全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (5): 651~659　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2013.0479 651
收稿 2013-12-24　　修定 2014-04-10
资助 国家自然科学基金(31270339和31301798)和江苏省农业自
主创新资金项目[CX(11)1016]。
* 通讯作者(E-mail: jswangren@aliyun.com; Tel: 025-84347111)。
一个新的忽地笑O-甲基转移酶基因的克隆与原核表达
别庆玲, 徐晟, 傅江燕, 夏冰, 汪仁*
江苏省中国科学院植物研究所, 南京210014
摘要: 采用RACE技术克隆得到一个新的忽地笑O-甲基转移酶(OMT)基因, 命名为LaOMT。LaOMT的cDNA序列为1 379 bp,
开放阅读框1 077 bp, 预测编码蛋白包含358个氨基酸。序列比对分析发现, LaOMT编码的蛋白序列具有依赖于S-腺苷-L-甲
硫氨酸(SAM)的高度保守的结构域, 与葡萄、大豆等其他植物OMTs蛋白的相似性为50%左右。将LaOMT基因连接到原核
表达载体pET28a上, 转化大肠杆菌Rosetta (DE3)的SDS-PAGE电泳结果显示, 重组蛋白受异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导
表达, 分子量大小约为45 kDa, 与已报导的其他植物的OMTs蛋白大小基本一致。此外, 半定量RT-PCR分析结果表明,
LaOMT在忽地笑的叶、鳞茎、根和花中均有表达, 其中花中的表达量最低。
关键词: 忽地笑; O-甲基转移酶; 加兰他敏; 原核表达
Cloning and Prokaryotic Expression of a New O-Methyltransferase Gene in
Lycoris aurea (L’Her) Herb.
BIE Qing-Ling, XU Sheng, FU Jiang-Yan, XIA Bing, WANG Ren*
Institute of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210014, China
Abstract: In this study, a full-length cDNA sequence of O-methyltransferase was obtained from Lycoris aurea
with the RACE method, which was named as LaOMT. The full-length cDNA of LaOMT is 1 379 bp with a
1 077 bp open reading frame, encoding a deduced polypeptide of 358 amino acids. Multiple sequence alignment
showed that the deduced protein of LaOMT contains S-adenosyl-L-methionine (SAM)-dependent conserved
motifs and shares more than 50% identity with O-methyltransferases (OMTs) from Vitis vinifera, Glycine max
and other plants. Subsequently, the LaOMT was ligated into pET28a vector, and transferred into Escherichia
coli strain Rosetta (DE3) for heterologous expression. The recombinant protein was induced by isopro-
pyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) and its molecular weight is about 45 kDa, which is consistent with
OMTs from other plants. Additionally, semi-quantitative RT-PCR analysis indicated that LaOMT was ubiqui-
tously expressed in leaves, bulbs, roots and flowers.
