全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (4): 495~500　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0559 495
收稿 2014-12-11　　修定 2015-03-06
资助 国家自然科学基金项目(31260070)。
* 通讯作者(E-mail: gefeng@tsinghua.org.cn; Tel: 0871-
65920621)。
三七鲨烯环氧酶基因(SE)启动子的瞬时表达分析
卢荣江, 刘迪秋, 葛锋*, 陈朝银
昆明理工大学生命科学与技术学院, 昆明650500
摘要: 采用PCR方法扩增鲨烯环氧酶(SE)基因启动子序列, 研究SE基因在三七生物合成途径中的表达调控规律。为了确认
启动子表达的最佳启动区域, 构建SE启动子430、922、1 323和1 872 bp的5端缺失片段, 并将这些缺失片段分别与葡萄糖
苷酸酶(GUS)基因融合, 构建植物表达载体。采用农杆菌介导法转化烟草, 在烟草叶片中进行瞬时表达分析。组织化学染
色和GUS荧光定量分析结果显示, 4个不同长度片段的启动子均有启动活性, 且随着缺失长度增加启动活性呈增加趋势。
关键词: 三七; 鲨烯环氧酶; 启动子; 瞬时表达
Transient Expression Analysis of Squalene Epoxidase Gene (SE) Promoter
from Panax notoginseng
LU Rong-Jiang, LIU Di-Qiu, GE Feng*, CHEN Chao-Yin
Faculty of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China
Abstract: In order to study the expression and regulation of squalene epoxidase (SE) gene in the biosynthesis
pathway in Panax notoginseng, the SE promoter was cloned by PCR method. To determine the optimal promot-
er sequence for gene expression, SE promoter was deleted from its 5 end to form promoter fragments with 430,
922, 1 323 and 1 872 bp. Such fragments were fused to a β-glucuronidase (GUS) gene. The fused genes were
transformed into Nicotiana tabacum using Agrobacterium tumefaciens-mediated method for transient expres-
sion. Histochemical staining and GUS quantitative fluorometric assays demonstrated that the four different
length fragments of the promoter had promoter activities and the activities were increased with the deleted
length of promoters.
Key words: Panax notoginseng; squalene epoxidase; promoter; transient expression
启动子在基因的转录起始和转录频率的调控
中起决定性作用, 控制结构基因的表达起始时间
和表达程度的强弱。目前, 确定启动子的功能区
段, 较为有效的方法是5端缺失分析, 该方法通过
PCR扩增将已知的启动子缺失为5端不同长度的
区段, 然后将这些缺失区段与报告基因(如葡萄糖
苷酸酶基因和绿色荧光蛋白基因等)连接, 构建启
