全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (1): 51~56　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0360 51
收稿 2014-08-13　　修定 2014-12-26
资助 国家自然科学基金项目(31170237)。
致谢 山东省泰山学者团队建设工程。
* 通讯作者(E-mail: liuxin6080@126.com; Tel: 0532-88030311)。
Ca2+位于H2O2上游参与H2S诱导的拟南芥气孔关闭过程
李洪旺, 车永梅, 侯丽霞, 王兰香, 刘香凝, 刘新*
青岛农业大学生命科学学院, 山东省高校植物生物技术重点实验室, 山东青岛266109
摘要: 以拟南芥为材料, 利用药理学实验, 结合分光光度法和激光共聚焦显微技术, 研究了Ca2+在硫化氢(H2S)诱导拟南芥气
孔关闭过程中的作用及其与过氧化氢(H2O2)的关系。结果表明: H2S诱导气孔关闭, Ca
2+螯合剂EGTA和质膜Ca2+通道阻断
剂硝苯地平(Nif)能不同程度抑制H2S诱导的气孔关闭, 而内质网钙泵阻断剂毒胡萝卜素(Thaps)对H2S的作用无显著影响。
由此推测, Ca2+参与调节H2S诱导的拟南芥气孔关闭过程, 且胞质中Ca
2+来源于胞外Ca2+的内流。另外, H2S诱导拟南芥叶片
NADPH氧化酶基因AtRBOHD和AtRBOHF以及细胞壁过氧化物酶基因AtPRX34表达增强, 促进叶片和保卫细胞中H2O2积
累, EGTA对此起抑制作用, 而外源CaCl2处理上调AtRBOHD、AtRBOHF和AtPRX34的表达。表明Ca
2+可能位于H2O2上游参
与H2S诱导的拟南芥气孔关闭过程。
关键词: 硫化氢; Ca2+; 过氧化氢; 气孔关闭
Ca2+ Acts Upstream of H2O2 in Mediating H2S-Induced Stomatal Closure in
Arabidopsis thaliana
LI Hong-Wang, CHE Yong-Mei, HOU Li-Xia, WANG Lan-Xiang, LIU Xiang-Ning, LIU Xin*
Key Laboratory of Plant Biotechnology in Universities of Shandong Province, College of Life Sciences, Qingdao Agricultural
University, Qingdao, Shandong 266109, China
Abstract: Using Arabidopsis thaliana as material, the effects of Ca2+ in hydrogen sulphide (H2S)-induced guard
cell movement and its relationship with hydrogen peroxide (H2O2) were investigated through pharmacological
test combined with spectrophotography and confocal laser scanning microscopy techniques. The results showed
that sodium hydrosulfide (NaHS), a donor of H2S, caused stomatal closure, and this inductive effects were
weakened by addition of Ca2+ chelator ethylene glycol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N,N-tetraacetic acid
(EGTA) and plasma membrane Ca2+ channel blocker nifedipine (Nif), respectively, however, endoplasmic retic-
ulum calcium pump blocker thapsigargin (Thaps) had no significant effect on stomatal movement induced by
H2S. These observations suggest that Ca
2+ participates in H2S-induced stomatal closure, [Ca
2+]cyt elevation in re-
sponse to H2S is mainly due to calcium influx across the plasma membrane. In addition, H2S up-regulated the
expression of NADPH oxidase genes AtRBOHD, AtRBOHF as well as cell wall peroxidase gene AtPRX34,
prompted H2O2 accumulation in leaves and guard cells, while EGTA inhibited these effects of H2S. On the other
hand, exogenous CaCl2 promoted the expression of AtRBOHD, AtRBOHF and AtPRX34. Based on above
results, it can be concluded that Ca2+ acts upstream of H2O2 in mediating H2S-induced stomatal closure in