Key words: Lycoris aurea; O-methyltransferase (OMT); galanthamine; prokaryotic expression
氧位甲基化(O-methylation)是植物体内重要
的修饰方式之一, 和酰基化、糖基化等修饰反应一
起丰富了次生代谢产物黄酮类和生物碱等化合物
的种类和功能多样性(Ibrahim等1998)。在植物体
内, 氧位甲基化主要是由O-甲基转移酶(O-methyl-
transferase, OMT)催化, 由S-腺苷-L-甲硫氨酸
(S-adenosyl-L-methionine, SAM)提供的甲基, 催化
底物生成相应的甲基化产物和S-腺苷-L-高半胱氨
酸(S-adenosyl-L-homocysteine, SAH) (Ibrahim等
1998)。植物中OMTs根据氨基酸序列、分子量大
小和底物的选择性不同分为I类和II类2种(Lam等
2007)。I类OMTs分子量大小为27~29 kDa, 通常指
咖啡酰辅酶A (caffeoyl-CoA, CCoA) OMTs (Inoue
等1998); II类OMTs分子量大小为38~42 kDa, 催化
的特异性底物范围比较广泛(NDong等2003; Frick
和Kutchan 1999)。研究表明, II类OMTs广泛参与
植物体次生代谢产物的生成 , 包括黄酮类化合
物、苯基丙烯类化合物及各种挥发性酚类(Schmi-
dlin等2008; Li等2006; Akashi等2003; Lavid等2002;
Wein等2002)。
研究报告 Original Papers
植物生理学报652
忽地笑又名黄花石蒜, 为石蒜科(Amaryllida-
ceae)石蒜属多年生草本植物; 同时也是一种具有
经济价值的观赏花卉和重要的药用植物。忽地笑
体内含有包括石蒜碱(lycorine)、加兰他敏(galan-
thamine)、水仙环素(narciclasine)等在内的多种石
蒜科生物碱, 它们都具有特定的药理活性。特别
是加兰他敏, 作为一种异喹啉类生物碱, 它具有较
强的乙酰胆碱酯酶抑制活性 , 临床上用于治疗
轻、中度老年痴呆症, 脊髓灰质炎及其他神经系
统疾病(Novikova和Tulaganov 2002)。目前的研究
认为, 加兰他敏在植物体内的生物合成途径主要
分为6个步骤, 首先是原儿茶醛与酪胺(tyramine)合
成降孤挺花啶(norbelladine), 然后降孤挺花啶在
OMT的催化下生成4-O-甲基降孤挺花啶, 而4-O-
甲基降孤挺花啶进一步在酶的作用下生成加兰他
敏。此外 , 4-O-甲基降孤挺花啶还是文殊兰胺
(crinine)和石蒜碱等石蒜科生物碱合成的共同前体
(Bastida等2011)。
此前, 本研究小组通过同源克隆的方法得到
石蒜中的一个咖啡酸OMT基因LrCOMT (梁丽建等
2012)。最近, 我们完成了忽地笑的转录组测序工
作, 并对忽地笑体内加兰他敏生物合成途径中的
相关基因进行了分类和总结筛选(Wang等2013)。
本研究在转录组数据的基础上, 利用RACE技术克
隆了一个新的忽地笑OMT基因, 并对其进行了相
关的生物信息学分析和原核表达等研究。
材料与方法
1 实验材料与试剂
二年生忽地笑[Lycoris aurea (L’Her) Herb.]新
鲜叶片采自江苏省中国科学院植物研究所试验苗
圃地。取样后迅速用液氮冷冻, 并保存在–80 ℃,
用于RNA的提取。
高纯度总RNA提取试剂盒购自南京华普生物
科技有限公司, SMARTer™ RACE cDNA Amplifi-
cation Kit购自Clontech公司, 克隆载体pMD19-T、
LA Taq酶、DNA Markers、Oligo (dT)18、反转录酶
M-MLV (RNase H-)、限制性内切酶购自宝生物工
程(大连)有限公司, 表达载体pET28a购自Novagen
公司, 胰蛋白胨、酵母提取物购自Oxoid公司, 其
他化学试剂均为国产化学纯。大肠杆菌DH5α和
Rosetta (DE3)菌株为本实验室保存, 引物合成委托
北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司完成, 测序
委托上海美吉生物医药科技有限公司完成。
2 实验方法
2.1 总RNA提取
参照高纯度总RNA提取试剂盒的操作说明,
提取忽地笑叶片的总RNA, 用1.0%的琼脂糖凝胶
电泳检测其纯度与完整性。
2.2 全长cDNA的克隆
根据忽地笑转录组测序结果中的已知基因片
段设计R A C E引物 (表1 ) , 按照C l o n t e c h公司
SMARTer™ RACE cDNA Amplification Kit说明书
进行操作。5-RACE PCR扩增程序为: 95 ℃预变性
5 min; 95 ℃变性40 s, 52 ℃退火30 s, 72 ℃延伸2
min, 30个循环; 72 ℃延伸10 min。3-RACE扩增程
序为: 95 ℃预变性5 min; 95 ℃变性40 s, 50 ℃退火
30 s, 72 ℃延伸2 min, 35个循环; 72 ℃延伸10 min。
扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后, 切胶回
收片段, 连接到pMD19-T载体转化大肠杆菌后, 挑
取阳性克隆测序。
利用NCBI的ORF Finder查找序列开放阅读
框。同时根据已获得的LaOMT cDNA和pET28a载
体图谱设计带有酶切位点BamHI和XhoI的引物
LaOMT-pETF和LaOMT-pETR (表1), 用LA Taq酶进
行PCR, 扩增基因编码区(CDs)序列。扩增程序为:
94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s, 50 ℃退火30 s, 72 ℃
延伸2 min, 35个循环; 72 ℃延伸7 min。扩增产物回
收后连接到pMD19-T载体, 挑取阳性克隆测序。
2.3 生物信息学分析
采用NCBI网站的Blastp程序(http://blast.ncbi.
nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行序列比对分析, 选择与
L a O M T同源的其他植物的氨基酸序列 , 用
DNAman进行多重比对并用MEGA 5构建系统进化
树; 用ExPASy (http://au.expasy.org)的Compute pI/
MW计算蛋白质的等电点、分子量; 用TMHMM
(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)预测
跨膜结构; 用SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/ser-
vices/SignalP)预测信号肽; 用PROSITE (http://
prosite.expasy.org)数据库进行功能结构预测; 用
SOPMA (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_au-
tomat.pl?page=npsa_sopma.html)预测二级结构; 用
SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org)预测
三级结构。
别庆玲等: 一个新的忽地笑O-甲基转移酶基因的克隆与原核表达 653
2.4 LaOMT基因的原核表达
将扩增得到的忽地笑LaOMT基因编码区的片
段切胶回收、纯化, 并与pMD19-T载体连接产生
pMD-LaOMT。用限制性内切酶BamHI和XhoI对
pET28a空载体和pMD-LaOMT重组质粒分别进行
双酶切, 酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳检测、回
收纯化后连接, 获得重组质粒pET28a-LaOMT; 进
一步对重组质粒进行双酶切验证并进行测序。将
验证正确的重组质粒和pET28a空载体分别转入表
达宿主菌Rosetta (DE3)中, 挑取阳性克隆, 进行后
续诱导表达。
2.5 重组蛋白的诱导表达及SDS-PAGE电泳检测
将分别含有空载体pET28a和重组质粒pET28a-
LaOMT的Rosetta (DE3)菌株接种于100 mL的LB液
体培养基中并培养至OD600为1.0左右, 随后加入终
浓度为1 mmol·L-1的异丙基硫代半乳糖苷(isopro-
pyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)进行诱导。在
培养的0、3、6、12 h分别取1 mL菌液, 13 000×g离
心2 min收集菌体, 加入200 μL去离子水和50 μL的
5×SDS上样缓冲液重新悬浮, 煮沸5 min, 12 000×g
离心10 min后取上清样品25 μL进行SDS-PAGE蛋
白电泳检测, 电泳结束后用考马斯亮蓝R-250染色
2 h, 然后置于脱色液中脱色过夜, 观察分析结果。
2.6 LaOMT组织特异性表达分析
按照高纯度总RNA提取试剂盒操作说明提取
忽地笑不同组织器官(根、鳞茎、叶、花)的总
RNA。用Oligo (dT)18、反转录酶M-MLV (RNase
H-)合成cDNA第一链。以cDNA第一链为模板, 忽
地笑Actin (LaActin)为内参基因, 用LaActin引物及
根据LaOMT基因序列设计的特异性引物(表1)进行
半定量RT-PCR, 检测LaOMT基因在不同组织器官
中的表达量差异。半定量PCR扩增程序为: 94 ℃
预变性5 min; 94 ℃变性30 s, 50 ℃退火25 s, 72 ℃
延伸30 s, 30个循环; 72 ℃延伸10 min。扩增产物
在1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。
实验结果
1 LaOMT基因的克隆及序列分析
我们在分析忽地笑转录组测序数据时发现一
个基因片段与植物OMTs具有较高的相似度(Wang
等2013)。根据该基因片段设计RACE引物, 利用
RACE和PCR分别得到该基因5-端和3-端序列(图
1-A和B), 拼接该基因片段已知序列、5-端和3-端
