全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (12): 1193~1199 1193
收稿 2012-08-13　　修定 2012-10-17
资助 国家自然科学基金(30970228和31170237)、山东省自然科
学基金(ZR2010CM024)和植物生理学与生物化学国家重
点实验室开放课题(SKLPPBKF11001)。
* 通讯作者 (E-mail: liuxin6080@yahoo.com.cn; Tel: 0532-
88030224)。
H2S位于H2O2下游参与乙烯诱导拟南芥气孔关闭过程
侯智慧, 车永梅, 王兰香, 侯丽霞, 刘新*
青岛农业大学生命科学学院, 山东省高校植物生物技术重点实验室, 山东青岛266109
摘要: H2O2和H2S是植物体内重要的信号分子, 二者均参与乙烯诱导的拟南芥气孔关闭过程。以拟南芥野生型及其突变体
为材料研究了H2O2和H2S在乙烯诱导拟南芥气孔关闭过程中的相互关系。结果表明, 乙烯能够诱导野生型拟南芥叶片H2S
含量及L-/D-半胱氨酸脱巯基酶(L-/D-CDes)活性显著增加, 促进气孔关闭, 但对H2O2合成突变体AtrbohD、AtrbohF、Atpao2
和Atpao4植株叶片无显著作用; 乙烯亦可引起H2S合成突变体Atl-cdes和Atd-cdes气孔保卫细胞H2O2水平的显著增加, 但对其
气孔运动没有显著作用。此外, H2O2清除剂和合成抑制剂均能抑制乙烯诱导的拟南芥叶片H2S含量和L-/D-CDes活性的增
加及气孔开度的减小; 而H2S清除剂和合成抑制剂虽能抑制乙烯诱导的气孔关闭, 却不能改变乙烯对拟南芥叶片气孔保卫
细胞H2O2的作用效应。由此表明H2S位于H2O2下游介导乙烯诱导拟南芥气孔关闭过程。
关键词: 硫化氢; 过氧化氢; 乙烯; 气孔关闭
H2S Functions Downstream of H2O2 in Mediating Ethylene-Induced Stomatal
Closure in Arabidopsis thaliana
HOU Zhi-Hui, CHE Yong-Mei, WANG Lan-Xiang, HOU Li-Xia, LIU Xin*
Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong Province, College of Life Sciences, Qingdao Agricultural University,
Qingdao, Shandong 266109, China
Abstract: Hydrogen sulfide (H2S) and hydrogen peroxide (H2O2) as important plant signaling molecules both
participate in ethylene induced stomatal closure in Arabidopsis thaliana, but the relationship between them is
unclear. So we used A. thaliana wide type and related mutants as materials to study the interaction between H2S
and H2O2 in mediating ethylene induced stomatal closure. The results showed that ethylene triggered raise of
H2S content and L-/D-cysteine desulfhydrase (L-/D-CDes) activity as well as stomatal closure in leaves of A.
thaliana wild type, but not in those of H2O2 deficient mutants AtrbohD, AtrbohF, Atpao2 and Atpao4, ethylene
induced increase in H2O2 content in H2S deficient mutants Atl-cdes and Atd-cdes, but couldn’t induce stomatal
closure. H2O2 scavenger and synthesis inhibitors depressed the inducing effect of ethylene on H2S content, L-/
D-CDes activity as well as stomatal closure in leaves of A. thaliana. However, although H2S scavenger and
synthesis inhibitors suppressed ethylene-induced stomatal closure, but had no significant effect on ethylene-
induced increase in H2O2 content in guard cells of A. thaliana. From these data it can be deduced that H2S acts
downstream of H2O2 mediating ethylene-induce stomatal closure in A. thaliana.