A. thaliana.
Key words: H2S; Ca2+; H2O2; stomatal closure
气孔是植物体与外界环境进行气体和水分交
换的通道, 气孔开闭调节着植物的光合作用、蒸
腾作用等重要生理过程, 进而影响植物的生长发
育和对环境的适应。植物通过特异的信号转导途
径感受不同环境刺激, 调节气孔运动。目前, 有关
气孔运动信号转导机制的研究已取得许多重要成
果, 发现干旱条件下, 脱落酸(abscisic acid, ABA)含
量升高, 通过Ca2+依赖途径和非依赖途径诱导气孔
关闭(Schachtman和Goodger 2008); 乙烯和茉莉酸
(jasmonic acid, JA)等植物激素均对气孔运动起调
节作用(Hossain等2011; 侯智慧等2012), Ca2+和过
氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)等是气孔信号转
导途径的重要信号组分(Xie等2014), 各信号转导
途径相互交织形成网络。
植物生理学报52
硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)是近年来发现
的植物内源气体信号分子, 参与调控植物的生长
发育和对环境的适应(Fang等2014; Lai等2014)。
许多研究表明, H2S也是调节气孔运动的重要信号
物质, 参与干旱、ABA、JA和乙烯等诱导的气孔
关闭过程(García-Mata和Lamattina 2010; Liu等
2011; 王兰香等2012; 侯智慧等2011); 外源H2S供体
硫氢化钠(sodium hydrosulfide, NaHS)亦可引起植
物叶片气孔关闭(侯智慧等2011; 叶青等2011), 但
H2S调控气孔运动的信号网络尚不清晰。
Ca2+和H2O2均是气孔运动信号转导过程中的
重要信号组分, 参与多种刺激诱导的气孔关闭过
程, 而且两者之间存在相互作用。如低浓度Ca2+促
进蓝光诱导的气孔开放, 而高浓度Ca2+介导一氧化
氮(nitric oxide, NO)诱导的气孔关闭过程(Zhao等
2013); 甲基乙二醛(methylglyoxal, MG)诱导拟南芥
保卫细胞胞质Ca2+震荡, 诱导气孔关闭(Hoque等
2012)。胞外ATP通过H2O2调控保卫细胞质膜Ca
2+
通道活性诱导蚕豆气孔张开(Wang等2014); NaCl
胁迫条件下, 外源Ca2+通过激活H2O2依赖型Ca
2+通
道, 增加胞质Ca2+, 诱导气孔关闭(Zhao等2011)。已
有研究表明, H2O2参与H2S诱导的拟南芥气孔关闭
(叶青等2011), Ca2+与H2S之间亦存在相互作用, 外
源H2S通过促进胞外Ca
2+进入细胞内以及钙调素
(calmodulin, CaM)的参与, 提高烟草悬浮细胞的耐
热性(Li等2012); 拟南芥H2S合成酶基因缺失导致
Ca2+通道基因表达下调(Jin等2013)。但尚不清楚
Ca2+是否参与H2S诱导的拟南芥气孔关闭过程, 以
及在H2S诱导气孔关闭的信号转导过程中Ca
2+和
H2O2的关系等。为此, 本文以拟南芥为材料, 研究
了Ca2+在H2S信号转导过程中的作用及其与H2O2的
关系。
材料与方法
1 材料
供试材料拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)野生
型(生态型为Col-0)购自美国的拟南芥生物资源中
心。将野生型拟南芥种子经10% NaClO灭菌15
min, 无菌水清洗5次后, 点种于无菌MS固体培养
基上, 置于4 ℃黑暗条件处理2~4 d后, 垂直放置于
光照培养箱(光/暗周期16 h/8 h, 温度22 ℃)中培养,
10 d后将拟南芥幼苗转移到灭菌的栽培基质(花卉
营养土与蛭石体积比为1:1)中, 在温室(光/暗周期
16 h/8 h, 光强120 μmol·m-2·s-1, 温度22 ℃, 相对湿
度70%)中培养。
NaHS、乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸[eth-
ylene glycol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N,N-