序列得到基因全长cDNA为1 379 bp, 开放阅读框
1 077 bp, 预测编码蛋白包含358个氨基酸残基(图
2)。在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.org)上进行
Blastp比对分析, 发现该预测蛋白具有一段保守的
OMT结构域。因此, 我们将该基因命名为LaOMT。
据此设计用于扩增其编码区的特异引物LaOMT-
pETF和LaOMT-pETR, 以忽地笑cDNA为模板进行
PCR扩增, 得到大约1 100 bp的片段(图1-C)。
2 LaOMT蛋白的生物信息学分析
采用相关软件分析LaOMT氨基酸序列的结果
表明: LaOMT蛋白由358个氨基酸残基组成, 理论
分子量40.4 kDa, 等电点为5.81, 为非跨膜蛋白。信
号肽分析表明, LaOMT蛋白的N-端序列不含信号
肽的结构特征。因此推断, LaOMT在细胞质中合
成后, 不进行蛋白转运。
表1 忽地笑LaOMT基因克隆和表达分析引物序列
Table 1 The primers used in gene cloning and expression analysis of LaOMT
引物名称 引物序列(5→3) 用途
LaOMT 5-RACE-R1 GGGATTGAGTTCGTTGTTAAGAT 5-RACE
LaOMT 5-RACE-R2 AAAGATGAGTCTGAGCATCTAAT
LaOMT 3-RACE-F1 CTAGTCCACAACGGCTTCTTCG 3-RACE
LaOMT 3-RACE-F2 TTCAATGGCATCCTTTGAGAA
LaOMT-pETF CACTGGATCCATGGCATCCTTTGAGAA 验证ORF全长及原核表达
LaOMT-pETR TGAACTCGAGGGGGTAGATTTCAATAA
LaActinF ATCCAGGCCGTCCTTTC 内参基因扩增
LaActinR TGGAAGAGAACCTCTGGGCA
LaOMT-RTF TTCAATGGCATCCTTTGAGAA 检测LaOMT表达水平
LaOMT-RTR GGGATTGAGTTCGTTGTTAAGAT

植物生理学报654
图1 LaOMT的PCR扩增片段
Fig.1 PCR amplification results of LaOMT
A: 5-RACE; B: 3-RACE; C: LaOMT ORF。M: DL2000分子量标准; 1: PCR扩增片段。
图2 LaOMT基因cDNA序列及推导的氨基酸序列
Fig.2 The nucleotide acid and deduced amino acid sequences of LaOMT
别庆玲等: 一个新的忽地笑O-甲基转移酶基因的克隆与原核表达 655
用Prosite数据库进行预测分析发现, 在LaOMT
蛋白质序列中, 一段从20~358位共计339个氨基酸
残基的序列具有SAM-OMT家族的特征(图3); 该蛋
白SAM的结合位点位于222位氨基酸; 261位氨基酸
上存在质子受体基团, 用于从底物分子中接受质
子, 从而对其进行催化。此外, 未发现其他明显的
功能性位点。
LaOMT氨基酸序列的二级结构预测显示, α-
螺旋和无规则卷曲是LaOMT蛋白中较大量的结构
元件, 其余含有较少量的延伸链和β-转角。统计结
果表明, LaOMT蛋白的二级结构包含47.77% α-螺
旋、31.56%无规则卷曲、14.53%延伸链和6.15%
β-转角。
用基于同源建模的分析工具SWISS-MODEL
对LaOMT的三级结构进行预测, 软件自动选择
PDB数据库中的苜蓿(Medicago truncatula)二氢异
黄酮4-OMT 1zg3A为模板(同源性为39.83%), 对
LaOMT的8~358位氨基酸进行建模的结果显示,
LaOMT结构主要为α-螺旋, 仅含少量β-转角结构,
与二级结构预测结果相符(图4)。
3 LaOMT蛋白的同源性分析及进化树构建
利用NCBI网站的非冗余蛋白质序列数据库,
通过Blastp程序在不同种属的植物中寻找LaOMT
蛋白同源序列。结果显示, 来源于葡萄、大豆、
