全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (6): 860~868　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0105860
收稿 2015-03-06　　修定 2015-05-14
资助 国家自然科学基金(31171530)。
* 通讯作者(E-mail: lhjzju@aliyun.com; Tel: 15857135706)。
水稻POR基因的分离、定位与功能的初步研究
高小丽1,2, 李素娟2, 邵健丰2, 刘洪家2,*, 陶跃之2
1杭州师范大学生命与环境科学学院, 浙江杭州310036; 2浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所, 浙江杭州310021
摘要: 本研究发现水稻ygl3 (yellow green leaf3)突变体苗期的叶片呈黄绿色; 在营养生长后期, ygl3叶片从叶尖开始严重褪
色, 形成黄斑或白斑。图位克隆结果表明, YGL3编码一个定位于叶绿体的原叶绿素酸酯氧化还原酶B (OsPORB), 转基因互
补实验证实了图位克隆的结果。水稻基因组中存在两个POR基因OsPORA和OsPORB。RT-PCR分析表明, OsPORA主要在
新生的茎、叶和穗中表达, 而OsPORB为组成型表达。亚细胞定位分析发现OsPORA和OsPORB为叶绿体定位蛋白。此外,
用35S启动子驱动OsPORA表达能够完全互补ygl3的表型。虽然利用RNAi技术抑制OsPORA表达的转基因水稻叶片与野生
型呈现一样的表型, 但在ygl3背景下, 抑制OsPORA的表达导致转基因水稻黄化致死, 说明OsPORA和OsPORB为叶绿素合
成所必需的。以上研究结果说明OsPORA和OsPORB在功能上具有一定的冗余性, 但OsPORB比OsPORA的作用更重要, 揭
示了OsPOR在叶绿素合成途径上保守性。
关键词: 水稻; 叶绿素合成; OsPOR; 图位克隆; 叶绿体
Preliminary Study on Isolation, Mapping, and Function of NADPH: Proto-
chlorophyllide Oxidoreductase (POR) Gene in Rice (Oryza sativa)
GAO Xiao-Li1,2, LI Su-Juan2, SHAO Jian-Feng2, LIU Hong-Jia2,*, TAO Yue-Zhi2
1College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou, Zhejiang 310036, China; 2Institute of
Crops and Utilization of Nuclear Technology, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou, Zhejiang 310021, China
Abstract: In this study, a mutant was identified and named as ygl3 (yellow green leaf3) as the leaves of the mu-
tant are yellowish green at seedling stage and turning to yellow/white from the leaf-tip area during the late veg-
etative stages. The gene YGL3 encoding OsPORB, a chloroplast protein, was isolated through map-based clon-
ing and used to complement the ygl3 mutation successfully. The expression pattern and the relationship between
OsPORA and OsPORB, two PORs existed in rice, were then investigated. It was found from RT-PCR that ex-
pression of OsPORB was constitutive while the high level expression of OsPORA was occurred only in neona-
tal stems, leaves and spikes. The analysis of subcellular localization provided evidence that both OsPORA and
OsPORB are chloroplast protein. The mutated phenotype of ygl3 could be complemented by OsPORA driven
by the 35S promoter. The inhibition for the expression of OsPORA was then conducted through RNAi for both
wild type and ygl3 plants, the same phenotypic characteristics was observed from the transgenic plants of wild
type but not the ones of ygl3, illustrating that OsPORA and OsPORB are essential for chlorophyll synthesis.
These results indicated that the function of OsPORA and OsPORB are redundant, OsPORB is more important,
and the OsPORs are conservative during chlorophyll synthesis.