tetraacetic acid, EGTA]、硝苯地平(nifedipine,
Nif)、毒胡萝卜素(thapsigargin, Thaps)均购买于
Sigma公司 (美国 ) , 其他试剂为国产分析纯。
NaHS、EGTA、Nif、Thaps和CaCl2使用浓度分别
为0.1 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、1 μmol·L-1、15
μmol·L-1和10 mmol·L-1。
2 材料处理
取培养4~5周生长良好的拟南芥完全展开的
莲座叶, 进行以下处理: (1)光诱导使气孔张开, 撕
取其下表皮, 置于MES表皮条缓冲液(10 mmol·L-1
Mes/KOH、0.1 mol·L-1 CaCl2、50 mmol·L
-1 KCl、
pH 6.1) , 以及分别含NaHS、NaHS+EGTA、
NaHS+Nif、NaHS+Thaps的MES缓冲液中, 在光下
(光强200 μmol·m-2·s-1)处理30 min, 记录终态孔
径。(2)分别取拟南芥叶片, 置于H2O、CaCl2、
NaHS、EGTA、NaHS+EGTA共处理液内, 处理
0、5、15、30、60、120、240 min时测定H2O2的
含量及(或) NADPH氧化酶基因AtRBOHD、AtR-
BOHF和细胞壁过氧化物酶基因AtPRX34的表达
量。(3)光诱导使气孔张开, 撕取其下表皮, 分别置
于含NaHS、EGTA、NaHS+EGTA的MES缓冲液
中30 min, 随后将表皮条转移到装有20 μmol·L-1
H2DCF-DA溶液中, 25
℃避光孵育处理15 min, 用
于检测保卫细胞中H2O2的水平。
3 实验方法
参照刘国华等(2009)的方法测定气孔开度, 随
机取3个视野, 每个视野内随机取10个气孔。
拟南芥叶片H2O2含量的测定参照刘国华等
(2009)的方法。气孔保卫细胞胞质H2O2的检测参
照侯智慧等(2012)的方法。用20 μmol·L-1 H2DCF-
DA避光孵育处理15 min后, 用表皮条缓冲液多次
冲洗, 以确保染料完全洗干净。最后用488 nm蓝
色光激发, 发射波长为505~530 nm, 经激光共聚焦
扫描显微镜(LEICA TCS SP5 II)扫描。气孔保卫细
胞中H2O2的静态分布图像在LSM 5 Image Browse
软件包下获得。每个处理至少重复3次。
用TriZol试剂盒(Invitrogen, 美国)提取拟南芥
李洪旺等: Ca2+位于H2O2上游参与H2S诱导的拟南芥气孔关闭过程 53
总RNA。以总RNA为模板, Oligo d(T)18为引物, 在
逆转录酶M-MLV (TaKaRa, 大连)作用下合成第一
链cDNA。荧光实时定量PCR检测AtRBOHD、
AtRBOHF和AtPRX34表达量, 从Tair (http://www.
arabidopsis.org/)网站中找到AtRBOHD、AtRBOHF
和AtPRX34序列, 根据序列设计定量引物, 内参为
ACTIN。AtRBOHD正向引物: 5-AGACAGCAG-
GATACTTAG-3, 反向引物: 5-CCAAGCCATAA-
CATCATT-3; AtRBOHF正向引物: 5-GTTCTCT-
T A T T A G T T G G T C T T G - 3 , 反向引物 :
5-C TGT GC TGTATTCTGATGA-3; AtPRX34正向
引物: 5-GATATGGACTTTCCTCATCTTCTC-3, 反
向引物: 5-GGTGAGTTGAGCAGCGGAC-3;
ACTIN正向引物: 5-CACTGTGCCAATCTACGAG-
GGT-3; 反向引物: 5-CACAAACGAGGGCTG-
GAACAAG-3。用熔解曲线法检测实时定量PCR
产物的特异性, 采用MyiQ软件进行数据分析。
4 数据统计
所有实验结果均为3次重复的平均值±标准误
差。用DPS数据处理系统对测定结果进行方差
分析。
实验结果
1 Ca2+参与H2S诱导的拟南芥气孔关闭过程
EGTA是胞外Ca2+螯合剂, Nif是质膜上L型钙
离子通道阻断剂, 可以抑制胞外Ca2+的内流, 进而