杏、月季、吐根和扁桃的OMT与LaOMT的氨基酸
序列一致性分别为49.9%、47.9%、46.9%、
47.6%、43.1%和45.2%, 表现出一定的相似性; 多序
列比对发现不同物种的OMT蛋白在结构域部位的
氨基酸保守, 具有依赖SAM的OMTs蛋白的保守区:
LVDVGGGXG和NGKVI (图5)。此外, 系统进化分
析结果表明, LaOMT与苞蔷薇(Rosa bracteata)、黄
蔷薇(Rosa hugonis)和蓖麻(Ricinus communis)的
OMT同源蛋白亲缘关系最近, 在一个进化分支上
(图6)。
4 LaOMT的原核表达
重组质粒pMD-LaOMT和pET28a分别用
BamHI和XhoI限制性内切酶双酶切, 得到LaOMT基
因完整的开放阅读框片段(图7-A), 用T4 DNA连接
酶连接两个片段得到重组片段pET28a-LaOMT, 随
图3 用Prosite数据库分析LaOMT的功能位点
Fig.3 Analysis of functional sites of LaOMT using Prosite database
图4 LaOMT的同源建模三级结构
Fig.4 Tertiary structure homology-modeling of LaOMT
植物生理学报656
后转化至表达宿主菌Rosetta (DE3)中; 挑取阳性克
隆, 提取质粒后进行双酶切验证(图7-B), 表明目的
片段已经连接到载体pET28a上。
将含有重组质粒pET28a-LaOMT和空载体
p E T 2 8 a的表达宿主菌培养后加入终浓度为
1 mmol·L-1 IPTG进行诱导, 并在处理后的0、3、
6、12 h取样进行SDS-PAGE检测。结果显示, 含
pET28a-LaOMT的大肠杆菌经IPTG诱导后有一条
45 kDa左右的诱导条带, 且随着IPTG诱导时间的
延长目标蛋白的表达量明显增加(图8)。
5 LaOMT在不同组织中的表达
以忽地笑Actin为内参, 利用半定量RT-PCR方
法分析LaOMT的表达模式。结果表明, LaOMT在
忽地笑的根、鳞茎、叶片和花等组织中均有表达,
在叶片中表达量最高, 其次是鳞茎、根, 花中的表
达量最低(图9)。
讨　　论
OMTs参与植物体许多重要的次生代谢产物
如类黄酮类、类苯基丙烷、生物碱、木质素和脂
肪族化合物等的生物合成过程(穆红梅等2012)。
目前, 植物中很多OMT基因已经被克隆, 包括苜
蓿、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、杨树(Populus
tremula)、小麦(Triticum aestivum)、烟草(Nicotiana
tabacum)、番茄(Solanum lycopersicum)、大豆、
鸢尾(Iris hollandica)、罂粟(Papaver somniferum)
图5 LaOMT与其他植物OMT氨基酸序列的多重比对
Fig.5 Amino acid sequence comparison between LaOMT and other plant OMT proteins
黑色背景表示氨基酸序列一致性为100%, 灰色背景表示一致性高于75%, 浅灰色背景表示一致性高于50%, 黑色方框标记表示保守
的OMT结构域。VvOMT: 葡萄(Vitis vinifera), XP_002278294; GmOMT: 大豆(Glycine max), XP_003544914; PaOMT: 杏(Prunus armeniaca),
AAB71213; RcOMT1: 月季(Rosa chinensis), AAM23004; CiOMT: 吐根(Carapichea ipecacuanha), BAJ72588; PdOMT: 扁桃(Prunus dulcis),
CAA11131。
别庆玲等: 一个新的忽地笑O-甲基转移酶基因的克隆与原核表达 657
等(Dang和Facchini 2012; Yoshihara等2008; Lam等
2007; Muzac等2000; Gowri等1991)。
先前的研究通过分析36种植物OMTs的氨基
