全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 30(3)：41l一 415 2010年 5月
忽地笑愈伤组织培养条件对加兰他敏合成的影响
茹巧美 ，裴真 明1，2，郑海雷1
(1．厦门大学 生命科学学院，福建 厦 门 361005；2．杜克大学 生物系 ，NC 27708，USA)
摘 要 ：研究了忽地笑次生代谢产物加兰他敏的合成 以及各种理化因子对加兰他敏合成 的影响。结果表明，
蔗糖是忽地笑愈伤组织培养的最佳碳源，而且在 9O g／L浓度培养下加 兰他敏含量最高，达到 0．068％；附加
500 mg／L苯丙氨酸前体物也可提高加兰他敏产量。酪氨酸和水杨酸不利于加兰他敏的积累。此外，2，4-D和
浓度高于 0．5 mg／L的 NAA、IBA抑制加兰他敏的合成 ，但高浓度的 6-BA却对加兰他敏的合成起促进作用。
关键词 ：忽地笑 ；愈伤组织；加兰他敏 ；蔗糖 ；L-苯丙氨酸
中图分类号 ：Q943 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2010)03-041 1-05
Effects of the culture conditions on galanthamine
biosynthesis in Lycoris aurea calluses
RU Qiao-MeiI，PEI Zhen-MingI一，ZHENG Hai-LeiI
(1．SchoolofLi Sciences，Xiamen University，Xiamen 361005，China；2．Departmcnl
ofBiology，Duke University，Durham，NC 27708，USA)
Abstract：The biosynthesis of galanthamine in callus culture of Lycoris aurea was studied．Some factors affected the
biosynthesis of galanthamine were investigated．The results showed that sucrose was the best carbon source，and the
concentration of 90 g／L was the most prderable fof galanthamine production，which was reached to 0．068 ．Mean—
while，adding 500 mg／L L-phenylala~ e tO medium，galanthamine content was also improved．Tyrosine and salicylic
acid were not suitable for galanthamine accumulation in calluses．Besides，2，4一D inhibited the biosynthesis of galan—
thamine．Moreover，NAA and IBA above 0．5 mg／L could restrain the production of galanthamine，but 6-BA treated
with high concentration promoted the biosynthesis of galanthamine．
Key words：Lycoris aurea；calus；galanthamine；sucrose；L-phenylalanine
石蒜科植物具有较高的观赏价值和药用价值。
其花型美观，是一种很好的切花观赏植物；其鳞茎中
含有石蒜碱、伪石蒜碱、加兰他敏等多种生物碱，大
多具有阻止乙酰胆 碱酶对 乙酰胆碱分解 的作用 ，其
中加兰他敏是最重要的一种。目前，加兰他敏及衍
生物用于预防和治疗早老性痴呆症(阿尔茨海默
病)。尽管有加兰他敏有机合成的报道，但大多数化
学合成的路线长、收率低且要选用多种手性试剂，条
件苛刻，因此成本非常昂贵，合成同样剂量加兰他敏
的成本与从天然植物 中提取加兰他敏 的成本不相上
下甚至略高(刘涛，2006)。因此，生物技术手段可以