动子融合报告基因表达载体, 再转化受体(烟草或
拟南芥), 通过检测报告基因的瞬时表达情况进而
确定启动子不同缺失区段的功能 (郑晓瑜等
2011)。
三七为五加科人参属植物, 根入药, 主产于我
国云南省文山州。其活性成分包括皂苷、三七
素、糖类、氨基酸、黄酮、油脂及微量元素等,
其中, 三七总皂苷是三七主要的活性成分。根据
国内外学者对三七总皂苷的研究, 其具有降低心
肌耗氧量、改善心肌缺血、抗心律失常、降血
压、降血脂、防动脉粥样硬化、抗肝纤维化、抗
肥胖等功效, 同时在神经系统、物质代谢以及消
炎、抗肿瘤等诸方面都有较好的药理活性, 尤其
在防治心脑血管疾病疗效显著(Ng 2006; 张云峰等
2006)。三七为多年生植物, 生长周期长, 对生长环
境要求苛刻, 适宜种植三七的面积十分有限。同
时, 三七种植病虫害严重, 在一定程度上制约了
三七产业的可持续发展(Guo等2010)。随着基因工
程和分子生物学技术的进步和发展, 与三七皂苷
合成途径相关酶的基因得以克隆(石磊等2010), 但
由于三七皂苷具有种类多、结构复杂的特点, 使
得调控三七皂苷合成途径的代谢流遗传操作存在
植物生理学报496
一定困难。随着研究的不断深入, 将来有可能通
过组合生物合成技术获得三七皂苷, 为三七产业
的可持续发展奠定基础。
药用植物体内少数前体物质如乙酸、莽草酸
和甲羟戊酸可以产生黄酮类、固醇类、萜类、皂
苷类等次生代谢产物(秦玉芝等2007)。三七皂苷
为四环三萜皂苷, 是三七重要的次生代谢产物, 在
胞质中以乙酰辅酶A为前体的甲羟戊酸途径合
成。三七皂苷合成途径大部分相关酶基因已克隆,
其功能已经在原核及真核细胞中得以验证, 然而
对三七皂苷合成途径中的转录调控研究不多。鲨
烯环氧酶(squalene epoxidase, SE)被认为是三七皂
苷合成途径的关键限速酶之一, 该酶基因已被克
隆(石磊等2010), 但其启动子功能研究至今尚未开
展。根据已克隆的SE基因启动子(卢荣江等2014),
我们拟进一步分析其启动子的功能, 以期更好地
明确SE基因在整个三七皂苷合成途径中的地位。
本研究根据SE基因启动子序列, 设计特异性引物,
扩增出SE基因的启动子全长及3段不同长度5端缺
失片段并分别构建融合葡萄糖苷酸酶(β-glucuroni-
dase, GUS)基因的植物表达载体, 通过瞬时表达对
该启动子的功能进行初步分析, 以期为将来研究
启动子的顺式作用元件与相关转录因子的互作提
供依据。
材料与方法
1 实验材料与主要试剂
用于基因组DNA提取的三七[Panax notogin-
seng (Burk.) F. H. Chen]植株采自云南省文山州, 烟
草(Nicotiana tabacum)、大肠杆菌(Escherichia coli)
DH5α、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)
EHA105和pBI121质粒载体由本实验室保存。克
隆载体pGEM-T Easy购自Promega公司, 胶回收试
剂盒、质粒提取试剂盒、GUS组织化学染色底物
5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸(5-bromo-4-
chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide, X-Gluc)和GUS活
性检测底物4-甲基伞形酮 -β-D-葡萄糖醛酸苷
(4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide, 4-MUG)等
购自上海生工生物工程有限公司。LA Taq酶、T4
DNA连接酶以及限制性酶切酶等相关试剂购自
TaKaRa生物工程有限公司。
2 三七SE基因启动子的克隆
采用经改良的CTAB法(李荣华等2009)提取
三七基因组DNA, 溶于含RNase A的TE缓冲液中,
经1.0%的琼脂糖凝胶电泳鉴定表明提取的基因组
DNA完整, 可应用于后续实验。根据已克隆的SE
基因启动子序列设计引物(卢荣江等2014), 扩增SE
基因启动子5端不同长度片段。上游引物分别为:
SEP-D, 5-aagcttGTGTTGCATATTTTTGAGT-
GCTTTC-3; SEP-C, 5-aagcttCATATACAAACAT-
GCATAACCGCGG-3; SEP-B, 5-aagcttAAATAC-
C G A A C G C C C A A A C C C C ATA - 3 ; S E P - A ,
5-aagcttGGAGAATCCTAATATGCCCCACA-
CA-3。下游引物为: SEP-DOWN, 5-ggatccGGT-
GTTGGTTGGACGTTCACGTTTC-3。分别在上
游和下游引物的5末端引入HindIII和BamHI酶切
位点。以三七基因组DNA为模板 , 用SEP-D和
SEP-DOWN特异性引物扩增启动子全长序列。50
μL的PCR反应体系含: 1 μL (200 ng)纯化后的三七
基因组DNA、5 μL 10×LA Taq缓冲液、4 μL
dNTPs (2.5 mmol·L-1)、上游和下游引物各0.5 μL
(10 μmol·L-1)、0.5 μL LA Taq (5 U·μL-1)、38.5 μL
ddH2O。PCR反应程序如下: 94
℃预变性5 min;
94 ℃变性30 s, 59 ℃退火30 s, 72 ℃延伸 2 min, 共
32个循环; 最后72 ℃保温10 min。
将PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,
胶回收试剂盒回收纯化片段后连接pGEM-T载体,
热激转化大肠杆菌DH5α, 涂布于含有氨苄青霉素
(100 mg·L-1)的LB固体培养基, 于37 ℃倒置培养
12 h, 挑取单克隆置于含有氨苄青霉素(100 mg·L-1)
的LB液体培养基中, 于37 ℃摇床振荡培养8 h, 进
行菌液PCR检测, 将阳性克隆菌株送往上海生工生
物工程有限公司测序。提取测序结果正确的单克
隆菌株质粒, 并以其为模板, 用SEP-C、SEP-B和
SEP-A分别与SEP-DOWN配对形成的3对引物进行
PCR, 扩增启动子的缺失片段, PCR反应体系和程
序与扩增全长相同。
3 植物表达载体的构建
采用质粒提取试剂盒分别提取p G E M - T-
SEPD、pGEM-T-SEPC、pGEM-T-SEPB、pGEM-
T-SEPA和pBI121载体质粒, 同时分别对重组质粒
pGEM-T-SEPD、pGEM-T-SEPC、pGEM-T-
卢荣江等: 三七鲨烯环氧酶基因(SE)启动子的瞬时表达分析 497
SEPB、pGEM-T-SEPA和空质粒pBI121使用Hin-
dIII和BamHI进行双酶切, 回收目的片段, 采用T4
DNA连接酶连接, 使不同SE启动子区段定向替换
pBI121载体上的CaMV35S启动子。将获得的连接
产物热激转化大肠杆菌DH5α, 所获得重组质粒经
硫酸卡那霉素(50 mg·L-1)筛选和菌液PCR检测后,
提取阳性菌株质粒并进行双酶切验证 , 获得
p430、p922、p1323和p1872融合GUS基因的植物
表达载体。
4 农杆菌介导转化烟草
采用CaCl2冻融法将构建好的植物表达载体
转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞中, 于28 ℃倒
置培养2~3 d, 挑取单克隆, 菌液用PCR检测获得阳
性菌株。用打孔器将烟草叶片打出一个圆形叶盘,
形成切口后置于农杆菌菌液(A600约为0.6)中, 室温
侵染15 min, 期间轻微摇晃。用无菌滤纸将叶片表
面的多余农杆菌菌液吸干, 平铺于含有乙酰丁香
酮(20 mg·L-1)的MS固体培养基, 于28 ℃暗培养
2 d。用无菌水将侵染后的烟草叶片洗涤数次, 再
用干净的滤纸吸干备用(一部分用于组织化学染
色, 另一部分用于GUS荧光定量分析)。采用Jeffer-
son等(1987)的方法对组织材料进行GUS组织化学
染色, 37 ℃染色过夜, 然后使用75%乙醇进行脱色
处理, 期间更换数次至阴性对照无绿色残留, 观察
并拍照。GUS活性检测缓冲液中包含50 mmol·L-1
磷酸钠缓冲液(pH 7.0)、10 mmol·L-1 Na2EDTA、