Key words: rice (Oryza sativa); chlorophyll synthesis; OsPOR; map-based cloning; chloroplast
植物叶绿素合成受阻往往导致叶色变浅, 如
白化、黄化、黄转绿、条纹和斑马等表型。叶色
突变体的表型可以发生在苗期、营养生长期和成
熟期等各个阶段, 是研究叶绿素合成和叶绿体发
育的良好材料。目前, 水稻中已发现了大量的叶
色突变体, 其中大部分基因被克隆, 它们参与叶绿
体发生发育或叶绿素合成等过程。
叶绿素是植物进行光合作用所必需的色素。
叶绿素生物合成途径有很多酶参与, 其中任何一
个酶功能缺失都会阻止叶绿素的正常合成, 产生
叶色突变体(Li等2014)。CDE(t)基因编码谷氨酰
tRNA合成酶, 催化谷氨酸与其特定的tRNA结合。
cde1(t)突变体在允许的低温(23 ℃以下)条件生长
时叶片的叶绿素含量正常; 当生长在允许的高温
高小丽等: 水稻POR基因的分离、定位与功能的初步研究 861
条件(26 ℃以上)时, 叶片为黄绿色(Liu等2007)。
镁离子鳌合酶(magnesium chelatase)由ChLI、
ChLD和ChLH三个亚基组成, 催化Mg2+插入原卟
啉IX中, 形成Mg2+-原卟啉IX (MgProto)的反应过
程。chl1 (ChLD)和chl9 (ChLI)突变体都呈现浅黄
绿色的叶片。chl1叶片浅黄绿色只出现在苗期, 而
chl9则整个生育期叶片都是浅黄绿色(Zhang等
2006), 此外, 缺失ChLH蛋白的水稻T-DNA插入突
变体是致死的, 叶绿素含量只有野生型的1% (Jung
等2003)。水稻ylc1 (young Leaf Chlorosis 1)和ylc2
(young Leaf Chlorosis 2)突变体苗期具有黄绿色的
叶片, 生长后期叶绿素逐渐恢复, 但新生的叶片仍
然为黄色(Zhou等2013; Li等2014)。YLC1编码一个
具有DUF3353功能域的叶绿体蛋白(Zhou等2013),
YLC1与拟南芥的CPP1 (CHAPERONE-LIKE PRO-
TEIN OF POR1)高度同源, 而CPP1能够以分子伴
侣的方式稳定POR蛋白(Lee等2013)。YLC2编码血
红素加氧酶OsHO2 (Heme Oxygenase 2), OsHO2不
具有血红素加氧酶的活性, 主要参与四吡咯生物
合成的调控(Li等2014)。水稻ygl1 (yellow green
leaf1)和ygl2 (yellow green leaf2)突变体的表型非常
相似, 发育的早期(3~4叶期)具有黄绿叶的表型, 从
分蘖期到抽穗期黄绿叶逐渐转为接近正常的绿色
(Wu等2007; Chen等2013)。YGL1编码叶绿素合成
酶, 催化叶绿素合成的最后一步反应, 即叶绿素酸
酯经过酯化反应转变为叶绿素(Wu等2007)。而
YGL2编码HO1 (Heme Oxygenase 1), 催化血红素
合成光敏色素前体胆绿素(biliverdin)。此外, 由于
光敏色素的合成受阻, ygl2突变体还具有提早开花
的表型(Chen等2013)。
叶绿素合成途径中唯一需要光的反应是NA-
DPH-原叶绿素酸酯氧化还原酶POR (NADPH:
protochlorophyllide oxidoreductase), 催化原叶绿素
酸脂(protochlorophyllide)转变成叶绿素酸酯(chlo-
rophyllide)的过程(Griffiths 1978)。目前已经在很
多物种中发现POR基因, 如烟草、大麦和拟南芥等
(Masuda等2002; Zavaleta-Mancera等1999; Holtorf
等1995; Armstrong等1995; Benli等1991; Oosawa等
2000)。大麦nyb (nanchong yellow barley)是一个叶
绿素缺失突变体, nyb突变体中成熟的POR蛋白大
大减少 , 但是nyb的突变基因还不清楚(Yuan等
2010)。拟南芥porb和porc突变体的表型正常, 但
是它们的双突变体具有苗期黄化致死的表型(Ma-
suda等2003)。水稻中有OsPORA和OsPORB两个
同工酶, fgl (faded green leaf)突变体在营养生长的
早期叶片为浅绿色, 生长后期叶片从叶尖开始出
现严重的褪色, 形成黄斑或白斑, 图位克隆的结果
