全 文 ：安徽农业大学学报 , 2009, 36(4):568-572
JournalofAnhuiAgriculturalUniversity
黄连金黄紫堇碱 9-O-甲基转移酶基因的克隆及序列分析＊
廖　海 ,周嘉裕
(西南交通大学生命科学与工程学院 , 成都 610031)
摘　要:克隆黄连 (CoptischineseFranch.)金黄紫堇碱 9-O-甲基转移酶(Scoulerine-9-O-methyl-transferase, SMT)
基因并做序列分析。采用 RT-PCR方法 ,以新鲜的黄连嫩叶 cDNA为模板 , 克隆出黄连 SMT基因的 cDNA序列。克
隆到的 cDNA序列全长为 1 375 bp, 编码一个 350个氨基酸残基组成的多肽 , 其核酸序列与日本黄连 、唐松草的
SMT基因的 cDNA序列同源性分别为 97%与 85%。将得到的序列提交 GenBank, 序列号为 EU980450。与日本黄
连 、唐松草 SMT基因的氨基酸序列比对 ,黄连 SMT具有相同功能区域 , 因而可以参与金黄紫堇碱的 9位氧原子的
甲基转移反应。黄连 SMT与其它植物 SMT的氨基酸酸序列的进化分析表明 , 它与同为毛莨科黄连属的日本黄连
的同源性较近。黄连 N-甲基乌药碱-3′-羟化酶基因的成功克隆为黄连植物中小檗碱的基因工程等研究打下了良好
的基础。
关键词:黄连;金黄紫堇碱-O-甲基转移酶;克隆;序列分析
　　中图分类号:R282.71 文献标识码:A 文章编号:1672-352X(2009)04-0568-05
Molecularcloningandanalysisofscoulerine-9-O-methyl-transferase
geneofCoptischineseFranch.
LIAOHai, ZHOUJia-yu
(CollegeofLifeScienceandEngineering, SouthwestJiaotongUniversity, Chengdu610031)
Abstract:InordertocloneandsequencethecDNAencodingscoulerine-9-O-methyl-transferase(SMT)from
CoptischineseFranch, thecDNA, encodingSMT, wasamplifiedbyRT-PCRwithcDNAlibraryofleavesasthetem-
plate.Theful-lengthcDNAofSMThas1 375 bpwithanopenreadingframeencoding350 aminoacidsofprotein.
TheaccessionnumberofSMTfromCoptischineseinGenBankisEU980450.TheSMTfromCoptischinesehas97%
and85% nucleotidesequencehomologytothesequenceofSMTfromCoptisjaponicaandThalictrumflavum, re-
spectively.ComparisonofthesequenceCoptischinesewithSMTfromCoptisjaponicaandThalictrumflavumshowed
thatSMTfromCoptischinesepossessesthesamefunctionalregionsinvolvedwithSMT.Furthermore, phylogenica-
nalysisontheaminoacidsequenceofSMTfromCoptischinesewithotherplantsshowedthatCoptischineseisclose-
lyrelatedtoCoptisjaponica.Thisworkunderlaysthefirststepforexploringthepathwayofberberinebiosynthesis
andforimprovingthecontentofberberineinCoptischineseFranch.
Keywords:CoptischineseFranch;scoulerine-9-O-methyl-transferase;cloning;analysisofsequence
　　黄连 (CoptischineseFranch),俗称味连 ,属于毛
莨科黄连属植物 。黄连是一种著名的中药 ,具有抑
菌 、消炎 、健胃和降压等多种生理功能 [ 1] 。研究表
明黄连的这些生理功能和药用价值与黄连中富含生
物活性成分小檗碱 (berberine)有十分密切的关
系[ 2-3] ,因此提高黄连的原小檗碱型生物碱含量以提
＊收稿日期:2008-12-29