酸序列发现, 植物OMTs的氨基酸序列中有5个保守
区, 分别为: LVDVGGGXG、GINFDLPHV、EH-
VGGDMF、NGKVI和GGKERT, 其中LVDVGG-
GXG和NGKVI被认为分别和SAM和金属离子相关
图6 LaOMT与其他植物OMTs的聚类分析
Fig.6 Phylogenetic analysis of LaOMT and other plant OMTs
图7 pET28a-LaOMT重组表达载体的构建
Fig.7 The construction of recombinant vector pET28a-LaOMT
M: DL2000分子量标准; 1: pMD-LaOMT载体(A)和pET28a-
LaOMT载体(B)经BamHI/XhoI双酶切后的电泳检测。
图8 pET28a-LaOMT重组蛋白在大肠杆菌中的表达
Fig.8 Expression of pET28a-LaOMT protein in E. coli cells
M: 蛋白分子量标准; 箭头表示pET28a-LaOMT目标融合蛋白。
植物生理学报658
(Ibrahim等1998)。LaOMT中的保守序列分析初步
说明本实验所克隆得到的序列为OMT基因序列。
此外 , 我们克隆到的L a O M T基因开放阅读框
1 077 bp, 共编码358个氨基酸, 与桂柳姿等(2013)克
隆到的忽地笑COMT (LaCOMT)有一定的差异。
LaOMT与葡萄、大豆、吐根等中的OMTs同
源性比较高, 而相关研究表明这类OMTs催化生成
的产物多为酚类衍生物或生物碱类(Lavid等2002;
Cheong等2011), 因此推测LaOMT可能是忽地笑中
酚类或生物碱代谢途径中相关的OMT。LaOMT
的三级结构建模结果表明其与苜蓿二氢异黄酮4-
OMT (HI4OMT) (Liu等2006)的三维结构具有较高
的相似性。此外, 要了解LaOMT在植物体内的酶
学特性和生物学功能, 须在蛋白水平进行研究。
原核表达系统具有产量高、易操作、稳定性好、
经济实惠等优点(Esposito和Chatterjee 2006; Waugh
2005), 为研究LaOMT蛋白的表达和功能提供了一
条有效的途径。本研究将LaOMT基因与原核表达
载体pET28a重组, 转入大肠杆菌中进行融合蛋白
的诱导表达; 此后, 我们将进一步纯化表达产物以
得到单一的酶, 对LaOMT的作用底物、底物的甲
基化发生位点及酶活特性进行深入研究。
忽地笑是石蒜属植物中体内生物碱含量比较
高的一种(袁菊红等2010), 因此它是研究石蒜科生
物碱生物合成代谢途径的优良材料。Eichhorn等
(1998)以夏雪片莲(Leucojum aestivum)为材料, 通
过同位素标记生物合成的可能前体, 研究了加兰
他敏的生物合成途径, 推测其主要有5个步骤。尽
管目前认为降孤挺花啶由原儿茶醛与酪胺合成,
并被OMT催化生成4-O-甲基降孤挺花啶(Bastida
等2011; Eichhorn等1998), 但加兰他敏生物合成途
径中关键的酶类依旧没有得到鉴定。有研究报道,
忽地笑根和鳞茎中加兰他敏生物碱的含量较高,
叶片中的含量很少(Ru等2013), 这与我们报道的
LaOMT基因的组织特异性表达存在差异。因此,
LaOMT基因是否与忽地笑加兰他敏生物合成代谢
相关仍需要更多的实验来证实。本研究对忽地笑
一个OMT基因进行了克隆及序列分析, 为石蒜科
生物碱的生物合成关键酶基因研究提供了一定的
实验依据和研究思路。
参考文献
桂柳姿, 崔培梧, 潘清平, 唐金凤, 鲁耀邦(2013). 忽地笑加兰他敏生
物合成代谢途径中COMT酶基因克隆及序列分析. 湖南中医
药大学学报, 33 (3): 35~40
梁丽建, 江玉梅, 夏冰, 蒋明敏, 彭峰, 何树兰, 汪仁(2012). 石蒜儿
茶酚氧位甲基转移酶基因克隆与原核表达. 西北植物学报, 32
(1): 23~28
穆红梅, 夏冰, 高俊平, 张秀省, 汪仁, 彭峰, 何树兰(2012). 植物中
SAM Mtases基因研究进展. 西北植物学报, 32 (5): 1062~1066
袁菊红, 胡绵好, 夏冰(2010). 石蒜属不同种间生物碱含量差异性研