发现FGL编码OsPORB (Sakuraba等2013)。虽然对
OsPORA的组织表达已进行了详尽的研究(Sakura-
ba等2013), 但是OsPORA的功能, 以及OsPORA和
OsPORB的关系还不清楚。本研究运用遗传学和
分子生物学等手段解析了水稻POR基因在叶绿素
合成中的功能。
材料与方法
1 植株材料
ygl3水稻突变体筛选自60Coγ对‘日本晴’ (Oryza
sativa L. subsp. Japonica cv. Nipponbare)种子进行辐
射诱变的突变体库。水稻种子经催芽后, 播种到装
有水稻培养液的黑钵的网纱上, 将黑钵放置于光照
培养箱(QHX-350BS-III)中, 温度设置为24 ℃, 24 h
持续光照, 光照强度为250 μmol·m-2·s-1。
2 方法
2.1 光合色素含量测定的方法
分别取光照培养箱生长10 d的野生型和ygl3
突变体的植株, 水田生长至抽穗期(主穗)和成熟期
(生长90 d)的自上而下的第一叶(剑叶)和第二叶,
光照培养箱生长10 d的OsPORA和OsPORB转基因
互补植株, 进行叶绿素含量测定。方法采用张其
德法(Lichtenthaler和Wellbum 1983; Liu等2010), 分
光光度计型号为岛津UV-1800。
2.2 图位克隆
以ygl3突变体为母本与籼稻‘Kasalath’ (Oryza
sativa L. subsp. indica cv. Kasalath)杂交, F1自交收获
F2定位群体, 进行表型鉴定、遗传学分析和基因定
位。选取F2定位群体中的20个突变型单株进行初
定位, 精细定位选用1 627个F2突变型单株, 根据日
本晴与kasalath的BAC末端序列信息, 利用Primer Pre-
mier 6.0设计STS (sequence tagged sites)标记(表3)。
2.3 互补突变体植株方法
OsPORA、OsPORB互补载体构建方法如下:
以水稻叶片cDNA为模板, 利用Kod plus (上海力耕
植物生理学报862
实业有限公司)扩增OsPORA、OsPORB的cDNA全
长, 上下游引物分别添加(KpnI XbaI; BamHI XbaI)
限制性酶切位点。PCR产物回收连接到pJet载体,
测序。用相应的限制性酶将pJET1.2/blunt上的目
的序列切出 , 连接到以相同方式酶切的pCAM-
BIA1301-35S-NOS的载体中。pCAMBIA1301在
EcoRI和SacI之间加入了CaMV 35S启动子, 在PstI
和HindIII之间加入了NOS-3终止子, 改造为pCAM-
BIA1301-35S-NOS。构建好的载体, 转入农杆菌
EHA105中, 然后用农杆菌介导的方法转染ygl3突
变体愈伤组织, 得到转基因植株。
2.4 OsPORA和OsPORB蛋白的亚细胞定位
我们将OsPORA、OsPORB的cDNA分别融合
EYFP (enhanced yellow fluorescent protein)连接到
pCAMBIA1301-35S-NOS载体上, 瞬时转染水稻原
生质体。水稻原生质体的制备方法: 取7~10 d的水
稻苗的茎、鞘组织, 在0.6 mol·L-1甘露醇溶液中横
切成0.5 mm小段, 用MES (10 mmol·L-1 MES, pH
5.7, 10 mmol·L-1 CaCl2, 0.1% BSA)酶液酶解4~5 h
后, 加入等体积的W5溶液(154 mmol·L-1 NaCl, 125
mmol·L-1 CaCl2, 5 mmol·L
-1 KCl, 2 mmol·L-1 MES,
pH 5.7)过滤, 离心, 收集沉淀, 加入MMG溶液(0.4
mol·L-1甘露醇, 15 mmol·L-1 MgCl2, 4 mmol·L
-1
MES, pH 5.7)浓缩得到原生质体。取100 μL原生
质体加入5~10 μg质粒进行转化, 室温暗培养, 过
夜, 用激光扫描共聚焦显微镜拍照, 详见Zhang等
(2011)方法。
2.5 OsPORA的RNA干涉植株创建
OsPORA干涉表达载体构建方法如下: 利用
Kod plus扩增OsPORA 219 bp的cDNA片段, PCR产
物回收连接到pJET1.2/blunt载体, 测序。219 bp的
cDNA片段正向和反向连接到玉米的NIR1基因的
第2个内含子的两端, 整个表达盒再克隆到pCAM-