看作是生产加兰他敏的有效途径。忽地笑(Lycoris
aurea)又名黄花石蒜，属于石蒜科，其鳞茎中含有较
高的加兰他 敏 (干鳞 茎加 兰他 敏含 量为 0．034 )
(卢艳花，2005)。目前，忽地笑组织培养再繁已有成
功报道(王清等，2006)，但培养条件对忽地笑愈伤组
织中加兰他敏含量的影响还未见有报道。因此，本
文研究了改变忽地笑愈伤组织培养条件对加兰他敏
含量的影响，以期为忽地笑的细胞悬浮培养和工业
化生产加兰他敏提供一定的科学依据。
收稿日期：2008—01-02 修回日期 ：2009-08—11
基金项目：国家自然科学基金(30670317，30271065，39970438)；厦门大学新世纪优秀人才支持计StJ(0000~X07115)[Supported by National Natural Science
Foundation of China(NSFC)(30670317，30271065，39970438)；Program for New Century Excelent Talents in Xiamen unive ty(Nc盯xMu X07115)]
作者简介：茹巧美(1982一)，女。浙江义乌人，博士研究生，主要研究方向为植物生理生化，(E-mail)ruqiaomei@xmu．edu．cn。
通讯作者(Author for c0rrespondence，E-mail：Zhenghl@xmu．edu．on)
412 广 西 植 物 3O卷
1 仪器与试药
仪器：美国 Agilent 1loo型高效液相色谱仪，
配在线脱气机、四元泵、柱温箱、二极管阵列检测
器 、化学工作站。试药 ：二 氯甲烷 、甲醇 为色谱纯 ，
其他试剂均 为分析纯 ；加 兰他敏 对 照品购 于 中国
药品生物制品检定所；忽地笑选购于四川成都双
流县成都 市特色 种业研 究所 ，经 厦 门大学植 物标
本馆鉴定 。
2 方法
2．1忽地笑愈伤组织的诱导
选用生长健壮的忽地笑鳞茎，剥去鳞茎外褐色
鳞皮及干鳞片，切除球颈及根系，先用 75 乙醇表
面消毒 30 S，再用 2 次氯酸钠溶液消毒 30 rain，无
菌水冲洗 3次，将鳞茎 切成 带鳞茎盘 的双鳞片
(“two-scales”)(Sel6s，1999)。培养基为 MS，附加
2 mg／L 2，4-D，蔗糖浓度为 30 g／L，琼脂为 8 g／L，
pH5．7。光照时间为 16 h／d，(25±1)℃温度下培养
(Bergofibn等，1996)。每 2周继代一次。
2．2影响加兰他敏合成的因素调控
2．2．1不同碳源及蔗糖浓度对加兰他敏合成 的影响
不同碳源处理：对照组 MS固体培养基中碳源与
MS基本培养基中的相同，实验组中的碳源分别为
30 g／L乳糖、30 g／L果糖和 30 g／L葡萄糖。处理
方法是首先配制如上不同碳源的 MS固体培养基，
分装于三角瓶中，121℃灭菌 20 rain，备用。然后取
生长良好、颗粒均一及处理前统一在 MS基本培养
基中培养 2周的愈伤组织，分别接入上述相应的培
养基中培养，其它培养条件不变。不同蔗糖浓度处
理：对照组 MS固体培养基中蔗糖含量为 30 g／L，实
验组中的蔗糖含量分别为60 g／L、90 g／L、120 g／L和
150 g／L。培养基分装灭菌和愈伤组织接种同上。
2．2．2植物激素组合对加 兰他敏合成的影响 实验
中的植物激素配比及含量如表 1所示。配制不同激
素组合的 MS固体培养基。培养基分装灭菌和愈伤
组织接种同上。
2．2．3添加附加物 在培养基中添加一定量的L-苯
丙氨 酸 (0、250、500、750、1 000 mg／L)、酪 氨 酸
(0．1、0．5、1．0、5．0 mg／L)和水杨酸(O．1、1．0、5．0、
10．0 mg／L)等附加物，以便探索加兰他敏的生物合
成途径。方法是首先配制与继代培养时相同的MS
作为对照组；再分别配制 L一苯丙氨酸、酪氨酸和水
杨酸的母液，用 0．22 m无菌型尼龙膜 (Milipore)
过滤消毒；分别取一定量相应前体的母液加入到已灭
菌的 MS固体培养基中。培养基分装灭菌和愈伤组
织接种同上。2周后统一取样。分别测定愈伤组织
中加兰他敏的含量，每组每个样品设 3个平行实验。
表 l 激素组合正交试验因素水平表
