全 文 ：啤酒酵母硫化氢生成量测定方法的研究*
丁书美,陈叶福,肖冬光,沈 楠,谷向春
(天津科技大学天津市工业微生物重点实验室,天津300222)
摘 要:建立了一种啤酒酵母硫化氢生成量的测定方法。以pH为6.0的乙酸锌溶液作吸收液,采用250mL三
角瓶进行发酵时,最适的发酵系统为:装液量150mL,发酵温度24℃,麦汁初始pH5.0,接种量6%。此方法可用
于定量比较不同酵母菌株的硫化氢生成量。
关键词:啤酒酵母;硫化氢;测定方法
中图分类号:TS262.5;TS261.11;TS207.3 文献标识码:B
硫化氢是对啤酒风味影响较大的挥发性含硫化合物。硫
化氢的气味阈值为 10μg/L,它对啤酒风味往往有双重作用,
即微量存在时,是构成啤酒风味某些特点的必要条件,过量则
不利[1]。硫化氢不仅本身对啤酒风味产生影响,它还是其它挥
发性含硫化合物形成的关键物质[2]。啤酒中大部分硫化氢来自
发酵过程中酵母对含硫氨基酸、硫酸盐和亚硫酸盐的同化作
用,以及酵母合成蛋氨酸受抑制时的中间产物[1,2]。不同酵母菌
株产生的硫化氢的量也不一样,在啤酒发酵过程中有的菌株
会产生20~50μg/L的硫化氢,有的则几乎不产硫化氢[3]。酵母
菌株不同所产生硫化氢量不同的原因是由于酵母细胞 ATP-
硫酸化酶、亚硫酸盐还原酶、半胱氨酸脱巯基酶的构成及浓度
不相同所致[4],所以可通过选择不同的啤酒酵母来控制硫化氢
的形成。
目前主要是采用醋酸铅显色平板来评价啤酒酵母产硫化
氢的能力[1],这种方法只能用于定性比较,不能对啤酒酵母产
硫化氢的能力进行定量分析,所以确定一个合适的简单的定
量测定硫化氢的方法以用于比较不同啤酒酵母硫化氢的生成
量显得尤为重要。本文主要围绕此问题,对建立一种测定啤酒
酵母硫化氢生成量的方法进行了研究。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种
啤酒酵母S-5、S-6、S-9,本实验室保存。
1.1.2培养基
麦芽汁培养基:由麦芽粉碎糖化制得,糖度10°BX,pH
自然。
1.1.3仪器和试剂
1.1.3.1主要仪器
752紫外光栅分光光度计。
1.1.3.2主要溶液
1.1.3.2.10.1%对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶液:称取对氨基二
甲基苯胺盐酸盐 0.5g溶于 1:1.5的盐酸溶液中并定容至
500mL。
1.1.3.2.20.03MFeCl3溶液:称取 0.811gFeCl3·6H2O溶于 1:
10的盐酸溶液中并定容至100mL。
1.1.3.2.30.25M醋酸锌溶液:称取 55g醋酸锌溶于烧杯中,调
pH为6.0并定容到1L。
1.1.3.2.4400μg/LS2-溶液:称取 3.7528gNa2S·9H2O溶于
1mol/L的NaOH溶液中,定容至 100mL,即得 5.00g/LS2-溶
液。再经两次稀释成400μg/LS2-溶液。
1.2实验方法
1.2.1硫化氢的测定
借鉴国标“水质硫化物的测定 -亚甲基兰分光光度法”
(GB/T14689-1996)[5]。
1.2.2啤酒发酵及发酵过程中硫化氢的吸收
发酵用带发酵栓的 250mL三角瓶,瓶中装一定量的麦
汁,取培养24h的种子液,按10%接种量接种到麦芽汁中。塞
上发酵拴,并用石蜡密封好,发酵栓中加入 10mLpH为 6.0
的乙酸锌吸收液,并把发酵栓用避光的塑胶布包好,放在衡温
培养箱中 28℃培养至二氧化碳失重不高于 0.2g时测定吸收
液中硫离子(S2-)的吸光度。
1.2.3吸收液的处理
将带有发酵栓的三角瓶置于 70℃的水中水浴 10min,并
不断的摇动,使三角瓶中残余的气体逸出,将发酵栓的 10mL
吸收液倒入试管中,用 5mL移液管吸取 5mL吸收液放在
10mL比色管中以待检测。
1.2.4发酵系统的优化
影响啤酒酵母硫化氢生成量的因素主要有温度、麦汁初
始pH、接种量等。为了确定一个合适的发酵条件,采用正交设
计对发酵系统进行优化,实验因素及水平见表1。
表1 实验因素及水平
收稿日期:2006-11-16
*天津市自然科学基金资助项目(05YFJMJC03000)
作者简介:丁书美(1981-),女,硕士研究生,研究方向为现代酿造技术。
通讯作者:肖冬光,教授,博士生导师,xdg@tust.edu.cn
水平
1