BIA1301-35S-NOS中。构建好的载体, 转入农杆菌
EHA105中, 然后用农杆菌介导的方法分别转染‘日
本晴’和ygl3突变体的愈伤组织, 得到转基因植株。
2.6 RT-PCR分析方法
为了研究OsPORA和OsPORB的表达水平, 对
相关的植株进行RT-PCR分析。总RNA采用Trizol
(Invitrogen, USA)提取。反转录反应体系为25 μL,
经过DNAase I处理的3 μg总RNA, 以OligdT18为引
物, 利用M-MLV反转录酶(Promega, USA), 合成
cDNA。PCR反应体系为20 μL, 取1 μL cDNA为模
板。OsPORA和OsPORB采用Kod plus DNA聚合酶,
反应条件为95 ℃预热2 min, 27个循环(98 ℃ 10 s,
60 ℃ 30 s, 68 ℃ 1 min 30 s), 68 ℃延伸10 min, 取10
μL PCR产物, 在1%的琼脂糖胶上电泳检测。OsAc-
tin采用2×Specific Tag Master Mix (近岸蛋白科技有
限公司), 反应条件为94 ℃预热5 min, 27个循环(95
℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s), 72 ℃延伸7 min, 取
10 μL PCR产物, 在1%的琼脂糖胶上电泳检测。
2.7 引物
ygl3突变体突变基因定位所用引物在表1中列
出。OsPORA、OsPORB互补ygl3突变体, OsPO-
RA、OsPORB蛋白的亚细胞定位, OsPORA抑制表
达植株的创建, RT-PCR所用引物在表1中列出。
实验结果
1 ygl3突变体的表型分析
我们从60Coγ射线诱变的水稻(‘日本晴’)突变
表1 RT-PCR所用引物
Table 1 Primers of RT-PCR
引物 前引物序列(5→3) 后引物序列(5→3)
OsPORA互补 GGTACCACACTCACACCAATGGCTCT TCTAGAGACAGGCCTCTCTCACTGAA
OsPORB互补 GGATCCCACTTCGCTGCAGAGGAAAA TCTAGACCATCCCATGATCCACCAGT
OsPORA蛋白定位 GAGCTCATGGCTCTCCAAGTTCAGGC GGTACCGACGAGGCCGACGAGCTTCT
OsPORB蛋白定位 GGATCCATGGCTCTCCAGGCGGCCA GGATCCCTGATCGTGATCGGCCAAG
OsPORA RNAi正向 GGATCCACACTCACACCAATGGCTCT CTGCAGCTTCTTCCCGTCCGCCTT
OsPORA RNAi反向 CTCGAGACACTCACACCAATGGCTCT CTCGAGACACTCACACCAATGGCTCT
RT-PCR OsPORA ACACTCACACCAATGGCTCT GACAGGCCTCTCTCACTGAA
RT-PCR OsPORB CACTTCGCTGCAGAGGAAAA CCATCCCATGATCCACCAGT
RT-PCR OsActin GCATCTCTCAGCACATTCCA CTGGTACCCTCATCAGGCAT
高小丽等: 水稻POR基因的分离、定位与功能的初步研究 863
体库中筛选到1个黄绿叶突变体, 命名为ygl3 (yel-
low green leaf3)。ygl3苗期叶片为黄绿色(图1-A),
营养生长后期叶片从叶尖开始逐渐褪色, 形成黄
斑或白斑, 并且叶片的褪色程度与其衰老程度相
关(图1-B)。对光照培养箱中生长10 d的野生型和
ygl3突变体叶片的光合色素含量测定(表2)发现,
ygl3突变体的总光合色素含量为野生型的62.5%,
叶绿素a含量下降34.6%, 叶绿素b含量下降56.6%,
类胡萝卜素含量下降15.8%。抽穗期ygl3突变体的
色素含量与野生型没有明显差异。而到成熟期,
ygl3突变体第一叶的总色素含量只有野生型的
57.4%, 第二叶的总色素含量也只有野生型的
51.8% (表2)。苗期、抽穗期和成熟期的叶绿素a/b
值都增加。
图1 不同生长时期ygl3突变体的表型
Fig.1 Phenotypic characterization of ygl3 mutantin in different growth stages
A: 光照培养箱生长10 d; B: 田中生长90 d。