Key words: hydrogen sulfide; hydrogen peroxide; ethylene; stomatal closure
气孔是植物与外界进行气体交换的门户, 气
孔运动直接影响着植物的光合作用、呼吸作用及
蒸腾作用等多种生理过程。气孔对外界刺激非常
敏感, 能对多种生物、非生物胁迫及ABA和乙烯
等植物激素做出反应(李保珠等2012; 安国勇等
2012; 高晶晶等2011)。业已证明, 乙烯作为一种重
要的植物内源激素介导了多种因素对气孔运动的
调控, 且作用存在差异。如, 在不同氮营养条件下,
外源乙烯可以不同程度提高芥末(Brassica juncea
L.)植株的气孔导度和光合作用 , 促进植株生长
(Iqbal等2011); 细胞分裂素(cytokinin, CTK)和生长
素(indole-3-acetic acid, IAA)亦通过调节乙烯合成
抑制脱落酸(abscisic acid, ABA)诱导的气孔关闭
(Tanaka等2005, 2006); 同时亦有报道乙烯通过过
植物生理学报1194
氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)介导UV-B辐射诱
导的蚕豆气孔关闭(He等2011), 能够诱导拟南芥气
孔关闭(Desikan等2006; 刘国华等2009; Liu等
2010), 且Ca2+、一氧化氮(nitric oxide, NO)和H2O2
是乙烯诱导气孔关闭信号转导途径的重要组分
(Liu等2010; Kolla等2007; 刘国华2009)。乙烯调控
气孔运动是个复杂的过程, 探明其调控机制对全
面了解乙烯的作用机制, 深入掌握气孔的开闭机
制具有重要的意义。
硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)和H2O2均是普
遍存在的信号分子, 植物体内H2S的主要合成酶是
L-/D-半胱氨酸脱巯基酶(L-/D-cysteine desulfhy-
drase, L-/D-CDes), 参与H2O2形成的主要酶有
NADPH氧化酶、细胞壁过氧化物酶和多胺氧化
酶。业已证明H2S参与ABA和茉莉酸等诱导的气
孔关闭过程(García-Mata和Lamattina 2010; 侯智慧
等2011), 干旱通过H2O2促进H2S积累进而诱导拟南
芥气孔关闭(王兰香等2012)。那么在乙烯诱导的
气孔关闭信号转导途径中H2S和H2O2二者之间的
联系怎样？为此, 本实验以拟南芥野生型、H2S和
H2O2合成突变体为材料, 运用植物生理学的技术
手段结合药理学实验, 研究H2S和H2O2在乙烯诱导
气孔关闭信号转导过程中的关系, 以期为进一步
掌握气孔运动的信号转导机制提供实验证据。
材料与方法
1 实验材料和试剂
以拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)野生型
(Col-0)、L-/D-CDes基因的T-DNA插入突变体Atl-
cdes (SALK_041918)和Atd-cdes (CS853264) (购自
美国的拟南芥生物资源中心)、多胺氧化酶基因的
T-DNA插入突变体Atpao2 (SALK_046281)和At-
pao4 (SALK_020782) (购自美国的拟南芥生物资
源中心)、AtrbohD和AtrbohF突变体(河北师范大
学陈玉玲教授惠赠)为材料。将野生型及突变体种
子经10% NaClO灭菌15 min, 无菌水冲洗5次后, 点
种于无菌MS固体培养基, 4 ℃条件下处理2~4 d打
破休眠, 转入光照培养箱(22 ℃, 16 h/8 h光周期)垂
直生长约1周, 转入到培养土(市售花卉营养土)和
蛭石(V/V=1:1)的混合培养介质中, 于光/暗周期16
h/8 h、温度18~22 ℃、光强120 μmol·m-2·s-1和相对
湿度70%下培养。
乙烯利、H2S清除剂次牛磺酸(hypotaurine,
HT)、H2S合成抑制剂氨基氧乙酸(aminooxyacetic
acid, AOA)、H2O2清除剂抗坏血酸(ascorbic acid,
AsA)、细胞壁过氧化物酶的抑制剂水杨羟肟酸
(salicylhydroxamic acid, SHAM)、NADPH氧化酶