究. 江西农业大学学报, 32 (3): 560~565
Akashi T, Sawada Y, Shimada N, Sakurai N, Aoki T, Ayabe S (2003).
cDNA cloning and biochemical characterization of S-adenos-
yl-L-methionine: 2,7,4-trihydroxyisoflavanone 4-O-methyl-
transferase, a critical enzyme of the legume isoflavonoid phyto-
alexin pathway. Plant Cell Physiol, 44: 103~112
Bastida J, Berkov S, Torras L, Pigni NB, de Andrade JP, Martínez V,
Codina C, Viladomat F (2011). Chemical and biological aspects
of Amaryllidaceae alkaloids. In: Muñoz-Torrero D (ed). Recent
Advances in Pharmaceutical Sciences. Kerala: Transworld Re-
search Network, 65~100
Cheong BE, Takemura T, Yoshimatsu K, Sato F (2011). Molecular
cloning of an O-methyltransferase from adventitious roots of
Carapichea ipecacuanha. Biosci Biotechnol Biochem, 75:
107~113
Dang TT, Facchini PJ (2012). Characterization of three O-methyl-
transferases involved in noscapine biosynthesis in Opium poppy.
Plant Physiol, 159: 618~631
Eichhorn J, Takada T, Kita Y, Zenk MH (1998). Biosynthesis of the
Amaryllidaceae alkaloid galanthamine. Phytochemistry, 49:
1037~1047
Esposito D, Chatterjee DK (2006). Enhancement of soluble protein
expression through the use of fusion tags. Curr Opin Biotechnol,
17: 353~358
Frick S, Kutchan TM (1999). Molecular cloning and functional ex-
pression of O-methyltransferase common to isoquinoline alka-
loid and phenylpropanoid biosynthesis. Plant J, 17: 329~339
Gowri G, Bugos RC, Campbell WH, Maxwell CA, Dixon RA (1991).
Stress responses in alfalfa (Medicago sativa L.). X. Molecular
cloning and expression of S-adenosyl-L-methionine: caffeic acid
3-O-methyltransferase, a key enzyme of lignin biosynthesis.
Plant Physiol, 97: 7~14
Ibrahim RK, Bruneau A, Bantignies B (1998). Plant O-methyltrans-
ferase: molecular analysis, common signature and classification.