2
3
因素
温度(A)℃
24
26
28
麦汁初始pH(B)
5.0
5.5
6.0
接种量(C)%
6
10
14
文章编号:1002-8110(2007)02-0090-03
第34卷 第2期
2007年 3月
酿 酒
LIQUOR MAKING
Vol.34.№.2
Mar.,2007
· 90·
2 结果与讨论
2.1硫化氢标准曲线的制备
取 10mL比色管,每管依次加入 0、0.5、1、1.5、2.0、3.0、
4.0、5.0mL400ug/LS2-溶液,分别补水稀释到 5mL,加入
0.1%对氨基二甲基苯胺盐酸盐溶液 1mL,摇匀,再加入 0.03M
FeCl3·6H2O1mL,盖上塞子,摇匀,放置于暗处反应 10min,以
加0mLS2-溶液的为空白,用 10mm比色皿在 670nm下比色,
绘制标准曲线。
经线性回归,得到回归方程 Y=0.0006x-9E-17,相关系数
R2=0.9983,说明硫离子(S2-)浓度与吸光度值之间有良好的线
性关系。
2.2发酵系统的确定
由于啤酒酵母发酵过程中硫化氢的生成量很少,属于微
量代谢,这给测定啤酒酵母生成的硫化氢带来了一定的困难。
因此,在硫化氢的测定过程中,选择好适合的方法之后,还要
考虑到啤酒的发酵条件,比如接种量、装液量等其它因素的影
响。所以有必要研究各因素对啤酒酵母生成硫化氢的影响,以
确定一个比较好的发酵系统,便于硫化氢的测定。
2.2.1吸收液的选择
实际工作中,大都采用硫化锌沉淀的形式固定硫化氢。但
是在利用乙酸锌溶液吸收啤酒酵母生成的硫化氢时,因为发
酵过程中生成较多的二氧化碳,其与乙酸锌生成较多沉淀,不
但不利于乙酸锌与硫化氢反应生成硫化锌沉淀,而且在处理
吸收液(见1.2.3)时也带来很多不便。因此对于吸收液需要确
定一个合适的 pH,在此 pH时不形成碳酸锌沉淀,而硫化锌
以沉淀形式存在。
本实验采用0.25M的乙酸锌溶液做吸收液。配置不同pH
的乙酸锌溶液,按一定流速慢慢充入二氧化碳,记录各溶液形
成沉淀的时间,然后以不产生沉淀的 pH确定为吸收液的
pH,测定结果见表2。
表2 不同pH的吸收液在充入二氧化碳时产生沉淀的时间
由表 2可以看出,在吸收液的 pH为 6.0时,充二氧化碳
至32h都没有沉淀产生,而发酵至32h时,已过了发酵高峰
期,二氧化碳的生成量减少,因此这个时间足以排除乙酸锌与
二氧化碳反应生成沉淀的干扰。而且硫化锌在 pH为6.0时开
始沉淀[6]。所以选定吸收液的pH为6.0。
2.2.2不同装液量对硫化氢生成量的影响
采用 250mL的三角瓶进行发酵,麦芽汁装液量分别为
90mL,120mL,150mL,180mL,210mL,接种量为 10%,发酵至
二氧化碳失重不高于0.2g时测定吸收液中硫离子(S2-)的吸光
度,对照硫化氢标准曲线计算出硫化氢的量,结果如图2:
由图 2可以看出,在装液量为 150mL左右的时候,生成
的硫化氢的量最大。低于此装液量时,三角瓶中氧气的量比较
多,虽然有利于酵母的生长,硫化氢的生成量多,但由此产生
的负面影响相对更大,容易使生成的硫化氢发生氧化。高于此
装液量时,氧气量少,虽然避免了硫化氢的氧化,但使得酵母
的活性降低,生成的硫化氢的量减少。因此采用 250mL三角
瓶进行发酵时,最适宜于硫化氢测定的装液量为150mL。
图 2不同装液量对啤酒发酵过程中硫化氢形成的影响
2.2.3不同接种量对硫化氢生成量的影响
接种量对啤酒酵母硫化氢的产生量的影响,主要是接种
量对菌种的生长量起作用,在酵母代谢过程中,硫化氢的产率
与酵母代谢活性是相平行的,酵母生长率愈高,硫化氢的产率
也愈高。
采用 250mL的三角瓶,装液量为 150mL进行发酵,接种
量分别为6%,10%,14%,18%,22%,发酵至二氧化碳失重不
高于0.2g时测定吸收液中硫离子(S2-)的吸光度,结果如图 3。
由图3可以看出,硫化氢的产生量先是随接种量的增加而增
加,接着在接种量达到 10%之后,产生的硫化氢量就开始减
少。
图 3 不同接种量对啤酒发酵过程中硫化氢生成的影响
2.2.4发酵系统的优化
影响啤酒酵母硫化氢生成量的因素主要有温度、麦汁初
始pH,接种量等。为了确定一个较好的发酵条件,采用正交设
计对发酵系统进行优化,结果见表3,方差分析见表4。
溶液pH
出现沉淀的时间(h)
原始(7.13)
1.8
6.5
5.5
6.0
>32