抑制胞内Ca2+浓度的升高。图1表明, 单独使用一
定浓度的EGTA和Nif对气孔开度无显著影响; 当
EGTA和Nif分别与H2S的供体NaHS共处理时, 可不
同程度阻断H2S诱导的气孔关闭效应(P<0.05)。
Thaps是内质网钙泵阻断剂, Thaps通过抑制内质网
Ca2+-ATP酶活性, 诱导内质网中Ca2+的释放。图1
显示, Thaps对H2S的作用无显著影响。由此推测,
Ca2+参与调节H2S诱导的拟南芥气孔关闭过程, 且
Ca2+主要来源于胞外Ca2+的内流。
2 Ca2+位于H2O2上游参与H2S诱导的拟南芥气孔关闭
2.1 EGTA对H2S诱导的拟南芥气孔保卫细胞和叶
片中H2O2含量的影响
由图2和图3可以看出, H2S的供体NaHS可以
诱导拟南芥气孔保卫细胞(图2)和叶片(图3)中H2O2
含量增加, 处理后30 min达最高值。EGTA单独使
用对叶片和保卫细胞H2O2含量无显著影响, EGTA
与NaHS共处理显著抑制H2S对H2O2和气孔运动的
诱导作用(图2、图3), 由此证明Ca2+位于H2O2上游
参与H2S诱导的拟南芥气孔关闭过程。
2.2 EGTA对H2S诱导的拟南芥叶片AtRBOHD和
AtRBOHF相对表达量的影响
NADPH氧化酶和细胞壁过氧化物酶是植物
体内H2O2产生的重要途径, 为了进一步研究钙信
使与保卫细胞H2O2产生的关系, 我们检测了钙离
子螯合剂EGTA对H2S诱导的拟南芥叶片NADPH
氧化酶基因AtRBOHD和AtRBOHF以及细胞壁过氧
化物酶基因AtPRX34相对表达量的影响。结果表
明, H2S上调AtRBOHD和AtRBOHF的表达, EGTA
在一定程度上减弱H2S对AtRBOHD和AtRBOHF表
达的诱导效应(图4) (P<0.05)。
2.3 EGTA对H2S诱导的拟南芥叶片细胞壁At-
PRX34相对表达量的影响
图5表明, NaHS处理15 min后, 拟南芥叶片中
细胞壁AtPRX34表达量明显增加, 30 min时到最大
值, 而EGTA显著抑制NaHS对AtPRX34的诱导
效应。
2.4 CaCl2处理对拟南芥叶片AtRBOHD、AtR-
BOHF和AtPRX34相对表达量的影响
为了进一步说明Ca2+位于H2O2的上游参与
H2S诱导的气孔关闭过程, 我们检测了外源Ca
2+对
H2O2合成酶基因表达的影响。图6显示, 外源CaCl2
处理后30 min亦能上调AtRBOHD、AtRBOHF及
AtPRX34表达。综合图3~6结果可以推测, H2S可能
图1 EGTA、Nif及Thaps对H2S诱导的
拟南芥气孔运动的影响
Fig.1 Effects of EGTA, Nif and Thaps on H2S-induced
stomatal movement in Arabidopsis
不同小写字母表示同一处理时间下不同处理间差异显著
(P<0.05); 图3~6同此。
植物生理学报54
图2 EGTA对H2S诱导的拟南芥保卫细胞胞质H2O2含量升高的影响
Fig.2 Effects of EGTA on H2S-induced increase in H2O2 level in cytoplasm of Arabidopsis guard cells
A和B: MES; C和D: NaHS; E和F: EGTA; G和H: EGTA+NaHS。标尺=5 μm。
图3 EGTA对H2S诱导的拟南芥叶片H2O2含量升高的影响
Fig.3 Effects of EGTA on H2S-induced increase in H2O2 level in leaves of Arabidopsis
图4 EGTA对H2S诱导的拟南芥叶片AtRBOHD和AtRBOHF相对表达量的影响
Fig.4 Effects of EGTA on H2S-induced AtRBOHD and AtRBOHF relative expression levels in leaves of Arabidopsis
李洪旺等: Ca2+位于H2O2上游参与H2S诱导的拟南芥气孔关闭过程 55
通过钙信使促进NADPH氧化酶和细胞壁过氧化物
酶基因表达, 诱导H2O2产生, 进而调控植物气孔的
运动。
讨　　论