Table l Factors and levels of orthogonal test
for phytohormones combination
2．2．4加兰他敏含量的测定 加兰他敏标准曲线的
制作：精确称取加兰他敏对照品 12．5 mg置 25 mL
容量瓶中，加人氨水 2～3滴，用甲醇溶解并稀释至
刻度，摇匀，精密量取溶液 0．5 mL，l mL，2 mL，3
mL，4 mL,~5-ti-L-和 6 mL，分别用甲醇稀释至 lO
mL，摇匀，作为对照品溶液，分别进样，测定峰面积。
以加兰他敏 的 色谱 峰面 积 A 和对 照品溶 液浓度
(mg／mL)作 线 性 回归分 析，线 性方 程 为：Y=
6．O656 一24．701，R =0．9998。加兰他敏含量的
提取及测定：根据范华均等(2006)和 Bergofi6n等
(1996)方法改进。准确称取 0．75 g左右烘干的忽
地笑愈伤组织，置于提取内罐中，再加入 15 mL的
甲醇溶剂，套上保护套，旋好外盖，放人 Mars—X型
微波炉中，在 85℃下提取 10 rain。冷却后，取出提
取内罐，将提取液过滤。过滤后母液旋转蒸干，用
15 mL 5 的醋酸溶解，转移到分液漏斗中，用 1O
mL石油醚萃取 3次，酸相用浓氨水调节 pH8．0，再
分别用 lO mL氯仿萃取 3次，合并氯仿层，旋转蒸
发，用 0．5 mL甲醇回溶，过 0．22 m 有机滤膜，待
测。色谱条件：Hypersil ODS色谱柱(4．0 mm×
250 mm，5 m)；流动相为二氯甲烷一甲醇(100：8)，
流速 1．0 mL／rain；柱温室温；紫外检测波长 235
nm；进样量 2O L。
3 结果与分析
3．1不同碳源及蔗糖浓度对加兰他敏合成的影响
实验选用了蔗糖、乳糖、果糖和葡萄糖作为碳
3期 茹巧美等：忽地笑愈伤组织培养条件对加兰他敏合成的影响 413
源 ，比较它们对忽地笑加兰他敏积累的影响 ，结果见
图 1(a)。由图可见，4种碳源对加兰他敏的合成有
显著的影响。以蔗糖作为碳源，加兰他敏的合成量
最大 ，为 0．035 。葡萄糖和果糖均显著抑制加兰
他敏的合成。4种碳源中，乳糖效果最差，严重抑制
愈 伤 组 织 中 的 加 兰 他 敏 积 累，其 含 量 降 低 至
0．013 。此外 ，还设计 了以蔗糖为单一碳源 ，对蔗
糖浓度进行了考察，结果见图 1(b)。由图可以看
到，在 30～90 g／L范围内忽地笑愈伤组织的加兰他
敏含量随初始蔗糖浓度增加而增加。蔗糖浓度达
90 g／L时 达 到最 大 积 累 量，加 兰 他 敏 含 量 达 到
0．068 ，是初始蔗糖浓度培养下的 1．86倍。但随
着蔗糖浓度增加到 120 g／L和 150 g／L，加兰他敏
的累积却随蔗糖浓度增加而减少。
一
喇
m
川
口
R
一
口酬
钔
型
1lI
星
Sucrose d-Lactose Fructose G l UCOSe
不同碳源 D i fferent carbon sources
3O 60 90 1 20 15O
蔗糖浓度 Concentrat i on of sucrose(g／L)
图 1 不同碳源(a)和蔗糖浓度(b)对忽地笑
愈伤组织中加兰他敏合成的影响
Fig．1 Effects of different carbon sources(a)and
concentrations of sucrose(b)on the galathamine
biosynthesis of the Lycoris aurea callus
3．2不同植物激素组合对加兰他敏合成的影响
激素的种类、含量及其配比对植物细胞的生长
和新陈代谢起重要的调控作用 ，也对细胞次生代谢
产物的积累有重要的影响。在我们 的研究 中，2，4一
D，6一BA，NAA和 IBA 四种激素各设 3个梯度，按
正交表设计试验，结果如表 2所示：从极差来看，6一
BA对加兰他敏含量的影响程度最大，其次是 2，4一
D，再次是 NAA，IBA影响最小。从平均值来看，6一
BA浓度为 1．5 mg／L最佳，2，4一D浓度为 0 mg／L
最佳，NAA浓度为 0．5 mg／L最佳，IBA的浓度为
0．5 mg／L最佳 。所以本次试验所得 出的加兰他敏
合成最佳组合是 MS+2，4一D(0)+6-BA(1．5)+