表2 不同生长时期ygl3突变体的光合色素含量
Table 2 Photosynthetic pigment contents of ygl3 mutant in different growth stages
生长时期 植株 叶绿素a含量/μg·g-1 叶绿素b含量/μg·g-1 类胡萝卜素含量/μg·g-1 总色素含量/μg·g-1 叶绿素a/b
苗期 WT 975.47±108.13 350.86±47.09 196.13±24.77 1 522.47±107.53 3.05±0.027
ygl3 638.37±44.32 152.37±9.77 160.19±13.13 950.94±66.72 4.18±0.056
抽穗期 WT第一叶 2 474.48±89.33 765.78±28.88 482.15±19.38 3 722.43±136.63 3.23±0.015
ygl3第一叶 2 342.13±67.99 609.82±24.84 517.94±12.27 3 469.89±103.48 3.85±0.039
WT第二叶 2 317.73±156.37 711.65±49.29 456.11±32.13 3 485.49±237.69 3.26±0.012
ygl3第二叶 2 315.93±52.21 606.58±14.97 485.26±10.55 3 407.78±75.83 3.82±0.056
成熟期 WT第一叶 2 174.15±149.20 705.40±51.11 412.98±25.61 3 292.54±225.09 3.09±0.011
ygl3第一叶 1 275.43±72.40 329.09±21.87 286.86±9.20 1 891.39±102.81 3.89±0.087
WT第二叶 1 991.38±83.25 653.43±26.04 416.45±18.82 3 061.26±127.97 3.05±0.022
ygl3第二叶 1 077.53±134.25 275.21±30.47 234.17±32.29 1 586.91±196.50 3.88±0.067
　　苗期: 光照培养箱生长10 d; 抽穗期: 主穗完全抽出; 成熟期: 田间生长90 d。
2 YGL3基因的图位克隆
遗传分析表明ygl3突变表型为单隐性核基因
控制。初定位选取ygl3突变体与籼稻‘Kasalath’创
建的F2定位群体中的22个突变型个体, 利用近似均
植物生理学报864
匀分布于12条染色体上的120个SSR标记进行连锁
分析, 将YGL3基因定位到标记STS1和STS2之间。
精细定位利用新发展的8个STS标记(表3), 对F2定
位群体中的1 647个突变型个体进行连锁分析, 成功
的将目标基因定位到105.5 kb的区间。对该区间的
候选基因进行测序分析, 发现OsPORB基因的第4个
外显子发生了单碱基的缺失突变(图2)。构建了以
35S为启动子的和OsPORB互补载体, 转化ygl3突变
体, 能够完全互补ygl3的突变表型(图3-A), 对转基
因互补植株的光合色素含量进行测定, 发现叶绿素
恢复到正常水平(图3-B)。这些结果说明ygl3的突
变表型是由OsPORB发生单碱基的缺失突变造成
的。此外, 我们用35S启动子驱动OsPORB的同源基
因OsPORA表达, 能够全面互补yg13的表型(图3)。
3 OsPOR组织表达模式分析
水稻中有2个POR基因OsPORA和OsPORB。为了
确定OsPOR的组织表达模式, 分别取生长10 d的野
生型的根、茎和叶; 抽穗期的穗、倒数1~5叶提取
RNA, 进行半定量RT-PCR分析。OsPORA在根中
微弱表达, 茎和叶中高表达; 抽穗期时的穗中高表
达, 而在第一叶表达最强, 其它叶片中表达逐渐下
降, 说明OsPORA在新生的组织中表达最强, 在衰
老的组织表达逐渐下降(图4)。OsPORB在所有检
测的组织中除根外都表现为组成型的高表达(图
4)。为了检测OsPORB突变是否影响其在突变体
中的表达, 对生长2周的野生型和ygl3突变体的
根、茎、叶中这两个基因进行RT-PCR分析, 发现
OsPORB的缺失突变并不改变OsPORB在突变体中
的表达, 对OsPORA的表达也没有影响(图5)。
4 OsPOR为叶绿体定位蛋白
为了确定OsPOR是否定位到叶绿体, 分别构
建了以35S为启动子的OsPORA和OsPORB与EYFP