H2S是近年发现的植物内源气体信号分子, 参
与气孔运动的调控, 外源H2S供体NaHS亦可通过
H2O2引起植物叶片气孔关闭(侯智慧等2011; 叶青
等2011)。Ca2+是气孔运动信号转导过程中的主要
组分, 并与其他信号分子存在相互作用。Ca2+是否
参与H2S诱导的拟南芥气孔关闭? 其与H2O2介导的
信号途径是否存在联系? 本文利用胞外Ca2+螯合剂
EGTA、质膜L型钙离子通道阻断剂Nif以及内质
网钙泵阻断剂Thaps研究发现, EGTA和Nif能够不
同程度抑制H2S诱导的气孔关闭, 而Thaps对H2S的
效应无显著影响, 表明Ca2+参与H2S诱导的拟南芥
气孔关闭过程, 该过程中Ca2+主要来源于胞外Ca2+
图5 EGTA对H2S诱导的拟南芥叶片AtPRX34相对表达量的影响
Fig.5 Effects of EGTA on H2S-induced AtPRX34 relative expression level in Arabidopsis leaves
图6 CaCl2处理对拟南芥叶片AtRBOHD、AtRBOHF和
AtPRX34相对表达量的影响
Fig.6 Effects of CaCl2 on AtRBOHD、AtRBOHF and At-
PRX34 relative expression levels in leaves of Arabidopsis
的内流(图1、图2-A)。Alexandre等(1990)报道,
ABA可通过三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-triphosphate,
IP3)引起胞内钙库释放Ca
2+, 在H2S诱导气孔关闭过
程中, 通过什么方式引起质膜Ca2+通道开放, 导致
胞外Ca2+内流? 利用膜片钳技术结合药理学实验进
一步探究这些问题, 有助于深入理解H2S诱导气孔
关闭的信号转导机制。
H2O2作为植物体内的第二信使, 其在调控气
孔运动中作用机理的研究取得了很大的进展, 研
究表明, 植物体内主要来源于NADPH氧化酶、细
胞壁过氧化物酶、多胺氧化酶和草酸盐氧化酶等
途径。本实验室前期工作显示, 来源于NADPH氧
化酶、细胞壁过氧化物酶和多胺氧化酶途径的
H 2O 2参与H 2S诱导的拟南芥气孔关闭 (叶青等
2011); 本实验进一步证明H2S可以促进AtRBOHD
和AtRBOHF以及AtPRX34的表达(图4、图5), 提高
拟南芥叶片和保卫细胞H2O2含量(图3、图2-B), 而
EGTA抑制AtRBOHD和AtRBOHF以及AtPRX34的
表达(图4、图5), 抑制H2S诱导的拟南芥叶片及保
卫细胞H2O2含量的增加(图3、图2-B), 而外源
CaCl2处理上调AtRBOHD、AtRBOHF和AtPRX34
的表达(图6), 表明Ca2+可能位于H2O2上游参与H2S
诱导的拟南芥气孔关闭。
本文研究结果表明, H2S通过促进胞外Ca
2+内
流及胞内钙库释放Ca2+诱导保卫细胞胞质Ca2+浓度
升高, 从而促进H2O2产生, 诱导气孔关闭, 进一步
完善了H2S诱导气孔关闭的信号转导网络。Zhang
等(2009)的研究发现在RBOHD启动子区域存在磷
植物生理学报56
脂酸的结合位点, 在AtRBOHD、AtRBOHF以及At-
PRX34的启动子区域是否存在Ca2+信号的响应元
件? Dubiella等(2013)在拟南芥中分离到钙依赖型
蛋白激酶CPK5可以响应病原菌相关分子模式
(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)磷酸
化RBOHD蛋白, Kawarazaki等(2013)利用酵母双杂
交技术从拟南芥中分离到低温诱导蛋白AtSRC2,
可以与AtRBOHF的N端相互作用, 促进Ca2+依赖型
H2O2形成。那么, 在介导H2S诱导的气孔关闭过程
中, 在Ca2+的下游是否存在特异的Ca2+受体蛋白对
AtRBOHD、AtRBOHF以及AtPRX34活性起调节
作用? 利用分子生物学技术对这些问题深入研究,
将有助于H2S诱导气孔关闭机制的完善。
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