第二期 2007酿 酒
· 91·
表3 L9(34)正交设计
表4 方差分析
来源
A
B
C
误差
总和
离差
2.007
126.071
208.486
0.154
336.718
自由度
2
2
2
2
8
均方离差
1.0035
63.0355
104.243
0.077
F值
13.032
818.643
1353.805
显著性
(*)
***
***
试验号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K1
K2
K3
U
Q
序列号
A
1
1
1
2
2
2
3
3
3
56.667
53.333
54.167
2996.541
2.007
B
1
2
3
1
2
3
1
2
3
68.333
55
40.834
3120.605
126.071
C
1
2
3
2
3
1
3
1
2
75
42.5
46.667
3203.020
208.486
硫离子(S2-)浓度(μg/L)
30
15
11.667
18.333
15
20
20
25
9.167
164.167
2994.534
平方
900
225
136.1189
336.0989
225
400
400
625
84.03389
3275.251
注:查表得F0.1=9.00,F0.05=19.00,F0.005=199,F0.1F0.005
从表4方差分析可以看出,在三个影响因素中,接种量
(C)和pH对发酵过程中硫化氢的生成量有显著影响,温度
(A)对硫化氢生成量的影响比较显著,得出的最适发酵条件
为A1B1C1,即温度为24℃,初始 pH为 5.0,接种量为 6%。该
条件在正交实验中出现(试验号 1),其结果数据(每升发酵
液中硫离子浓度最高 30μg/L)明显高于其它各组,故不再做
验证实验。
2.3不同菌株硫化氢生成量的比较
采用 2.2确定的发酵条件,测得三种啤酒酵母 S-5、S-6、
S-9的硫化氢的生成量见下表5。从实验结果看,不同菌株间
的硫化氢生成量存在一定的差异,此方法可用于定量比较不
同酵母菌株之间的硫化氢生成量。
表5 不同菌株硫化氢生成量
3 结论
建立了一种啤酒酵母硫化氢生成量的测定方法,此方法
可用于定量比较不同酵母菌株的硫化氢生成量,为啤酒酵母
硫代谢的研究与菌种的筛选提供了一种可行的方法。
[参考文献]
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水中溶解性硫化物[J].中国环境监测,2002,18(4):33-34
菌株
硫化氢的量(μg/L)
S-5
23.56
S-6
29.40
S-9
35.83
丁书美,等:啤酒酵母硫化氢生成量测定方法的研究第二期 2007
StudyontheDeterminationofH2SProducedby
Saccharomycescerevisiae
DINGShu-mei,CHENYe-fu,XIAODong-guang,SHENNan,GUXiang-chun
(TianjinUniversityofScienceandTechnology,TianjinIndustrialMicrobiologyKey-Lab,Tianjin300222,China)
Abstract:OnemethodofdeterminationofH2SproducedbySaccharomycescerevisiaewasstudied.Withthismethod,Zn(Ac)2wasusedas
trappingsolutionwhosepHwas6.0.Fermentationtrialswereconductatedin250mLconicalflasksfiledwith150mlinoculatedmedium.Flasks
wereincubatedat24℃afterinoculatedwith6%inoculumandthepHwas5.0.ThemethodcanbeusedtocomparethequantityofH2Sproduced
bydiferentstrains.
Keywords:Saccharomycescerevisiae,H2S,determination
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