wellwash 4 Mk2 洗
板机:美国 Thermo 公司;Multiskan Mk3 酶标仪:美
国 Thermo 公司。
1． 2 方法
1． 2． 1 分组及处理 选将 72 只大鼠随机分为
3 组，其中空白对照组 12 只，假手术组 12 只和造模
组 48 只。造模组大鼠用戊巴比妥钠麻醉后摘除双
侧卵巢［1］，假手术组只摘取少量脂肪组织。术后 1
个月再将造模组大鼠随机分为模型组、阳性对照组、
杜仲组、千年健组 4 组，每组 12 只。然后开始灌胃
给药，杜仲组、千年健组为 1g 生药 /mL 的水煎剂，给
药体积为 5． 6mL /kg 体重，即给药剂量均为 5． 6g 生
药 / kg 体重;阳性对照组给予 0． 008mg /mL 己烯雌
酚，给药体积为 5． 6mL /kg 体重，即给药剂量为
0. 0448mg /kg 体重。空白对照组、假手术组、模型组
则灌服等体积的蒸馏水。以上灌胃给药 3 个月，1d
1 次，连续 6d，休息 1d。大鼠处死前 15d 和前 3d 腹
腔注射盐酸四环素 30mg /kg 体重，对骨进行荧光标
记。给药结束后，各组大鼠以 45mg /kg 剂量的戊巴
比妥钠腹腔注射麻醉，股动脉取血。大鼠处死后取
右侧胫骨制作不脱钙骨切片，取左侧胫骨制作脱钙
的冰冻切片。
1． 2． 2 指标的检测方法 骨组织形态计量学
指标的测定:取右侧胫骨近端 1 /3，除净周围附着的
软组织，采用塑料包埋方法制作不脱钙骨切片:一张
切片进行甲苯胺蓝染色，另一张切片直接用于荧光
观察。采用 Leica Qwin 图像分析系统，按章明放等
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中国中医基础医学杂志
Chinese Journal of Basic Medicine in Traditional Chinese Medicine
2011 年 9 月第 17 卷第 9 期
September 2011 Vol． 17. No． 9
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人的方法对不脱钙骨切片进行形态计量［2］。
成骨细胞(OB)和骨髓基质细胞(MSC)OPG、
RANKL 蛋白及其 mRNA 表达的检测:取左侧胫骨
近端 1 /3，按照文献［3］中所述方法进行标本处理，采
用免疫组化方法检测 OB 和 MSC OPG、RANKL 蛋白
的表达，采用原位杂交法检测其 mRNA 表达。并用
Leica Qwin 图像分析系统对 OPG、RANKL 蛋白及其
mRNA 表达阳性密度进行计量。
1． 2． 3 统计学方法 实验结果以 珋x ± s 表示，
采用单因素方差分析处理，组间两两比较采用 q 检
验。
2 结果
2． 1 杜仲、千年健对卵巢切除大鼠胫骨骨组织
形态计量学指标的影响
2． 1． 1 杜仲、千年健对卵巢切除大鼠胫骨骨小
梁体积百分比(TBV %)的影响 表 1 显示，模型组
大鼠胫骨 TBV %较假手术组明显降低。杜仲组、千
年健组 TBV % 显著高于模型组，明显低于假手术
组。阳性对照组 TBV %显著高于模型组，与假手术
组相比无显著性差异。
表 1 各组大鼠胫骨 TBV%的变化
组 别 例数 TBV%
空 白 对 照 组 12 28． 08 ± 7． 26
假 手 术 组 12 27． 18 ± 8． 78
模 型 组 12 8． 95 ± 3． 04＊＊
阳 性 对 照 组 12 23． 61 ± 4． 71△△
杜 仲 组 12 13． 56 ± 4． 90＊＊△
千 年 健 组 12 13． 35 ± 6． 04＊＊△
注:与假手术组比较:* P ＜ 0． 05，＊＊ P ＜ 0． 01;与模型组比较:△ P ＜
0． 05，△△ P ＜ 0． 01(下同)
2． 1． 2 杜仲、千年健对卵巢切除大鼠胫骨骨小
梁吸收表面百分比(TRS%)的影响 表 2 显示，与
假手术组相比，模型组大鼠胫骨 TRS% 显著升高。
