全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 2期，2010年 2月 147
收稿 2009-11-27 修定 　2009-12-28
资助 广东省自然科学基金(8152404801000011)和广东省科
技攻关项目(2 006 B20 101 011 )。
* 通讯作者(E-mail: zengfuhua@gmail.com; Tel: 0759-
3 1 8 3 6 2 2 )。
尾叶桉的不同类型愈伤组织芽分化与某些相关生理生化指标的关系
黄真池, 欧阳乐军, 曾富华 *, 余秋梅
湛江师范学院生命科学与技术学院, 广东湛江 524048
提要: 切取 8 d苗龄的尾叶桉幼苗下胚轴, 培养 7 d后愈伤组织的诱导率达 100%。8周后, 愈伤组织分化成褐色、白色和浅
绿色 3种类型。其中只有浅绿色愈伤组织能分化出不定芽, 分化率达57%。浅绿色愈伤组织的过氧化物酶(POD)、超氧化
物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和多酚氧化酶(PPO)的活性最高。除SOD外, 浅绿色愈伤组织的 POD、CAT和PPO活
性与其他两类愈伤组织相比具有显著性差异(P<0.05)。H2O2和丙二醛含量则是褐色愈伤组织的最高。
关键词: 尾叶桉; 愈伤组织; 过氧化物酶; 过氧化氢酶
Relationship between Bud Differentiation and Several Physiological and Bio-
chemical Indexes of Three Types of Eucalyptus urophylla S. T. Blake Callus
HUANG Zhen-Chi, OUYANG Le-Jun, ZENG Fu-Hua*, YU Qiu-Mei
Life Science & Technology School, Zhanjiang Normal University, Zhanjiang, Guangdong 524048, China
Abstract: Hypocotyls excised from 8 day-old seedlings could dedifferentiate and form callus at 100% when
they were incubated on a modified MS (SPCa) medium for 7 days. Fifty-six days later, the callus differentiated into
3 types, including brown callus, white callus and reseda callus. Only could the reseda callus formed adventitious
bud at 57% when these calli inoculated with the bud induction medium. The activities of POD, SOD, CAT and
PPO of reseda callus were the highest. Compared with the enzyme activity of other types of callus, the POD,
CAT and PPO activities of reseda callus showed significantly difference at 0.05 level, except for the activity of
SOD. The content of H2O2 and malonaldehyde of brown callus was the highest.
Key words: Eucalyptus urophylla; callus; peroxidase; catalase
桉属有 700多种, 具有速生、丰产、轮伐期
短等特点, 是优良的纸浆用材, 经济效益显著(Poke
等 2005)。由于桉树杂合程度高, 用常规育种方法
难以对其进行遗传改良(Merkle和Nairn 2005)。用
植物基因工程技术提高桉树的抗虫、抗病、抗寒
能力以及改良桉树材性和纤维含量等性状已有所报
道(Harcourt等 2000)。但是, 桉树树种多, 树种间
遗传差异大, 富含多酚, 目前还少见其从愈伤组织
直接分化成芽的报道(Tournier等 2003)。桉树再
生体系难以建立的主要原因是其愈伤组织很难分化
出不定芽(Barrueto Cid等 1999)。本文用 8 d苗龄
的尾叶桉幼苗下胚轴作外植体, 以CaCl2浓度提高
到679.32 mg·L-1 的改良SP (Barrueto Cid等1999)
为基本培养基, 添加 N-取代苯基 -N-[6-(2-氯苯
并噻唑)基]脲、IAA和维生素 C, 愈伤组织的诱
导率可达 100%。随后的培养中, 愈伤组织分化
成褐色、白色和浅绿色 3 种类型。测定三者的
过氧化物酶(peroxidase, POD)、超氧化物歧化酶
(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase,
CAT)和多酚氧化酶(polyphenoloxidase, PPO)的活
性、H2O2和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量并
比较其间的差异, 探讨愈伤组织生理生化指标与芽
分化之间的关联, 为提高尾叶桉愈伤组织的芽分化
率提供参考。
材料与方法
尾叶桉(Eucalyptus urophylla S. T. Blake)种子
由国家桉树中心提供。将种子在蒸馏水中浸泡3 h
后, 用 70%乙醇表面消毒 1 min, 接着用 20%次氯
酸钠消毒 10 min, 用无菌水漂洗 2次后, 再用 20%
次氯酸钠消毒 10 min, 最后用无菌水漂洗 6次。将
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种子播种到MS培养基上, 置于 25 ℃暗处萌发。
从 8 d苗龄的无菌苗切取长约 8 mm的下胚轴作外
