全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (10): 1535~1540　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0224 1535
收稿 2014-05-06　　修定 2014-07-25
资助 国家自然科学基金项目(31260070)。
* 通讯作者(E-mail: gefeng@tsinghua.org.cn; Tel: 0871-
65920621)。
三七SE基因启动子的克隆及序列分析
卢荣江, 刘迪秋, 葛锋*, 陈朝银
昆明理工大学生命科学与技术学院, 昆明650500
摘要: 鲨烯环氧酶(squalene epoxidase, SE)基因是三七皂苷生物合成途径中的关键基因。本文采用染色体步移(genomic
walking)技术, 克隆出三七SE基因上游1 872 bp的启动子片段。生物信息学分析表明, 该启动子除了含有基本的TATA-box
和CAAT-box元件外, 还包含多个与细胞分裂素响应、抗病以及糖类和储藏蛋白合成等相关的作用元件。
关键词: 三七; 鲨烯环氧酶; 启动子
Cloning and Sequence Analysis of Promoter of SE in Panax notoginseng
LU Rong-Jiang, LIU Di-Qiu, GE Feng*, CHEN Chao-Yin
Faculty of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China
Abstract: The squalene epoxidase (SE) is considered to be a key enzyme involved in Panax notoginseng
biosynthesis pathway. A 1 872 bp promoter fragment was cloned from P. notoginseng using genomic walking
technique. The bioinformatics analyses showed that the fragment contained the conserved promoter sequence,
such as TATA-box, CAAT-box. Furthermore, it contained several elements related to cytokinin response,
disease-related, the synthesis of carbohydrates and proteins.
Key words: Panax notoginseng; squalene epoxidase; promoter
启动子是位于结构基因5′上游且能与RNA聚
合酶发生特异性识别以及结合的一段DNA序列,
是基因的重要组成部分, 支配生物体内基因表达的
起始时间和程度。通常, 根据基因的转录方式将植
物基因启动子分为组成型启动子(即基因的表达不
受外界环境、时间和空间的影响, 在不同的组织中
都可以表达)、诱导型启动子(在某些物质的刺激
下, 该类启动子可提高目的基因的转录水平)和组
织特异性启动子(该类启动子调控目的基因在植物
体内某些特定的组织中表达) (聂丽娜等2008)。启
动子存在其固有的保守区域, 通过对多种高等植物
基因启动子DNA及其侧翼序列分析发现, 位于转
录起始位点上游(32±7) bp处的TATA-box序列以及
(–31±2) bp和(–110~–80) bp处的GC-box序列较为保
守(Joshi 1987; 张小辉和祁艳霞2008)。
目前, 研究启动子的功能已成为研究表达调
控的重要内容。通过将启动子部分片段与报告基
因(包括葡萄糖苷酸酶基因和绿色荧光蛋白基因
等)融合并构建植物表达载体, 再转化模式植物(拟
南芥或烟草), 检测报告基因在转基因植株中的表
达情况, 进而确认启动子功能(吕山花等2011; 刘红
双等2013; 赵学彬等2013)。
三七为五加科人参属植物, 是我国传统中药
材, 主产于我国云南省(Luo等2011)。三七总皂苷
是三七的主要药理成分, 其具有抗高血压、抗血
栓、抗动脉粥样硬化、保肝和神经保护等疗效
(Ng 2006), 且具有安全、见效快和无副作用等特