的抑制剂二苯基碘(diphenylene iodonium, DPI)、
多胺氧化酶的抑制剂β-羟乙基肼(β-hydrox yethyl-
hydrazine, β-HEH)和二氨基十二烷(1,12-diamin-
ododecane, DADD)、L-半胱氨酸和D-半胱氨酸均
购于Sigma (美国)公司, 其他药品为国产分析纯。
2 实验材料处理
取培养4~5周生长良好的拟南芥野生型及各
突变体完全展开的莲座叶为实验材料, 进行以下
处理。
野生型拟南芥表皮条分别用MES缓冲液(10
mmol·L -1 Mes/KOH、0.1 mmol·L -1 CaCl2、50
mmol·L-1 KCl, pH 6.1), 以及用MES缓冲液配制的
0.004%乙烯利、H2S清除剂(15 μmol·L
-1 HT)、H2S
合成抑制剂(0.4 mmol·L -1 AOA、0.4 mmol·L -1
NH2OH、0.2 mmol·L
-1 C3H3KO3+0.2 mmol·L
-1 NH3)
或H2O2清除剂(0.1 mmol·L
-1 AsA)、H2O2合成抑制
剂(0.01 mmol·L-1 DPI、0.01 mmol·L-1 SHAM、0.5
mmol·L-1 DADD和1 mmol·L-1 β-HEH)的处理液处
理, 于处理后0.5 h测定气孔开度,
H2S合成突变体(Atl-cdes和Atd-cdes)和H2O2合
成突变体(Atpao2、Atpao4、AtrbohD和AtrbohF)表
皮条分别用MES缓冲液以及用MES缓冲液配制的
0.004%乙烯利处理, 于处理后0.5 h测定气孔开
度。
野生型拟南芥或H 2O 2合成突变体叶片用
0.004%乙烯利、H2O2清除剂或H2O2合成抑制剂的
处理液处理, 于4 h测定H2S含量和L-/D-半胱氨酸
脱巯基酶活性。
3 实验方法
3.1 气孔开度的测定
气孔开度的测定参照刘国华等(2009)的方
法。取生长良好4~5周龄拟南芥完全展开的莲座
叶, 光诱导使气孔张开。撕取其下表皮, 小心刷涂
上面粘附的叶肉细胞, 切成0.5 cm×0.5 cm的小块,
用显微测微尺测量气孔的初始孔径, 然后置于各
侯智慧等: H2S位于H2O2下游参与乙烯诱导拟南芥气孔关闭过程 1195
处理液中, 在光下(光强200 μmol·m-2·s-1)处理0.5
h。记录终态孔径。测量时, 随机取3个视野, 每个
视野内随机取10个气孔。
3.2 H2S含量和L-/D-CDes活性的测定
H2S含量的测定参照亚甲基蓝法(Sekiya等
1982); L-/D-CDes活性测定参照侯智慧等(2011)的
方法进行。
3.3 保卫细胞胞内H2O2的检测
使用特异性荧光探针H2DCF-DA检测保卫细
胞内的H2O2 (刘国华等2009)。取生长良好4~5周龄
拟南芥完全展开的莲座叶, 撕取其下表皮, 放入表
皮条缓冲液中, 光诱导3 h使气孔完全张开, 后将其
置于各种处理液(乙烯利、乙烯利与H2S清除剂共
处理液、乙烯利与H2S合成抑制剂共处理液)中处
理。处理后加入50 μmol·L-1 H2DCF-DA (Sigma, 美
国) 25 ℃下避光孵育20 min, 孵育完毕后用表皮条
缓冲液冲洗3次, 除去吸附的染料。将处理好的表
皮条置于载玻片上, 盖好盖片, 用488 nm蓝光激发,
发射波长在505~530 nm之间, 经激光共聚焦扫描
显微镜(Zeiss LSM 510 META)扫描, 气孔保卫细胞
中H2O2的静态分布图像在LSM 5 Image Browse软
件包下获得。
3.4 数据统计方法
每个样品每个处理进行3次重复。用DPS数
据处理系统作方差分析。
实验结果
1 H2O2位于H2S上游参与乙烯诱导气孔关闭的可
能性
1.1 H2S或H2O2清除剂和合成抑制剂对乙烯调控
的拟南芥气孔关闭的影响
为证明H2S和H2O2均参与乙烯对气孔运动的
调控, 检测了H2S清除剂HT和合成抑制剂AOA、
NH2OH、C3H3KO3+NH3及H2O2清除剂AsA、
NADPH氧化酶抑制剂DPI、细胞壁过氧化物酶抑
制剂S H A M、多胺氧化酶的抑制剂β - H E H和
DADD对乙烯诱导的气孔关闭的影响。结果表明,
H2S或H2O2清除剂和合成抑制剂均能抑制乙烯诱
导的拟南芥叶片气孔开度减小效应(图1), 说明二