0.1% (V/V) Triton X-100、0.1 mol·L-1 K4Fe(CN)6、
0.1 mol·L-1 K3Fe(CN)6、0.5 mg·mL
-1 X-Gluc和20%
甲醇。
5 GUS活性荧光检测
将处理好的烟草叶片迅速置于液氮中并研磨
成粉末, 参考Jefferson等(1987)的方法进行GUS活
性的荧光定量分析, 每个片段分别取3个叶盘, 每
个叶盘均进行3次重复。取GUS蛋白提取物上清
液10 μL, 采用考马斯亮蓝法测定样品的蛋白含量
(Bradford 1976), 以每min水解4-MUG生成1 nmol
4-甲基伞形酮(4-MU)的酶量为1个活力单位, GUS
活性以每mg总蛋白的酶活力计算, 表示为nmol
(4-MU)·min-1·mg-1 (蛋白)。
实验结果
1 三七SE基因启动子的克隆
以纯化的三七基因组DNA为模板, 经PCR扩
增克隆出一条约为1.8 kb大小的特异性条带(图1),
和预期大小一致。将目的片段纯化后 , 连接
pGEM-T载体, 经过菌液PCR验证后, 获得阳性克
隆, 测序结果显示, 该序列长度为1 872 bp。以
pGEM-T-SEPD质粒为模板, 用3条缺失片段的特异
性引物分别进行PCR扩增, 1.0%的琼脂糖凝胶电泳
检测, 结果见图1。
2 pBI121-SEP植物表达载体的构建及制备pBI121-
SEP的工程菌
为验证SE基因启动子的功能, 根据已经克隆
的SE启动子序列, 分别设计5条引物, 同时分别在5
端引入相应的酶切位点, PCR获得SE基因5上游不
同长度片段, 将这4个片段分别定向替换pBI121载
体上的CaMV35S启动子, 通过双酶切、连接并转
化大肠杆菌DH5α后进行菌液PCR检测, 最后经双
酶切检测(图2), 结果显示已成功获得启动子不同
片段的植物表达载体(图3)。选取pBI121空载体作
为阳性对照, 采用CaCl2冻融法, 将这4个不同长度
的启动子重组子和pBI121空载体转化根癌农杆菌
EHA105感受态细胞中, 菌液经PCR检测, 获得阳性
克隆菌株。
图1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products
M: DL 2000 DNA Marker; 1~4: 不同长度5片段扩增产物。
植物生理学报498
3 SE启动子不同长度片段在烟草中的瞬时表达
分析
基于瞬时表达的简便快捷且可靠性特点, 我
们将构建好的4个植物表达表达载体转化烟草并
进行GUS组织化学染色分析及荧光定量检测。以
烟草的叶片为受体材料, 经过GUS组织染色发现,
4个缺失片段均显示不同程度的启动活性, 且随着
启动子缺失长度的增加GUS活性呈增加趋势。瞬
时表达结果显示, SE基因启动子不同长度片段均
可驱使下游GUS基因的表达(图4), 说明该启动子
序列具有启动必备的作用元件, 能驱使下游基因
的表达。
4 SE启动子5端缺失片段的表达活性分析
GUS活性定量分析结果显示, 缺失−1 774~
图2 缺失表达载体的HindIII和BamHI双酶切检测
Fig.2 Double enzyme digestion of expression vectors
using HindIII and BamHI
M: 15000 DNA Marker; 1~4: 5序列缺失的表达载体。
图3 SE基因启动子驱使GUS报告基因的
表达载体构建示意图
Fig.3 Construction of GUS reporter gene expression vector
driven by SE promoter
A~D: 分别为SE启动子p430、p922、p1323和p1872片段。
图4 转SE启动子的烟草叶片GUS组织化学染色
Fig.4 Histochemical GUS staining of leaves from N. tabacum
transformed by SE promoter
A~D: 分别为SE启动子p430、p922、p1323和p1872片段; E:
pBI121空载体(阳性对照); F: 野生型(阴性对照)。