点(张微微和李莹2012)。目前, 对三七总皂苷生物
合成途径中关键酶基因的克隆与调控研究已有一
些研究(石磊等2010), 但迄今, 对三七鲨烯环氧酶
(squalene epoxidase, SE)基因上游启动子的研究尚
未见报道。SE作为三七总皂苷生物合成途径的关
键酶, 分析其启动子序列, 有助于探究SE基因在
三七总皂苷合成途径中的作用。本研究通过克隆
SE基因全长DNA序列, 设计特异性引物, 采用染色
体步移(genome walking)技术从三七基因组DNA中
成功克隆出SE基因的启动子序列。通过生物信息
学分析获得与该基因表达调控有关的一些顺式作
用元件信息 , 为进一步研究SE基因功能及其在
三七总皂苷生物合成途径中的调控机制, 以及如
植物生理学报1536
何通过调控启动子来提高SE基因的表达水平, 进
而提高三七总皂苷合成提供理论依据。
材料与方法
1 材料与试剂
三七[Panax notoginseng (Burk) F. H. Chen]植
株采自云南省文山州。Genome Walking Kit、Taq
DNA聚合酶和相关试剂购于大连TaKaRa生物工程
有限公司, 胶回收试剂盒购于上海生工生物工程
有限公司, pGEM®-T Easy载体购于Promega公司,
大肠杆菌感受态Trans1-T1购于北京TransGen生物
技术有限公司。
2 实验方法
2.1 Tail-PCR分离三七SE基因启动子
采用改良的CTAB法(李荣华等2009)提取叶片
基因组DNA, 以提取的总DNA作为模板, SE基因的
上下游引物(Niu等2014), 进行PCR, 克隆SE基因全
长DNA序列。根据获得的SE基因5′端序列 , 用
Primer 5.0设计3条同向且退火温度较高的特异性
引物SE-SP1、SE-SP2和SE-SP3。SE-SP1: 5′ AG-
CAACCCCGGCGCCGACGATGATG 3′, SE-SP2: 5′
GCTATGATCTGTTCCAAACTCCGTGG 3′, SE-
SP3: 5′ CCCAAAAAGGAAAGCAAAGATC-
CATCC 3′。
以纯化的三七基因组DNA为模板, 分别使用
Genome Walking Kit试剂盒中提供的4种独特的简
并引物AP1、AP2、AP3、AP4以及SE-SP1、SE-
SP2、SE-SP3为引物。第一轮巢式PCR反应, 取0.5
μg三七叶基因组DNA作为模板, 以AP1、AP2、
AP3和AP4为上游引物, SE-SP1为下游引物, 进行
第一次巢式PCR, 反应程序如下: 94 ℃启动1 min;
98 ℃预变性1 min; 94 ℃变性30 s, 65 ℃退火1 min,
72 ℃延伸2 min, 共进行5个循环; 94 ℃变性30 s,
25 ℃退火3 min, 72 ℃延伸2 min, 1个循环; 94 ℃变
性30 s, 65 ℃退火1 min, 72 ℃延伸2 min; 94 ℃变
性30 s, 65 ℃退火1 min, 72 ℃延伸2 min; 94 ℃变
性30 s, 44 ℃退火1 min, 72 ℃延伸2 min; 共15个循
环, 最后72 ℃延伸10 min。再取第一轮巢式PCR反
应产物1 μL作为第二轮巢式PCR反应的模板, 以
AP3为上游引物, SE-SP2为下游引物, 进行第二轮
巢式PCR, 反应程序如下: 94 ℃变性30 s, 65 ℃退
火1 min, 72 ℃延伸2 min; 94 ℃变性30 s, 65 ℃退
火1 min, 72 ℃延伸2 min; 94 ℃变性30 s, 44 ℃退
火1 min, 72 ℃延伸2 min, 共15个循环, 最后72 ℃
延伸10 min。取第二轮巢式PCR反应产物1 μL作
为模板, 以AP3引物为上游引物, SE-SP3引物为下
游引物 , 进行第三轮巢式PCR, 反应程序如下 :
94 ℃变性30 s, 65 ℃退火1 min, 72 ℃延伸2 min;
94 ℃变性30 s, 65 ℃退火1 min, 72 ℃延伸2 min;
94 ℃变性30 s, 44 ℃退火1 min, 72 ℃延伸2 min, 共
15个循环, 最后72 ℃延伸10 min。分别取第一
轮、第二轮和第三轮巢式PCR反应液各5 μL, 进行
1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测, 将第三轮PCR
扩增的特异性条带用胶回收试剂盒回收纯化。