者均是乙烯诱导气孔关闭信号转导途径的重要组
分。其中DPI和SHAM的作用效果要明显大于
β-HEH和DADD, 推测NADPH氧化酶和细胞壁过
氧化物酶是该过程中H2O2的主要来源。
图1 H2S或H2O2清除剂和合成抑制剂对乙烯调控拟南芥气孔运动的影响
Fig.1 Effects of H2S or H2O2 scavengers and synthesis inhibitors on ethylene-induced stomatal closure in Arabidopsis
小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。下图同。
1.2 乙烯对H2S或H2O2合成突变体叶片气孔运动
的影响
由图2可以看出, H2S或H2O2合成突变体叶片
气孔对乙烯的敏感程度下降, 其中乙烯对H2S合成
突变体Atl-cdes、Atd-cdes和NADPH氧化酶突变体
AtrbohF和AtrbohD几乎不起作用, 进一步证明H2S
植物生理学报1196
和H2O2参与乙烯诱导气孔关闭过程。
1.3 H2O2清除剂和合成抑制剂对乙烯调控的H2S含
量及L-/D-CDes活性的影响
为探明在乙烯诱导气孔关闭过程中H2S与
H2O2的相互关系, 检测了H2O2清除剂和合成抑制
剂对乙烯诱导的H2S含量及L-/D-CDes活性变化的
影响。结果表明, H2O2的清除剂和合成抑制剂均
能抑制乙烯诱导的H2S含量和L-/D-CDes活性的增
加(图3)。由此推测, H2O2通过作用于下游的H2S参
与乙烯诱导的拟南芥气孔关闭。
图2 乙烯对H2S或H2O2合成突变体叶片气孔运动的影响
Fig.2 Effect of ethylene on stomatal movement in H2S or H2O2 deficient mutants
图3 H2O2清除剂及合成抑制剂对乙烯调控的拟南芥叶片H2S含量(A)、L-CDes活性(B)和D-CDes活性(C)的影响
Fig.3 Effects of H2O2 scavenger and synthesis inhibitors on ethylene-induced H2S content (A), L-CDes activity (B)
and D-CDes activity (C) in Arabidopsis leaves
侯智慧等: H2S位于H2O2下游参与乙烯诱导拟南芥气孔关闭过程 1197
1.4 乙烯对H2O2合成突变体H2S水平和L-/D-CDes
活性的影响
图4显示, 乙烯可诱导野生型拟南芥叶片H2S
含量和L-/D-CDes活性升高(图4), 但对AtrbohD、
AtrbohF、Atpao2和Atpao4的诱导作用均有不同程
度减弱, 其中对AtrbohD和AtrbohF的诱导作用略低
于Atpao2和Atpao4。进一步推测H2O2通过作用于
下游的H2S参与乙烯诱导的拟南芥气孔关闭。
2 H2O2位于H2S下游参与烯诱导气孔关闭的可能性
2.1 H2S清除剂和合成抑制剂对乙烯诱导保卫细胞
H2O2水平的影响
为进一步探明乙烯诱导气孔关闭过程中H2S
和H2O2的关系, 研究了H2S清除剂HT及合成酶抑制
剂AOA、NH2OH和C3H3KO3+NH3对乙烯调控保卫
细胞H2O2水平的影响。结果表明, HT、AOA、
NH2OH以及C3H3KO3+NH3对乙烯诱导的拟南芥保
卫细胞中H2O2水平的增加没有显著影响(图5-A)。
2.2 乙烯对拟南芥野生型、Atl-cdes和Atd-cdes突
变体叶片保卫细胞中H2O2水平的影响
由图5-B可知, 与野生型类似, 乙烯同样诱导
Atl-cdes和Atd-cdes突变体气孔保卫细胞H2O2水平
的升高。综合本实验的结果可以推断, 在乙烯诱
导气孔关闭过程中H2S是H2O2的下游组分。
讨　　论
气孔是植物与外界进行气体和水分交换的主
要通道, 气孔开度的及时适度调节对于植物生存
至关重要。本实验室前期研究表明, 乙烯可以诱
导拟南芥气孔关闭, NO、H2O2和H2S是这一过程
中重要的信号传递组分(侯智慧等2011; 刘菁等
2011), 并推测在乙烯诱导气孔关闭的信号链中NO
位于H2O2的下游和H2S的上游起作用, 但尚未提供
H2O2和H2S二者在乙烯诱导气孔关闭中的作用关