杜仲组、千年健组 TRS%明显低于模型组，明显高于
假手术组。与模型组相比，阳性对照组 TRS% 显著
降低，与假手术组相比无显著性差异。
2． 1． 3 杜仲、千年健对卵巢切除大鼠胫骨骨小
梁形成表面百分比(TFS%)、骨小梁矿化率(MAR)
的影响
表 2 各组大鼠胫骨 TRS%的变化
组 别 例数 TRS%
空 白 对 照 组 12 3． 56 ± 1． 47
假 手 术 组 12 3． 40 ± 1． 54
模 型 组 12 9． 31 ± 2． 22＊＊
阳 性 对 照 组 12 3． 28 ± 1． 31△△
杜 仲 组 12 5． 82 ± 1． 47＊＊△△
千 年 健 组 12 6． 05 ± 1． 81＊＊△△
表 3 显示，模型组大鼠胫骨 TFS%、MAR 较假
手术组显著增高，千年健组 TFS%、MAR 明显低于
模型组，而杜仲组无显著性变化。与假手术组相比，
杜仲组、千年健组 TFS%、MAR 明显增高。阳性对
照组 TFS%、MAR 与模型组相比明显降低，与假手
术组相比无显著性差异。
2． 1． 4 杜仲、千年健对卵巢切除大鼠胫骨骨皮
质矿化率(mAR)和骨皮质类骨质平均宽度(OSW)
的影响 表 4 显示，模型组大鼠胫骨 mAR 和 OSW
皆高于假手术组。与模型组相比，千年健组和 OSW
明显降低，mAR 无显著性差异，杜仲组 mAR 和 OSW
均无显著性改变;与假手术组相比，杜仲组和千年健
组 mAR 明显升高，OSW 均无显著性差异。阳性对
照组的 mAR 和 OSW 与模型组比较，显著降低，与假
手术组相比无显著性差异。
表 3 各组大鼠胫骨 TFS%和 MAR 的变化
组 别 例数 TFS% MAR(μm /d)
空 白 对 照 组 12 8． 23 ± 2． 69 1． 30 ± 0． 18
假 手 术 组 12 7． 40 ± 2． 41 1． 38 ± 0． 16
模 型 组 12 14． 54 ± 3． 31＊＊ 1． 86 ± 0． 23＊＊
阳 性 对 照 组 12 7． 72 ± 2． 66△△ 1． 32 ± 0． 22△△
杜 仲 组 12 14． 01 ± 3． 81＊＊ 1． 88 ± 0． 29＊＊
千 年 健 组 12 11． 72 ± 3． 12＊＊△ 1． 67 ± 0． 18＊＊△
表 4 各组大鼠胫骨 mAR 和 OSW 的变化
组 别 例数 mAR(μm /d) OSW(μm)
空 白 对 照 组 12 2． 40 ± 0． 54 5． 65 ± 1． 34
假 手 术 组 12 2． 28 ± 0． 47 6． 20 ± 1． 29
模 型 组 12 3． 03 ± 0． 60＊＊ 7． 77 ± 1． 64 *
阳 性 对 照 组 12 2． 15 ± 0． 70△△ 6． 37 ± 1． 42△
杜 仲 组 12 2． 90 ± 0． 67 * 6． 56 ± 1． 48
千 年 健 组 12 2． 66 ± 0． 38 * 6． 29 ± 1． 18△
2． 2 杜仲、千年健对卵巢切除大鼠胫骨 OB、
MSC OPG 和 RANKL 蛋白表达的影响
2． 2． 1 杜仲、千年健对卵巢切除大鼠胫骨 OB
和 MSC OPG 蛋白表达的影响 表 5 显示，模型组大
鼠胫骨 OB 和 MSC OPG 蛋白表达阳性密度均明显
低于假手术组。与模型组相比，千年健组 OB 和
MSC OPG 蛋白表达均明显升高，杜仲组无显著性差
异;与假手术组相比，杜仲组、千年健组 OB 和 MSC
OPG 蛋白表达阳性密度均明显降低。阳性对照组
OB 和 MSC OPG 蛋白表达阳性密度均明显高于模型
组，与假手术组相比无显著性差异。
表 5 各组大鼠胫骨 OB 和 MSC OPG 蛋白表达的变化
组 别 例数
OB OPG 蛋白
表达阳性密度
MSC OPG 蛋白
表达阳性密度
空 白 对 照 组 12 1． 66 ± 0． 42 7． 18 ± 1． 72
假 手 术 组 12 1． 72 ± 0． 52 6． 48 ± 1． 81