图5 SE启动子5缺失片段在烟草中GUS活性荧光定量分析
Fig.5 GUS quantitative fluorometric assays of 5 end deletions
of SE promoter in N. tabacum
−824的区段对启动子的GUS活性无显著影响, 而
缺失−824~−332区域的片段导致GUS活性迅速升
高(图5)。这表明, 在SE启动子中, 位于−824~−332
的区域可能存在决定启动子启动活性负调控的顺
式元件, 对整个启动子的活性起重要作用。此外,
阳性对照的GUS活性最高, 阴性对照无GUS活性,
p430、p922、p1323和p1872的启动子均有活性,
分别为阳性对照的71.18%、24.47%、20.94%和
21.12%。
卢荣江等: 三七鲨烯环氧酶基因(SE)启动子的瞬时表达分析 499
讨　　论
SE作为三七皂苷生物合成途径的关键限速
酶, 对调控三七皂苷合成起至关重要的作用, 而启
动子是精确调控基因在植物体内表达的重要元
件。克隆SE启动子并进行序列分析发现该启动子
序列中含有大量的顺式作用元件, 包括各种生物
与非生物响应元件以及与部分转录因子的结合位
点。表明该启动子可能通过响应外界各种生物或
非生物胁迫驱使SE基因的表达, 进而提高三七总
皂苷的含量。构建融合GUS报告基因的植物表达
载体, 利用农杆菌介导转化烟草并进行瞬时表达,
经组织化学染色和GUS荧光定量检测发现, SE启
动子缺失片段均具有启动活性, 可驱使下游GUS基
因的表达, 4个片段具有完整的核心启动元件(TA-
TA-box)和上游启动元件(CAAT-box)。随着缺失片
段长度的逐渐增加 , 其启动子的活性呈增强趋
势。此外, 长启动子片段与短启动子片段启动活
性存在差异, 可能是由于启动子某区段内有与负
调控相关的顺式作用元件, 该区段的缺失将导致
下游结构基因的表达水平上调。长度为430 bp的
启动子缺失片段具有更强的启动子活性, 可为将
来进一步开发短片段启动子提供重要参考。
随着高通量测序技术的广泛应用以及代谢组
学和基因工程的迅速发展, 合成生物学研究进入
更深层次发展阶段。研究三七皂苷生物合成途径
相关酶基因的功能, 为通过合成生物学技术生产
三七皂苷提供最基本的技术参考。近年来, Dai等
(2013)在酿酒酵母中构建原人参二醇的生物合成
途径, 发现鲨烯环氧酶在调控萜类化合物的生物
合成中起关键性作用, 进一步明确SE基因在三七
皂苷合成途径中的地位。皂苷等萜类活性物质的
合成生物学研究的关键技术方法之一即为克隆基
因元件, 所谓基因元件是指具有特定功能的核苷
酸序列或氨基酸, 构成了一个最基本、最为简单
的生物模块, 进而形成遗传系统, 启动子是重要基
因元件之一。随着中药基因组学的发展, 将会挖
掘大量的参与次生代谢产物合成相关基因, 为中
药合成生物学的发展研究提供基因元件(黄璐琦等
2014; 刘夺等2013)。然而, 目前仅有少数几类次生
代谢途径的基因解析得较清楚, 如紫杉醇(Guerra-
Bubb等2012; Jiang等2012)、青蒿素(Newman等
2006; Dietrich等2009)、丹参酮(Gao等2009; Dai等
2012; Cui等2011)、人参皂苷(Chen等2011; Sun等
2010), 大多数药用植物的活性组分生物合成途径
的了解甚少。因此, 挖掘与药用植物活性成分相
关的基因元件显得尤为重要 , 本研究通过克隆
三七鲨烯环氧酶基因的启动子并融合GUS报告基
因, 组织化学染色和GUS活性测定表明该序列具
有启动活性, 为将来深入解析三七皂苷合成途径以
及通过组合生物合成技术实现异源表达奠定基础。
研究三七皂苷生物合成途径中关键酶SE基因
的启动子, 证实了SE基因的启动子具有启动活性,
为进一步探究SE启动子的功能与特性, 需获得稳
定表达的转基因株系。我们下一步的研究重点是
探索关键酶基因启动子中重要作用元件与相关转
录因子的互作。
参考文献
黄璐琦, 高伟, 周雍进(2014). 合成生物学在中药资源可持续利用研
究中的应用. 药学学报, 49 (1): 37~43
李荣华, 夏岩石, 刘顺枝, 孙莉丽, 郭培国, 缪绅裕, 陈健辉(2009).