基金项目:西南交通大学 “希望之星”项目与西南交通大学科技发展项目(20070109)共同资助。
作者简介:廖海(1974-), 男 ,博士 , 讲师。 E-mail:ddliaohai@yahoo.com.cn
高其药用价值 ,进而提高其经济价值 ,是黄连育种的
一个主要目标。
Takeshita等[ 4]从日本黄连中克隆了金黄紫堇
碱 9-O-甲基转移酶 (Scoulerine-9-O-methyl-transfer-
ase, SMT)的 cDNA序列 ,功能研究表明该酶能够催
化将(S)-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到金黄紫堇碱
的 9位氧原子上 ,形成四氢非洲防己碱的甲基化反
应 。结构分析研究发现日本黄连 SMT多肽链的氮
末端具有一段 10个氨基酸长度的信号肽序列 ,用于
内质网上的定位 ,表明 SMT基因首先表达出含有信
号肽的前体 ,信号肽序列经过翻译后的加工剪切 ,才
能形成成熟的 SMT蛋白。有研究结果表明 SMT的
过量表达能够显著提高小檗碱的含量 [ 4] 。Samanani
等 [ 5]对 SMT在黄连不同部位的表达开展研究 ,发现
SMT在黄连根茎中的转录水平最高 ,而根茎正是小
檗碱含量最高的部位 ,表明 SMT对小檗碱及其衍生
物的合成方向起着调节作用 ,可能是小檗碱生物合
成途径的关键酶 。作者以黄连为材料 ,克隆 SMT基
因 ,并做序列分析 ,这为了解小檗碱合成的分子基
础 ,以及为探索利用 SMT基因提高黄连的小檗碱含
量的可行性具有重要的指导意义。
1　材料与方法
1.1　材料
黄连 (CoptischineseFranch.)取自四川省峨眉
山市龙池镇 ,黄连 GAP生产基地 ,采集 3 ～ 5年生的
黄连。
1.2　总 RNA的提取
剪取黄连幼嫩的叶片 ,加液氮研磨成粉末 , RNA
的提取使用华舜公司的小量 RNA提取试剂盒 ,具体
步骤按说明书进行。
1.3　cDNA的获得
以纯化的 RNA为模板 ,以 oligo(dT)18为反转录
引物 ,采用 AMV反转录酶进行反转录获得 cDNA。
1.4　SMT基因的 PCR扩增
根据 GenBank所报道的已知植物的 SMT基因
的 cDNA序列 ,使用 PrimerPremier5.0引物设计软
件 ,由北京赛百盛生物技术服务有限公司合成所有
引物。
中间片段引物:
P1　5′-GCC(T)TAATATGTCTTCCT(A)ATGG-3′
P2　5′-TGAAGC(G)CCTTGT(A)GAAATTGG-3′
3′-RACE引物:
3SMT1　5′-TGATGCACCAGATTACCCAGGCG-3′
3SMT2　5′-CCTGGGGGTAAAGAGAGGACAAC-3′
5′-RACE引物:
反转录引物
5′-CAAAAGCAATAGTGGAACCAGCC-3′
5P1　5′-GATCCAAGGAAATCGCAGCACTG-3′
5P2　5′-TGGTGATAGTTGAGCATCTGCCC-3′
PCR反应体系为 10 ×PCRbufer2.5 μL, 2.5
mmol·L-1 dNTPs2.0 μL, 25 mmol·L-1 MgCl2 1.5
μL, 10 μmol·L-1引物各 1.0 μL, 5 U·μL-1 Taq聚合
酶 0.2 μL, 50 ng·μL-1 DNA模板 2.5 μL,加 H2O至
25 μL。
1.5　PCR产物的克隆与测序
PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳 ,采用 OMEGA
公司的胶回收试剂盒回收后 , 与 pMD18-T载体
(Takara,日本)连接 ,转化大肠杆菌 DH5α感受态细
胞 ,含 100 mg·mL-1青霉素的 LB平板筛选阳性克
隆。阳性克隆进一步经菌落 PCR鉴定后 , 37℃培养
12 h,送由北京赛百盛生物技术服务有限公司测序。
1.6　核苷酸序列分析
利用 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)的 BLAST
在线分析工具进行核苷酸序列分析。蛋白质的等电
点及分子量计算采用 ExPASY网站的 ComputepI/
Mwtool(htp://www.expasy.org/tools/pi tool.ht-
ml)进行 。采用 DNAMAN进行序列的系统进化树
分析 。
2　结果与分析
2.1　SMT基因的克隆与测序
以黄连嫩叶总 RNA反转录合成后的 cDNA为
模板 ,中间片段引物进行 PCR扩增后得到约 1 000
M.DNA分子量标准;1.RT-PCR产物;2.5′-RACE产物;
3.3′-RACE产物
M.DNAmarker;1.ProductofRT-PCR;2.Productof5′-RACE;3.