2.2 SE基因启动子的克隆
纯化后的巢式PCR产物连接到pGEM®-T Easy
载体上, 热激转化到大肠杆菌Trans1-T1感受态细
胞中, 涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上, 随机挑
取10个单克隆于含有氨苄青霉素的LB液体培养基
中37 ℃培养约6 h, 以菌液作为模板, 选用M13通用
引物进行PCR扩增, 然后用1.0%的琼脂糖凝胶电
泳对PCR产物进行检测。依据电泳检测结果, 将获
得的阳性克隆子送往上海生工生物工程有限公司
测序。
实验结果
1 三七SE基因启动子的克隆
实验使用简并引物AP3, 经过3轮巢式PCR, 从
三七叶基因组DNA扩增获得一条长为2 069 bp的
特异性条带(图1)。将目的片段纯化后, 克隆测序
结果显示, 巢式PCR获得片段全长2 069 bp, 其3′端
与获得的SE基因全长的5′端有194 bp相同, 与之前
的实验设计相吻合, 可见克隆的片段即为SE基因
翻译起始密码子ATG上游序列, 命名为SEP。
将PCR产物胶回收, 回收后的目的片段进行
TA克隆获得连接产物pGEM-T-SEP。热激转化大
肠杆菌, 氨苄青霉素筛选后, 使用M13通用引物进
行菌液PCR检测鉴定, 结果如图2所示, 初步说明已
获得阳性克隆, 且大小与预期相符。
2 SE启动子的序列分析
用TSSP-TCM在线软件(Shahmuradov等2005)
对SE基因启动子序列进行分析, 利用PLACE软件
卢荣江等: 三七SE基因启动子的克隆及序列分析 1537
http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html
(Prestridge 1991; Higo等1999)对三七SE基因启动
子序列进行元件预测。如表1和图3所示, 该启动
子除了含有绝大多数真核生物启动子所具有的保
守序列元件TATA-box和CAAT外, 还具有Inr元件
INRNTPSADB, 这3个元件普遍存在于真核蛋白编
码基因中。启动子序列中还包含多个与激素以及
非生物胁迫等相关的顺式作用元件。激素响应作
用元件包括: 脱落酸响应调控元件DRE2COREZ-
MRAB17; 赤霉素响应元件PYRIMIDINEBOXH-
VEPB1和PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A; 细胞分
裂素响应相关元件ARR1AT; 乙烯相关调控元件
WBOXNTERF3。非生物胁迫响应相关顺式作用
元件主要包括: 低温响应元件LTRE1HVBLT49; 与
盐诱导相关的调控元件GT1GMSCAM4; 光响应元
件-10PEHVPSBD; 黑暗应答元件ACGTATERD1。
这些作用元件的发现可以初步说明SE基因的转录
水平可能受到激素(如脱落酸、赤霉素、细胞分裂
素和乙烯)及非生物胁迫(高盐、低温和光照)等多
种理化因素的调节。同时在SE启动子序列中还发
现DOFCOREZM、OSE1ROOTNODULE和CACT-
FTPPCA1等器官特异性表达的元件, 初步说明SE
在植物体内的表达可能具有组织特异性。
图1 SE基因启动子的琼脂糖凝胶电泳检测
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of SE gene promoter
M: DL2000 DNA marker; 1: 第一轮PCR扩增产物; 2: 第二轮
PCR扩增产物; 3: 第三轮PCR扩增产物。
讨　　论
启动子作为转录调控的关键区域, 是近年来
基因工程研究的热点。启动子在转录过程中起重
要作用, 而转录调控是基因调控的重要手段, 研究
启动子序列为揭示基因表达调控机制提供了重要
证据。SE是三七总皂苷生物合成途径中的关键酶,
目前未见其启动子的研究报道, 本文通过染色体
步移技术, 成功克隆出三七SE基因起始密码子上
图2 pGEM-T-SEP大肠杆菌菌液PCR检测
Fig.2 PCR detection of pGEM-T-SEP in E. coli
M: DL5000 DNA marker; 1~9: 菌液样品。
植物生理学报1538
游1 875 bp序列, 离起始密码子最近的转录起始位
点为A (定义为+1位)位于起始密码子上游93 bp
处。通过PLACE在线软件分析发现该启动子序列