NAA(0．5)+IBA(0．5)。
表 2 激素组合正交试验结果
phytohormones combination
霉 24-D 6-BA NAA IBA 善他警含l量a
F茎act号ors c m g／D)I cm 出g／ Icm g／ cmg／¨ ( ( )( I)( I)：‘ ⋯
1
1
1
2
2

0．1146
0．1004
0。0968
0．0382
0．0335
0．0323
0．0059
0．5
1
1．5
0．5
1
1．5
0．0769
O．1O54
O．1295
0．0256
0．O351
0．0432
O．O175
0．5
1
0
1
O
O．5
0．1042
O．1102
0．O974
O．O347
O．O367
0．0325
0．00427
1
O
0．5
0．5
1
O
0．1022
O．1082
O．1014
0．0341
O．O361
0．0338
0．0023
0．O257
O．O312
0．0435
0．O225
0．0320
0．0423
每 个处理做 3次重复 ，取其平均值
3．3不同附加物对加兰他敏合成的影响
在植物组织培养过程 中，人们经常采用在培养
基中加入各类附加物，诱导子或前体的方法来增加
培养物中有效成分的含量。我们选用了 L一苯丙氨
酸、酪氨酸和水杨酸作为附加物，比较它们对忽地笑
愈伤组织中加兰他敏含量的影响。
L一苯丙氨酸不仅是植物细胞内重要的原生代谢
物质，而且是合成许多次生代谢物质的前体。实验
结果也发现 L一苯丙氨酸对加兰他敏合成的影响较
大。愈伤组织中加兰他敏的含量与添加浓度并不呈
明显的线性关系 ：添加浓度为 500 mg／I L一苯丙氨
酸对忽地笑愈伤组织中加兰他敏积累有明显的促进
作用 ，达到 0．047 ，比对 照组提高 27 9／5；添加其他
浓度的 L一苯丙氨酸均显著抑制加兰他敏的积累。
酪氨酸是人们做植物组织培养时最常用的附加
物之一，因此我们选用了酪氨酸作为忽地笑愈伤组
织培养系的附加物，研究其对加兰他敏合成的影响。
由图2(b)可见，与对照相比，酪氨酸除0．1 mg／L处
理对加兰他敏合成无明显抑制，0．5 mg／L，1．0 mg／L
和5．0 mg／L浓度处理均严重抑制加兰他敏的合成，
分别下降为对照的48 ，43 和4O 。而且实验还
4 5 6 7 8 9 I Ⅱ Ⅲ R
0 5 0 5 0 5 O 7 6 5 4 3 Z， ㈣ 脚瞄 ∞ 叫
414 广 西 植 物 3O卷
发现酪氨酸浓度高于 0．1 mg／L处理时，愈伤组织
发黑，褐化严重 。
水杨酸是植物细胞内许多代谢物质合成的信号
分子，对次生代谢产物有重要影响。本试验培养基
中添加水杨酸对加兰他敏的合成具有明显的抑制作
用 ，而且随着添加浓 度的增加抑 制效果愈加 明显 。
同时发现在培养超过 10 d后 ，愈伤组织开始发黑 ，
濒临死亡，说明水杨酸对忽地笑愈伤组织具有毒性。
一
mI酬
加
型
圳
口
R
一
m删
钔
型
,ttl
·R
一
删
加
圳
器
0 250 500 750 1000
L一苯丙氨酸浓度(mg／L)
ConcentratiOR of L—phenyI aI amine
0 0．1 0．5 1．0 5．0
酪氨酸浓度 Concentrat i OR of tyros ine(mg／L)
040
030
020
O1O
O 0．1 1．0 5．0 10．0
水杨酸浓度 Concentration of saI icyI iC acid(mg／L)
图 2 不同浓度L一苯丙氨酸(a)、水杨酸(b)和酪氨酸
(c)对忽地笑愈伤组织中加兰他敏合成的影响
Fig．2 Effects of different concentrations of L—phen—
ylalanine(a)，tyrosine(b)and salicylic acid(c)on the
galanthamine biosynthesis of the Lycoris aurea calus
4 讨论
2O世纪 5O年代初 Gautheret(1955)首先对植
物组织培养中的糖类进行研究，他以胡萝 卜为材料
研究组织生长的最适浓度和不同糖类的效应，结果
表明蔗糖是最好的碳源。张娟芳等(2003)也报道蔗
糖最适合作为印楝细胞悬浮培养生长的碳源。本试
验结果表明，蔗糖作为忽地笑愈伤组织的碳源对加