Productof3′-RACE
图 1　黄连金黄紫堇碱 9-O-甲基转移酶基因扩增结果
Figure1　 CoptischineseSMTfragmentamplifiedbyRT-PCR
56936卷 4期 廖　海等　黄连金黄紫堇碱 9-O-甲基转移酶基因的克隆及序列分析
bp的片段(图 1-A), 5′RACE扩增出约 300 bp的片
段(图 1-B), 3′RACE扩增出约 400 bp的片段(图 1-
C)。测序结果表明中间片段 、5′和 3′片段分别为
972、295和 387 bp。根据以上 3个片段的测序结
果 ,利用 VectorNTISuite7软件拼接得到黄连 SMT
基因的 cDNA序列(图 2)。黄连 SMT基因的 cDNA
序列全长为 1 375 bp,翻译起始位点为 65 bp处 ,
polyA信号位于 1 115 bp,开放阅读框共 1 056 bp,编
码 350氨基酸长度的多肽。该序列已提交 Gen-
Bank,序列号为 EU980450。
图 2　黄连金黄紫堇碱 9-O-甲基转移酶基因 cDNA及推导的氨基酸序列
Figure2　CompletenucleotidesequenceanddeducedaminoacidsequenceoftheCoptischineseSMT
2.2　黄连 SMT基因的核苷酸序列分析
采用 ExPASY网站的 ComputepI/Mwtool计算
黄连 SMT蛋白质的等电点为 5.15, 分子量为
38 484.15 Da。小檗碱的合成涉及去甲乌药碱 6-O-
甲基转移酶 、甲基乌药碱 4-O-甲基转移酶和 SMT。
3种 O-甲基转移酶的羧基端为 S-腺苷甲硫氨酸结合
区 ,保守性最强 ,氨基端是底物结合区 ,氨基酸序列
变化较大 ,这也从侧面反映它们分别催化不同的底
570 安 徽 农 业 大 学 学 报 2009年
物发生反应 [ 6] 。与日本黄连 、唐松草比较 , 黄连
SMT的氨基端的氨基酸序列特征方面很相似 ,只是
在前者氮末端多了一段 30个氨基酸长度的序列
(其中包括 10个疏水氨基酸长度的信号肽序列),
这段序列的缺失不会导致催化活性的下降 [ 4] 。
Chandrashekhar等 [ 7] 分析 56种不同植物来源
的氧甲基转移酶的羧基端 ,发现该区域有 3个结合
并催化 S-腺苷甲硫氨酸发生反应的结构域 (Motif
A, B, andC)。黄连 SMT的氨基酸序列中同样具有
3个类似的保守结构域 ,其中结构域 A由 LVDVGG-
GIG(198 ～ 206位)构成 , 结构域 B由 VPNAQ-
NILLKW(239 ～ 250位)构成 ,而结构域 C由 AL-
PENGTVIV构成(270 ～ 279位)(图 3)。并且不同
结构域之间的氨基酸数目相当保守 ,从结构域 A开
始到结构域 B结尾间隔 52个氨基酸残基 ,从结构域
B开始到结构域 C结尾间隔 30个氨基酸残基 [ 7] 。
以上分析表明 ,黄连 SMT不仅能够结合底物金黄紫
堇碱与 S-腺苷甲硫氨酸 ,还具有催化金黄紫堇碱发
生氧甲基转移反应的能力。
C.c:黄连;C.j:日本黄连;T.f:唐松草　C.c:Coptischinese;C.j:Coptisjaponica;T.f:Thalictrumflavum
图 3　黄连 、日本黄连和唐松草的金黄紫堇碱 9-O-甲基转移酶基因氨基酸序列比较
Figure3　ComparisonofaminoacidsequencesofCoptischineseSMTwithotherSMTenzymes
图 4　不同植物 O-甲基转移酶氨基酸序列的进化树(括号中为 GenBank登录号)
Figure4　PhylogenetictreebasedonaminoacidsequenceofO-methyltransferaseindifferentplants.Codesinthebracketsfor
GenBankaccessionnumber
2.3　不同植物 SMT基因的序列比较与进化分析
利用 BLAST在线序列比对结果表明黄连 SMT
基因的核苷酸序列与日本黄连 (CoptisJaponica)、
唐松草 (Thalictrumflavum)的 SMT基因的核苷酸
序列的相似性较高 ,分别为 97%与 85%(氨基酸序
列相似性分别为 94%与 85%)。
57136卷 4期 廖　海等　黄连金黄紫堇碱 9-O-甲基转移酶基因的克隆及序列分析
利用 DNAMAN软件将获得的黄连 SMT基因推
导的氨基酸序列与其它植物的 O-甲基转移酶进行
多重比对 ,并构建进化树(图 4)。可以看出 , O-甲基
转移酶被分成了两个家族 ,其中 SMT与 3-O-甲基转
移酶形成一个家族 ,而 4-O、6-O与 7-O-甲基转移酶
形成另一个家族 。黄连与日本黄连的同源关系最
近 ,其次为毛莨科的唐松草 ,而与其它植物的同源关
系较远 。
3　讨论
利用植物次生代谢途径中关键酶的 “基因修
饰 ”技术 ,促进或降低次生代谢产物的生物合成 ,进
而改良其品质是一种快速且有效的途径 [ 8] 。 SMT
是小檗碱形成的关键酶 ,利用调节关键酶的活性来
调控小檗碱的含量是一种有效的方法[ 9] 。比如
Takashita等 [ 4]利用 SMT的开放阅读框序列构建载
体 ,在大肠杆菌中有效表达 。本试验使用 RT-PCR
与 RACE技术得到了黄连 SMT基因的 cDNA序列 。
氨基酸序列分析表明 ,黄连 SMT具有完整的 SMT
蛋白的功能区域 ,以获得的开放阅读框序列构建相
应的表达载体 ,能够获得有活性的重组蛋白 。目前
正在进一步克隆黄连 SMT基因的上游信号肽序列
与调控序列 ,同时构建相应的表达载体对其功能进
行深入分析 ,以阐明黄连小檗碱合成的分子基础 ,探
索提高黄连小檗碱含量的有效方法 。此外 ,在未来
农业中 ,开展 SMT基因的克隆 、结构特点 、表达部位
和时空表达模式的研究 ,使之在黄连中大量 、持久地
表达 ,提高小檗碱产物的含量 ,使植物基因操作进入
产业化具有重要意义 。
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