表3 本研究开发的部分多态性STS标记
Table 3 Part of polymorphic STS markers developed in this study
标记名称 前引物序列(5→3) 后引物序列(5→3) 所在BAC
STS1 GTACCCAGCGAGCACTGAAT GGGACGGAGGTAGTATCTTGC AC068950
STS2 CCACCGAGGTAGTACATGAATTC CTTCTTTCATCGTTACCTGGCT AC079888
STS3 CTGAATGCAGCAAGCACAAG GACCACCAATTCCACATTGA AC068950
STS4 TCAACTTAGGAGGGGATAACCA GGTTTTGGGCATCACGTATC AC068950
STS5 AGTGTTACAATGGGTGTGTTCC GTTAGCGGGTGGTCAACAGT AC092489
STS6 GGTCATTGGATGGACCAACT CTCCGAATCCATCCGAAATA AC068923
STS7 GTGTCAAACCACCCACGTTT GCAGCTGACATTTGTGACCA AC068923
STS8 AACTGGTGCTTGCCGTGTTT AGAAACCCGTCATCTACCCA AC079888
图2 YGL3基因的精细定位和OsPORB基因结构示意图
Fig.2 The fine mapping of the YGL3 locus and the structure diagram of OsPORB
A: YGL3基因的精细定位; B: OsPORB基因结构示意图。n为F2群体中突变型单株的数目; 代表OsPORB基因。
高小丽等: 水稻POR基因的分离、定位与功能的初步研究 865
(enhanced yellow fluorescent protein)融合的表达载
体, 瞬时转化水稻原生质体, 发现OsPORA和OsPORB
特异的定位到叶绿体(图6), 是叶绿体定位蛋白。
5 OsPORA的功能分析
OsPORA和OsPORB是两个同工型的POR蛋
白, 为了阐明OsPORA的功能, 构建了OsPORA的
RNA干涉表达载体, 分别转化‘日本晴’和ygl3突变
体。转化水稻‘日本晴’共获得了20株独立的阳性
转基因苗, 这些转基因苗的表型和‘日本晴’完全相
同, 叶片也为正常的绿色(图7)。RT-PCR分析发现
OsPORA的表达被明显抑制(图8), 说明抑制OsPO-
RA的表达不影响水稻叶绿素的正常合成。对转化
ygl3突变体的转基因苗进行鉴定, 发现阳性转基因
苗为黄化苗, 并且不能存活(图9和10), 说明OsPO-
RA和OsPORB功能缺失, 叶绿素合成完全受阻。
讨　　论
我们筛选到一个60Coγ射线诱变的叶色突变体
ygl3。图位克隆结果证明OsPORB是突变基因。这
些结果说明ygl3与fgl是等位的(Sakuraba等2013),
但突变位点不同。此外, 我们对OsPORA和Os-
PORB的组织表达模式、亚细胞定位和功能进行
了研究。
OsPORA和OsPORB是水稻中的两个同工型
蛋白, 但是它们的表达模式完全不同。我们的实
验结果发现OsPORA主要在幼苗和新生的叶表达,
而OsPORB在各个组织中为组成型表达(图5), 这与
Sakuraba等(2013)的报道是一致的。OsPORA和
OsPORB表达模式与大麦的HvPORA和HvPORB的
图4 OsPORA和OsPORB在各组织中的表达
Fig.4 Expression of OsPORA and OsPORB in each organs
1~3分别为生长10 d野生型的根、茎、叶; 4~9依次为抽穗期
野生型的倒数1~5叶和穗。
图5 野生型与ygl3突变体中OsPORA、OsPORB的表达
Fig.5 Expression of OsPORA and OsPORB
in wild type and ygl3 mutant
1~3分别为生长2周的根、茎、叶。
图3 OsPORA和OsPORB互补ygl3突变体的表型和光合色素含量
Fig.3 Phenotypic characterization and photosynthetic pigment contents of ygl3 mutant that OsPORA and OsPORB complements
A: 互补植株的表型; B: 互补植株的光合色素含量测定。