改进的CTAB提取植物DNA方法. 实验室研究与探索, 28 (9):
14~16
刘夺, 张莹, 周晓, 元英进(2013). 合成生物技术生产甾体激素中间
体的研究展望. 生命科学, 25 (10): 958~965
卢荣江, 刘迪秋, 葛锋, 陈朝银(2014). 三七SE基因启动子的克隆及
序列分析. 植物生理学报, 50 (10): 1535~1540
秦玉芝, 赵小英, 邓克勤, 李旭, 刘选明(2007). 甾醇生物合成中的关
键酶——环氧角鲨烯环化酶的分子生物学研究. 生命科学研
究, 11 (1): 10~15
石磊, 葛锋, 刘迪秋, 陈朝银(2010). 三七总皂苷生物合成与关键酶
调控的研究进展. 西北植物学报, 30 (11): 2358~2364
张云峰, 魏东, 邓雁如, 郭祀远, 陈峰(2006). 三萜皂苷的生物活性研
究新进展. 中成药, 28 (9): 1349~1353
郑晓瑜, 郭晋艳, 张毅, 李秋莉(2011). 植物非生物胁迫诱导启动子
顺式作用元件的研究方法. 植物生理学报, 47 (2): 129~135
Bradford MM (1976). A rapid and sensitive method for quantitation of
microgram quantities of protein utilizing principle of protein-dye
binding. Anal Biochem, 72: 248~254
Chen S, Luo H, Li Y, Sun Y, Wu Q, Niu Y, Song J, Lv A, Zhu Y, Sun
C et al (2011). 454 EST analysis detects genes putatively in-
volved in ginsenoside biosynthesis in Panax ginseng. Plant Cell
Rep, 30 (9): 1593~1601
Cui GH, Huang LQ, Tang X, Zhao J (2011). Candidate genes involved
in tanshinone biosynthesis in hairy roots of Salvia miltiorrhiza
revealed by cDNA microarray. Mol Biol Rep, 38 (4): 2471~2478
Dai ZB, Liu Y, Huang LQ, Zhang XL (2012). Production of miltira-
diene by metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae.
Biotechnol Bioeng, 109 (11): 2845~2853
Dai ZB, Liu Y, Zhang XN, Shi MY, Wang BB, Wang D, Huang LQ,
植物生理学报500
Zhang XL (2013). Metabolic engineering of Saccharomyces cer-
evisiae for production of ginsenosides. Metab Eng, 20: 146~156
Dietrich JA, Yoshikuni Y, Fisher KJ, Woolard FX, Ockey D, McPhee
DJ, Renninger NS, Chang MC, Baker D, Keasling JD (2009). A
novel semi-biosynthetic route for artemisinin production using
engineered substrate-promiscuous P450BM3. ACS Chem Biol, 4
(4): 261~267
Gao W, Hillwig ML, Huang L, Cui G, Wang X, Kong J, Yang B, Pe-
ters RJ (2009). A functional genomics approach to tanshinone
biosynthesis provides stereochemical insights. Org Lett, 11 (22):
5170~5173
Guerra-Bubb J, Croteau R, Williams RM (2012). The early stages of
taxol biosynthesis: an interim report on the synthesis and iden-
tification of early pathway metabolites. Nat Prod Rep, 29 (6):
683~696
Guo HB, Cui XM, An N, Cai GP (2010). Sanchi ginseng (Panax noto-
ginseng (Burkill) F. H. Chen) in China: distribution, cultivation
and variations. Genet Resour Crop Evol, 57 (3): 453~460
Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan MW (1987). GUS fusions: β-glu-
curonidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in
higher plants. EMBO J, 6 (13): 3901~3907
Jiang M, Stephanopoulos G, Pfeifer BA (2012). Downstream reac-
tions and engineering in the microbially reconstituted pathway
for taxol. Appl Microbiol Biotechnol, 94 (4): 841~849
Newman JD, Marshall J, Chang M, Nowroozi F, Paradise E, Pitera
D, Newman KL, Keasling JD (2006). High-level production of
amorpha-4,11-diene in a two-phase partitioning bioreactor of
metabolically engineered Escherichia coli. Biotechnol Bioeng,
95 (4): 684~691
Ng TB (2006). Pharmacological activity of sanchi ginseng (Panax
notoginseng). J Pharm Pharmacol, 58 (8): 1007~1019
Sun C, Li Y, Wu Q, Luo HM, Sun YZ, Song JY, Lui EM, Chen SL
(2010). De novo sequencing and analysis of the American gin-
seng root transcriptome using a GS FLX titanium platform to
discover putative genes involved in ginsenoside biosynthesis.
BMC Genomics, 11: 262