模 型 组 12 0． 76 ± 0． 23＊＊ 3． 06 ± 1． 28＊＊
阳 性 对 照 组 12 1． 62 ± 0． 38△△ 6． 24 ± 1． 91△△
杜 仲 组 12 0． 97 ± 0． 38＊＊ 4． 05 ± 1． 20＊＊
千 年 健 组 12 1． 16 ± 0． 43＊＊△△ 5． 02 ± 1． 56＊△△
2． 2． 2 杜仲、千年健对卵巢切除大鼠胫骨 OB
和 MSC RANKL 蛋白表达的影响 表 6 显示，与假
手术组相比，模型组大鼠胫骨 OB 和 MSC RANKL 蛋
白表达阳性密度均明显升高。与模型组相比，杜仲
组、千年健组 OB 和 MSC RANKL 蛋白表达明显降
低。与假手术相比，杜仲组 MSC RANKL 蛋白表达
阳性密度升高，OB RANKL 蛋白表达无显著性差异;
千年健组 OB 和 MSC RANKL 蛋白表达阳性密度较
假手术组均明显升高。与模型组相比，阳性对照组
OB 和 MSC RANKL 蛋白表达阳性密度明显降低，与
假手术组相比无显著性差异。
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September 2011 Vol． 17. No． 9
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表 6 各组大鼠胫骨 OB 和 MSC RANKL 蛋白表达的变化
组 别 例数
OB RANKL 蛋白
表达阳性密度
MSC RANKL 蛋白
表达阳性密度
空 白 对 照 组 12 1． 08 ± 0． 27 4． 77 ± 1． 82
假 手 术 组 12 1． 17 ± 0． 28 4． 55 ± 1． 75
模 型 组 12 1． 82 ± 0． 41＊＊ 9． 06 ± 2． 11＊＊
阳 性 对 照 组 12 1． 23 ± 0． 34△△ 5． 34 ± 1． 54△△
杜 仲 组 12 1． 39 ± 0． 37△ 6． 54 ± 1． 84＊△△
千 年 健 组 12 1． 48 ± 0． 35＊△ 7． 16 ± 2． 21＊＊△
2． 3 杜仲、千年健对卵巢切除大鼠胫骨 OB 和
MSC OPG 和 RANKL mRNA 表达的影响
2． 3． 1 杜仲、千年健对卵巢切除大鼠胫骨 OB 和
MSC OPG mRNA 表达的影响 表 7 显示，模型组大
鼠胫骨 OB 和 MSC OPG mRNA 表达阳性密度较假
手术组显著降低。千年健组 OB 和 MSC OPG mRNA
的阳性密度明显高于模型组，而杜仲组则无显著性
变化。与假手术组相比，杜仲组、千年健组 OB 和
MSC OPG mRNA 表达均明显降低。阳性对照组 OB
和 MSC OPG mRNA 表达较模型组明显升高，与假手
术组相比无显著性差异。
表 7 各组大鼠胫骨 OB 和 MSC OPG mRNA 表达的变化
组 别 例数
OB OPG mRNA
表达阳性密度
MSC OPG mRNA
表达阳性密度
空 白 对 照 组 12 2． 07 ± 0． 46 7． 33 ± 1． 82
假 手 术 组 12 2． 15 ± 0． 66 7． 65 ± 2． 19
模 型 组 12 1． 05 ± 0． 40＊＊ 3． 30 ± 1． 03＊＊
阳 性 对 照 组 12 1． 98 ± 0． 40△△ 6． 92 ± 1． 65△△
杜 仲 组 12 1． 35 ± 0． 40＊＊ 4． 21 ± 1． 48＊＊
千 年 健 组 12 1． 55 ± 0． 39＊△△ 5． 17 ± 1． 76＊＊△△
2． 3． 2 杜仲、千年健对卵巢切除大鼠胫骨 OB
和 MSC RANKL mRNA 表达的影响 表 8 显示，模
型组大鼠胫骨 OB 和 MSC RANKL mRNA 表达阳性
密度均明显高于假手术组。与模型组相比，杜仲组、
千年健组 OB 和 MSC RANKL mRNA 表达均明显降
低;与假手术组相比，千年健组 MSC RANKL mRNA