兰他敏的合成最为有利，这与大多数资料上显示的
蔗糖为最适糖源具有一致性 。
蔗糖作 为重要的碳 源和能源，对植物离体细胞
次生物质(莽草酸、花青苷、胡萝 b素、蒽醌等)合成
代谢的影响规律相同，即浓度增加有利于次生物质
的合成 ，但不同 目的产物的适宜浓度不同，在 0~120
g／L蔗糖浓度范围内，胡萝 卜细胞茄红素含量随着蔗
糖浓度的增加而增加(梁燕等，2003)。但 Solantim
aviculare悬浮培养中，30 g／L的蔗糖或 30 g／L的葡
萄糖都严重抑制了类固醇和澳洲茄胺的合成；而 l5
～ 3O g／L蔗糖浓度却没刺激类固醇的合成(Lindsey
& Yeoman，1983)。因此，认为 9O g／L的蔗糖是忽地
笑愈伤组织培养的最佳碳源。这与 Sell6s等(1999)
报道 Narcissus confuses在 90 g／L蔗糖浓度悬浮培
养下加兰他敏含量最高一致。
生长调节物质通常是次生代谢产物积累的关键
因素。一般情况是，低浓度的生长素有利于次生代
谢和次生代谢产物的积累，而 2，4-D被证实在许多
植物细胞培养生产次生代谢物质中起抑制作用，如
杨属植物生产花青素、烟草中提取烟碱、紫草中提取
紫草宁，消除或用吲哚乙酸、吲哚丁酸取代 2，4一D能
增加目的产物的产量(Rajendranl等，1992)。我们
也发现，2，4一D对忽地笑愈伤组织加兰他敏积累有
负影响，尤其是高浓度 2，4一D明显抑制加兰他敏积
累。同时，王康才等(1998)报道高浓度 NAA对迷
迭香酸甲酯和咖啡酸的形成具有一定的抑制作用，
而 6-BA对 NAA具有一定的拮抗作用，这主要是因
为较高浓度的生长素会抑制次生代谢途径中一些重
要酶的活性，从而使产物的合成受阻(唐建军等，
l999)。在忽地笑愈伤组织中，高浓度 NAA对加兰
他敏的合成也具有一定的抑制作用，但高浓度 6-BA
却对加兰他敏的合成起促进作用，这与王亚琴等
(2007)报道高浓度 6-BA抑制杜仲悬浮细胞生产桃
叶珊瑚甙不一致 ，并没有与 NAA表现出拮抗关系。
苯丙氨酸作为一种前体物质在 Colblumei的细
胞培养中能提高迷迭香酸的产量，同样在东北红豆
杉的培养体系中加人苯丙氨酸对紫杉醇的产生也有
明显的促进作用(陈永勤，1997)。本研究发现，L一苯
丙氨酸的效果明显好于酪氨酸，这两种前体氨基酸
对加兰他敏的影响明显不同，可能是经不同的途径
转化为生物碱，前者是经历苯丙烷类途径，后者是经
历酪氨酸途径。在忽地笑细胞正常代谢过程中，苯
丙烷类 途径 中 的苯 丙 氨酸 解 氨酶 (phenylalanine～
ammonia—lyase)活性可能要高于酪氨酸途径中的酪
O 0 O O 0 0 0 9 0 ㈣㈣㈣㈣ ㈣ ㈣
3期 茹巧美等：忽地笑愈伤组织培养条件对加兰他敏合成的影响 415
氨酸解氨酶(tyrosine-ammonia—lyase)。此外，Fac—
chini(1996)报道茉莉酸能影响酩氨酸脱氢酶(tyro-
sine decarb0xylase)的活性 ，此酶在异喹啉和石蒜类
生物碱的生物合成中起作用，因此可能是通过酩氨
酸途径产生加兰他敏 的限制因子 (Rafll等 ，2004)，
而茉莉酸 不影响 苯丙 氨酸解 氨 酶 活性 (Facchini，
1996)。因此 ，我们也猜测苯丙氨酸和酪氨酸对忽地
笑愈伤组织加兰他敏合成的影响还与体内茉莉酸生
成是否被抑制有关。与其他报道水杨酸能够提高生
物碱含量不一致(Pitta—Alvarez，2000)，在本实验中
水杨酸显著减少忽地笑愈伤组织的加兰他敏含量，
表明加兰他敏的生物合成被水杨酸抑制。Rafll等
(2004)在 Narcissus confusus中也发现水杨酸抑制
加兰他敏的合成，可能因为水杨酸抑制加兰他敏途
径中某些重要酶的活性，阻碍了加兰他敏的产生。
5 结语
通过忽地笑愈伤组织培养条件对加兰他敏合成
的研究中，我们发现 90 g／L的蔗糖和 500 mg／L的
L厂苯丙氨酸处理能分别使加兰他敏含量提高至
0．068％和 0．048 ，是 野外种植 的 2倍和 1．4倍 ，
为建立忽地笑悬浮细胞体系生产加兰他敏提供了一
定的理论依据。
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