系的直接实验证据。本文利用拟南芥野生型及
H2S合成突变体Atl-cdes和Atd-cdes以及H2O2合成突
变体AtrbohD、AtrbohF、Atpao2和Atpao4为材料,
图4 乙烯对拟南芥野生型、H2O2合成突变体叶片H2S含量(A)、L-CDes活性(B)和D-CDes活性(C)的影响
Fig.4 Effects of ethylene on H2S content (A), L-CDes activity (B) and D-CDes activity (C)
in leaves of Arabidopsis wild type and H2O2 deficient mutants
植物生理学报1198
进一步研究表明, H2S和H2O2均参与乙烯诱导气孔
关闭过程(图1); 乙烯可诱导野生型拟南芥叶片H2S
含量和L-/D-CDes活性升高 , 但对AtrbohD、
AtrbohF、Atpao2和Atpao4的诱导作用均不同程度
的减弱(图4), H2O2的清除剂和合成酶抑制剂均可
抑制乙烯诱导的拟南芥叶片H2S含量和L-/D-CDes
活性升高(图2); 乙烯诱导拟南芥野生型与H2S合成
突变体Atl-cdes和Atd-cdes叶片气孔保卫细胞H2O2
水平显著增加(图5-B), 并且H2S清除剂和合成抑制
剂不能减弱乙烯诱导的拟南芥叶片气孔保卫细胞
H2O2水平的升高(图5-A), 这为进一步证实H2S位于
H2O2下游参与乙烯诱导的拟南芥气孔关闭提供了
直接证据, 完善了乙烯诱导气孔关闭过程的信号
链(图6)。
气孔运动与K+和Cl-等溶质进出保卫细胞有
关, 在动物中, H2S可以影响膜对K
+和Cl-等离子的
通透性(Pouokam等2011), 在介导乙烯诱导的气孔
关闭过程中, H2S是否通过影响保卫细胞膜对K
+等
的通透性起作用？有研究表明ABC转运体(ATP-
binding cassette transporter)参与气孔运动的调节
图5 H2S清除剂和合成抑制剂对乙烯调控的拟南芥叶片保卫细胞H2O2水平(A)及乙烯对
拟南芥野生型、H2S合成突变体叶片保卫细胞H2O2水平(B)的影响
Fig.5 Effects of H2S scavenger and synthesis inhibitors on ethylene-induced H2O2 content in Arabidopsis guard cells (A) as well
as effects of ethylene on H2O2 content in guard cells of Arabidopsis wild type and H2S deficient mutants (B)
图上标尺均为5 μm。
图6 H2O2与H2S参与乙烯诱导拟南芥叶片气孔关闭
Fig.6 H2O2 and H2S involvement in ethylene-induced
stomatal closure of Arabidopsis
H2S: hydrogen sulfide, 硫化氢; L-/D-CDes: L-/D-cysteine des-
ulfhydrase, L-/D-半胱氨酸脱巯基酶; NO: nitric oxide, 一氧化氮;
NR: nitrate reductase, 硝酸还原酶; PAO: polyamine oxidases, 多
胺氧化酶; POD: peroxidase, 过氧化物酶; PAs: polyamines, 多胺;
RBOH: respiratory burst oxidase homologue, 呼吸爆发氧化酶, 又称
NADPH氧化酶(NADPH oxidase); SR: sulfite reductase, 亚硫酸盐还
原酶。
侯智慧等: H2S位于H2O2下游参与乙烯诱导拟南芥气孔关闭过程 1199
(Klein等2003; Suh等2007), H2S通过ABC转运体参
与ABA诱导的气孔关闭(García-Mata和Lamattina
2010), 在介导乙烯诱导的气孔关闭过程中是否有
ABC转运体的参与？这一系列问题的深入研究将
有助于气孔运动信号转导链的完善及运动机制的
进一步阐明。
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