表达阳性密度明显升高，杜仲组 OB 和 MSC RANKL
mRNA 表达以及千年健组 OB RANKL mRNA 表达
均无显著性差异。阳性对照组 OB 和 MSC RANKL
mRNA 表达阳性密度均明显低于模型组，与假手术
组相比无显著性差异。
表 8 各组大鼠胫骨 OB 和 MSC RANKL mRNA 表达的变化
组 别 例数
OB RANKL mRNA
表达阳性密度
MSC RANKL mRNA
表达阳性密度
空 白 对 照 组 12 1． 47 ± 0． 52 5． 84 ± 1． 69
假 手 术 组 12 1． 60 ± 0． 50 6． 07 ± 1． 79
模 型 组 12 2． 41 ± 0． 53＊＊ 9． 94 ± 2． 16＊＊
阳 性 对 照 组 12 1． 70 ± 0． 48△△ 6． 26 ± 1． 67△△
杜 仲 组 12 1． 89 ± 0． 56△ 7． 51 ± 1． 81△△
千 年 健 组 12 1． 91 ± 0． 58△ 8． 02 ± 2． 07＊△
与空白对照组比较，假手术组的上述指标均无
显著性差异，从而排除了手术本身对实验的影响。
3 讨论
绝经后骨质疏松症是由于绝经后雌激素迅速减
少致使骨量丢失加快［4］。本研究以卵巢切除大鼠
为模型，结果发现卵巢切除后大鼠胫骨 TBV %显著
降低，代表骨吸收参数的 TRS%和代表骨形成参数
的 TFS%、MAR、mAR 和 OSW 均显著增高，因此本
实验模型与人类绝经后骨质疏松症的发病机理相
似，为骨吸收大于骨形成的高转换型骨质疏松症模
型。给药 3 个月后，杜仲组的 TBV %和 TRS%均有
明显逆转;千年健组除 mAR 以外，其他指标均明显
逆转。由此可见，杜仲主要以降低骨吸收来达到对
骨质疏松症的治疗，而千年健既能抑制骨吸收，同时
又能抑制骨形成，使骨形成大于骨吸收而达到对骨
质疏松症的治疗作用。
模型组大鼠胫骨 OB 和 MSC OPG 蛋白及其
mRNA 的表达均明显低于假手术组，OB 和 MSC
RANKL 蛋白及其 mRNA 的表达均明显高于假手术
组，提示当雌激素缺乏时则抑制 OB 和 MSC OPG 蛋
白表达减少，但促进 RANKL 蛋白的表达。现代研
究发现，OPG、RANKL 是非常重要的破骨细胞分化
调节信号因子。OPG 对破骨细胞的作用是多方面
的，它可以抑制破骨细胞的分化、融合、激活，并促进
破骨细胞凋亡。RANKL 是直接刺激破骨细胞发育
和使之激活的细胞因子，它与破骨细胞表面受体
RANK 结合，强有力地促进破骨细胞的形成、分化、
成熟，并抑制破骨细胞凋亡，延长其存活［5］。本实
验结果显示，杜仲组、千年健组 OB 和 MSC RANKL
蛋白及其 mRNA 的表达较模型组均明显降低，提示
杜仲和千年健对大鼠胫骨 OB 和 MSC RANKL 蛋白
及其 mRNA 的表达有明显的抑制作用;同时，千年
健组 OB 和 MSC OPG 蛋白及其 mRNA 表达较模型
组均明显提高，表明千年健对 OB 和 MSC OPG 蛋白
及其 mRNA 表达有一定的促进作用。
综上所述，杜仲、千年健对卵巢切除所致的大鼠
骨质疏松症均具有一定的治疗作用。从治疗作用环
节来看两者各有特点:千年健不仅可以增加 OB 和
MSC OPG 蛋白及其 mRNA 表达，还能抑制 RANKL
蛋白及其 mRNA 的表达;杜仲是通过抑制 OB 和
MSC RANKL 蛋白及其 mRNA 表达，从而达到治疗
骨质疏松症的目的。
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收稿日期:2011-03-15
作者简介:张 颖(1979-) ，女，河北唐山市人，医学博
士，从事中医痹证的基础研究。
△通讯作者:鞠大宏(1963-) ，男，辽宁凤城人，研究员，
医学博士，博士研究生导师，从事中医治疗痹证(骨质疏松
症和类风湿性关节炎)的基础研究。
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