植物生理学报866
表达模式相似, HvPORA在黄化苗大量表达, 见光
后迅速降低; 而HvPORB在整个叶片发育过程中组
成型表达(Holtorf等1995)。拟南芥中有3个POR蛋
白, 从表达模式上看, AtPORA在幼苗发的育早期
表达, AtPORC在幼苗发的育后期表达, AtPORB为
组成型表达(Masuda等2003; Sakuraba等2013)。与
水稻不同的是组成型表达的AtPORB为高光抑制,
而AtPORC是高光诱导的(Masuda等2003; Sakuraba
等2013)。说明单子叶和双子叶中POR蛋白的数量
和功能分工还是不同的。此外, 我们还对生长10d
的幼苗的根和抽穗期的穗中的OsPOR的表达进行
了分析, 发现OsPOR在根中只有微弱表达, 而在发
育的穗中OsPOR强烈表达, 表明OsPOR主要在地
上组织表达。
POR蛋白是叶绿素合成的最关键的酶之一,
叶绿素合成发生在叶绿体中, 而POR是由核基因编
码的, 在细胞质的核糖体上合成, 经过加工成熟后
运输到质体, 聚集到白化体(etioplasts)的内膜(Ry-
图6 OsPORA、OsPORB在水稻原生质体中的亚细胞定位
Fig.6 Subcellular localization of OsPORA and OsPORBin rice protoplast
A: OsPORA-EYFP; B: OsPORB-EYFP。1: 黄色荧光信号, 2: 叶绿体自发红色荧光信号, 3: 图1和2的重叠。
图7 野生型中OsPORA干涉植株的表型
Fig.7 Phenotypic characterization of suppressive
wild type with OsPORA
图8 野生型中OsPORA干涉植株的OsPORA和OsPORB的表达
Fig.8 Expression of OsPORA and OsPORB in
the suppressive wild type with OsPORA
1为生长2周的野生型; Ri-1、Ri-2和Ri-3分别为生长2周的
OsPORA干涉植株。
高小丽等: 水稻POR基因的分离、定位与功能的初步研究 867
berg和Sundqvist 1988)和叶绿体上(Teakle和Grif-
fiths 1993; Dahlin等1995)。OsPORA和OsPORB分
别与EYFP的融合蛋白特异的定位到叶绿体, 证明
OsPOR是叶绿体定位蛋白。更加精细的亚细胞定
位分析, 有助于阐明OsPOR的功能。
水稻中有OsPORA和OsPORB两个同工型的
蛋白, 目前已经发现2个OsPORB的突变体(fgl和
ygl3), 35S为启动子的OsPORA能够完全互补ygl3的
突变表型, 证明了它们的功能是相同的, 这与组成
型表达的AtPORA能够完全互补atporbatproc双突
变体的突变表型相似(Paddock等2010)。RNAi方
法抑制OsPORA的表达并不影响水稻叶绿素的正
常合成, 说明OsPORB可以互补OsPORA的缺失, 这
可能也是尚未发现OsPORA突变体的原因之一。
在ygl3背景下抑制OsPORA的表达, 能够完全
阻断叶绿素的合成。拟南芥单个AtPORB或At-
PORC突变没有异常表型, 但它们的双突变体具有
苗期黄化致死的表型(Masuda等2003)。说明水稻
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PORC是各自叶绿素合成所必需的。
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图9 ygl3突变体中OsPORA干涉植株的表型
Fig.9 Phenotypic characterization of ygl3 mutant
that OsPORA is suppressed
图10 ygl3突变体中OsPORA干涉植株的OsPORA、
OsPORB的表达
Fig.10 Expression of OsPORA and OsPORB in the ygl3
mutant that OsPORA is suppressed
1、2为ygl3突变体; Ri-ygl3-1和Ri-ygl3-2为OsPORA干涉植株。
植物生理学报868
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