植体, 接种在添加 2 mg·L-1 N-取代苯基 -N-[6-(2-
氯苯并噻唑)基]脲、0.1 mg·L-1 IAA和 50 mg·L-1
维生素 C的 SPCa培养基(679.32 mg·L-1 CaCl2、
1/4MS铁盐、1/2MS其他无机盐和 20 g·L-1蔗糖)中,
置于(25±2) ℃温度下暗培养 1周。然后转移至光
照周期为 16 h·d-1, 光照强度为 50 μmol·m-2·s-1和温
度为(25±2) ℃的培养箱中培养。每 2周继代培养
一次, 8周后取上述不同类型愈伤组织进行生理生
化指标的测定。
POD、CAT、SOD和 PPO的活性测定参照
Rajeswari和Paliwal (2008)文中的方法, H2O2和MDA
含量测定参照 Lin和Kao (2000)文中的方法, 可溶
性蛋白含量测定参照Arruda等(2000)文中的方法。
将三类愈伤组织接种在添加 0.8 mg·L-1 BA和
0.05 mg·L-1NAA的 SPCa培养基上, 置于光照周期
为 16 h·d-1、光照强度为 50 μmol·m-2·s-1和温度为
(25±2) ℃的培养箱中诱导不定芽分化。3个培养
皿中各接种 10个愈伤组织块, 3个重复, 每 2周继
代培养一次, 8周后统计诱芽率。
结果与讨论
1 尾叶桉的不同类型愈伤组织的分化形成
尾叶桉种子消毒后播种在MS培养基上, 25 ℃
暗处萌发。8 d后无菌苗高约 40 mm, 切取近子叶
端、无顶芽、长约 8 mm的下胚轴作外植体, 接
种在添加 2 mg·L-1 N-取代苯基 -N-[6-(2-氯苯并噻
唑)基]脲、0.1 mg·L-1 IAA和 50 mg·L-1维生素 C
的 SPCa培养基中, 于(25±2) ℃暗培养。1周后可
见外植体两端膨大形成的愈伤组织。将带有愈伤
组织的下胚轴转移至光照周期为 16 h·d-1, 光照强
度为 50 μmol·m-2·s-1和温度为(25±2) ℃培养箱中培
养。每 2周继代一次, 培养至第 8周时外植体膨大
为长约 15 mm和宽约 8 mm的块状愈伤组织, 颜色
有褐色、白色和浅绿色 3种(图 1), 3种愈伤组织
比例为 6:3:1。
图 1 尾叶桉下胚轴分化形成的三种类型愈伤组织
Fig.1 Three types of callus dedifferentiated from hypocotyls of E. urophylla
a: 褐色愈伤组织; b: 白色愈伤组织; c: 浅绿色愈伤组织。
图 2 三类愈伤组织的POD、SOD、CAT和PPO的活性比较
Fig.2 Analysis of the activities of POD, SOD, CAT and
PPO among three types of callus
图中标有不同字母者表示有显著性差异(P< 0 .0 5 )。
2 尾叶桉的不同类型愈伤组织的某些生理生化指
标比较
从图 2可见, 浅绿色愈伤组织的 POD、SOD、
CAT和PPO的活性均为最高, 褐色愈伤组织除POD
活性略高于白色愈伤组织外, SOD、CAT和 PPO
的活性均为最低。褐色愈伤组织的H2O2和MDA含
量均为最高(图 3)。
3 尾叶桉不同类型愈伤组织的芽分化的比较
将3类愈伤组织接种到添加NAA和BA的SPCa
培养基中诱导不定芽。培养基中的激素组合为
0.8 mg·L-1 BA和0.05 mg·L-1 NAA时, 浅绿色愈伤组
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织的芽分化率最高, 达 57%, 且芽粗壮、数目较多
(图 4)。褐色愈伤组织和白色愈伤组织虽经多次继
代培养仍不能分化出不定芽。
图 3 三类愈伤组织的H2O2和MDA含量比较
Fig.3 Analysis of the contents of H2O2 and MDA
among three types callus
图中标有不同字母者表示有显著性差异(P< 0 .0 5 )。
织。本文的培养条件下, 尾叶桉下胚轴分化成褐
色、白色和浅绿色三类愈伤组织, 比例为 6:3:1。
其中只有浅绿色愈伤组织能分化出不定芽。除
SOD外, 浅绿色愈伤组织的 POD、CAT和 PPO活
性与其他两类愈伤组织相比具有显著性差异。深
入研究愈伤组织形成时, 添加物、光、温等条件
对 POD和 CAT活性的影响, 寻找合适的培养基配
方和培养条件, 有可能提高具分化能力愈伤组织的
比例, 提高不定芽的诱导率, 为桉树转基因育种打
下基础。
参考文献
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cium effect on Eucalyptus urophylla callus morphogenesis in
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Barrueto Cid LP, Machado ACMG, Carvalheira SBRC, Brasileiro
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Tournier V, Grat S, Marque C, El Kayal W, Penchel R, de Andrade
G, Boudet AM, Teulières C (2003). An efficient procedure to
stably introduce genes into an economically important pulp
tree (Eucalyptus grandis × Eucalyptus urophylla). Transgenic
Res, 12: 403~411
图 4 浅绿色愈伤组织分化出的不定芽
Fig.4 Adventitious buds differentiated from reseda callus
标尺为 5 m m。
桉树愈伤组织很难分化出不定芽, 限制了对其
进行遗传改良。Rajeswari和Paliwal (2008)报道, 香
合欢(Albizia odoratissima)具分化能力愈伤组织的
POD和CAT活性明显高于不具分化能力的愈伤组