Plant Mol Biol, 36: 1~10
图9 LaOMT在不同组织中的表达
Fig.9 LaOMT expression in different tissues
别庆玲等: 一个新的忽地笑O-甲基转移酶基因的克隆与原核表达 659
Inoue K, Sewalt VJH, Ballance GM, Ni WT, Sturzer C, Dixon RA
(1998). Developmental expression and substrate specificities of
alfalfa caffeic acid 3-O-methyltransferase and caffeoyl coen-
zyme A 3-O-methyltransferase in relation to lignification. Plant
Physiol, 117: 761~770
Lam KC, Ibrahim RK, Behdad B, Dayanandan S (2007). Structure,
function, and evolution of plant O-methyltransferases. Genome,
50: 1001~1013
Lavid N, Wang JH, Shalit M, Guterman I, Bar E, Beuerle T, Menda
N, Shafir S, Zamir D, Adam Z et al (2002). O-methyltransferases
involved in the biosynthesis of volatile phenolic derivatives in
rose petals. Plant Physiol, 129: 1899~1907
Li HM, Rotter D, Hartman TG, Pak FE, Havkin-Frenkel D, Belanger
FC (2006). Evolution of novel O-methyltransferases from the
Vanilla planifolia caffeic acid O-methyltransferase. Plant Mol
Biol, 61: 537~552
Liu CJ, Deavours BE, Richard SB, Ferrer JL, Blount JW, Huhman
D, Dixon RA, Noel JP (2006). Structural basis for dual function-
ality of isoflavonoid O-methyltransferases in the evolution of
plant defense responses. Plant Cell, 18: 3656~3669
Muzac I, Wang J, Anzellotti D, Zhang H, Ibrahim RK (2000). Func-
tional expression of an Arabidopsis cDNA clone encoding a
flavonol 3-O-methyhransferase and characterization of the gene
product. Arch Biochem Biophys, 375: 385~388
NDong C, Anzellotti D, Ibrahim RK, Huner NP, Sarhan F (2003).
Daphnetin methylation by a novel O-methyltransferase is asso-
ciated with cold acclimation and photosystem II excitation pres-
sure in rye. J Biol Chem, 278: 6854~6861
Novikova IY, Tulaganov AA (2002). Physicochemical methods for the
analysis of galanthamine (review). Pharm Chem J, 36: 623~627
Ru Q, Wang X, Liu T, Zhang H (2013). Physiological and compar-
ative proteomic analyses in response to nitrogen application in
an Amaryllidaceae plant, Lycoris aurea. Acta Physiol Plant, 35:
271~282
Schmidlin L, Poutaraud A, Claudel P, Mestre P, Prado E, Santos-Rosa
M, Wiedemann-Merdinoglu S, Karst F, Merdinoglu D, Hu-
gueney P (2008). A stress-inducible resveratrol O-methyltrans-
ferase involved in the biosynthesis of pterostilbene in grapevine.
Plant Physiol, 148: 1630~1639
Wang R, Xu S, Jiang Y, Jiang J, Li X, Liang L, He J, Peng F, Xia B
(2013). De novo sequence assembly and characterization of
Lycoris aurea transcriptome using GS FLX titanium platform of
454 pyrosequencing. PLoS One, 8: e60449
Waugh DS (2005). Making the most of affinity tags. Trends Biotech-
nol, 23: 316~332
Wein M, Lavid N, Lunkenbein S, Lewinsohn E, Schwab W, Kalden-
hoff R (2002). Isolation, cloning and expression of a multi-
functional O-methyltransferase capable of forming 2,5-dimeth-
yl-4-methoxy-3(2H)-furanone, one of the key aroma compounds
in strawberry fruits. Plant J, 31: 755~765
Yoshihara N, Fukuchi-Mizutani M, Okuhara H, Tanaka Y, Yabuya
T (2008). Molecular cloning and characterization of O-meth-
yltransferases from the flower buds of Iris hollandica. J Plant
Physiol, 165: 415~442