含有大量的顺式作用元件(图3和表1)。其中, 典型
的控制元件TATA-box (与RNA聚合酶II结合的核
心元件) (Butler和Kadonaga 2002)位于转录起始位
点上游–32 bp处, 还有CAAT-box (可能与RNA聚合
酶的某处结合, 并控制着转录起始的频率, 对转录
的起始无直接影响) (Breathnach和Chambon 1981)
和Inr元件INRNTPSADB, 这3个元件已被证实为参
与蛋白编码基因的核心启动子构件 (谢在春等
2007)。另外, SE基因启动子中还发现有多种与逆
境诱导相关调控元件: GT1GMSCAM4 (参与盐诱
导相关的调控元件) (Park 2004)、LTRE1HVBLT49
(低温响应元件) (阴霞等2014)、-10PEHVPSBD
(光响应元件) (Tian等2011)、ACGTATERD1 (黑暗
应答元件) (Simpson等2003), 以及其他与一些植物
激素响应的调控元件 , 如脱落酸响应调控元件
DRE2COREZMRAB17、赤霉素响应元件PYRIM-
IDINEBOXHVEPB1和PYRIMIDINEBOXOS-
RAMY1A、乙烯相关调控元件WBOXNTERF3
(Nishiuchi等2004)。同时在SE基因启动子序列发
图3 SE基因启动子序列
Fig.3 The promoter sequence of SE gene
卢荣江等: 三七SE基因启动子的克隆及序列分析 1539
现了GATABOX、CACTFTPPCA1和DOFCOREZM
等器官特异性表达相关作用元件, 推断SE基因启
动子在植物体内可能具有组织特异性表达。序列
分析还发现位于–1 476处的互补链有一段TT-
GACC序列, 与文献报道的WRKY转录因子的核心
结构域的识别序列(C/T)TGAC(T/C) (即W-Box)相
吻合(Ülker和Somssich 2004), 而WRKY类转录因
子在植物次生代谢起重要作用(戴怡龄2008), 据此
推断WRKY转录因子可能通过与SE启动子区的
W-box作用元件相结合, 驱使下游SE基因表达, 进
而增加三七皂苷的含量。
我们下一步准备构建SE基因启动子与葡萄糖
苷酸酶基因的融合表达载体, 拟转化烟草对启动
子的功能进行分析, 从而明确该启动子在三七皂
苷生物合成途径中的作用。然而, 目前可应用于
转基因研究的启动子数量不多, 研究者需要进一
步挖掘更多新的抗逆相关的启动子和相关的顺式
作用元件, 研究一些重要顺式作用元件与相关转
录因子的互作是今后研究启动子的重要内容。
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表1 SE基因启动子所含顺式作用元件
Table 1 The cis-acting elements in SE gene promoter
元件名称 序列 元件功能 数量**
DRE2COREZMRAB17 ACCGAC 脱落酸响应调控元件 1
WBOXNTERF3 TGACY* 乙烯相关调控元件 1
GT1GMSCAM4 GAAAAA 与盐诱导相关的调控元件 4
PYRIMIDINEBOXHVEPB1 TTTTTTCC 赤霉素响应元件 1
PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A CCTTTT 赤霉素响应元件 1
ARR1AT N*GATT 与细胞分裂素响应相关 9
GATABOX GAGA 组织特异相关元件 6
LTRE1HVBLT49 CCGAAA 低温响应元件 1
-10PEHVPSBD TATTCT 光响应元件 5
CACTFTPPCA1 YACT 叶肉特异表达相关元件 14
EBOXBNNAPA CANNTG 储藏蛋白表达相关的顺式元件 14
DOFCOREZM AAAG 参与茎组织特异性表达的元件 5
OSE1ROOTNODULE AAAGAT 组织特异性表达元件 2
ABRELATERD1 ACGTG 启动子元件1 3
BIHD1OS TGTCA 与抗病相关的元件 2
ACGTATERD1 ACGT 黑暗应答元件 6
INRNTPSADB YTCANTYY Inr元件 2
Y*: C/T; N*: A/G/C/T ; **: 以上数量针对当前核苷酸序列, 不包括互补链。
植物生理学报1540
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