全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (3): 273~276 273
收稿 2012-12-24　　修定 2013-02-27
资助 中国热带农业科学院橡胶研究所人才项目(RC201204)。
* 通讯作者(E-mail: qinbi126@163.com; Tel: 0898-23301174)。
橡胶树死皮(TPD)发生过程中胶乳蛋白质的泛素化
覃碧1,*, 刘长仁2, 杜磊3
1中国热带农业科学院橡胶研究所农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室, 海南儋州571737; 2海南大学农学院, 海
口570228; 3三峡大学化学与生命科学学院, 湖北宜昌443002
摘要: 以健康和不同级别死皮(TPD)橡胶树为材料, 用Western blot分析橡胶树TPD发生过程中胶乳蛋白质泛素化水平的动
态变化, 结果表明, 健康与TPD橡胶树胶乳蛋白质的泛素化水平存在显著差异, 其中2个蛋白的泛素化水平在TPD中显著升
高, 而7个蛋白的泛素化水平在TPD中明显降低。这些蛋白可能在TPD发生过程中发挥重要调控作用。本文结果为进一步
研究泛素化在橡胶树TPD发生过程中的作用提供依据, 同时也为揭示TPD发生的分子机制提供新的思路和观点。
关键词: 橡胶树; 死皮(TPD); 泛素化
Ubiquitination of Latex Protein during Tapping Panel Dryness (TPD) Process
in Hevea brasiliensis Muell. Arg.
QIN Bi1,*, LIU Chang-Ren2, DU Lei3
1Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree, Ministry of Agriculture, Rubber Research Institute, Chinese
Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou, Hainan 571737, China; 2College of Agriculture, Hainan University, Haikou
570228, China; 3College of Chemistry and Life Science, Sanxia University, Yichang, Hubei 443002, China
Abstract: In this study, the ubiquitination of the latex proteins from healthy and different degrees of tapping
panel dryness (TPD) rubber trees (Hevea brasiliensis) was compared using Western blot. The result indicated
that there was significant difference in the ubiquitination levels of latex proteins between healthy and TPD trees.
In the TPD trees, the ubiquitination levels of 2 proteins were significantly increased, while 7 proteins were ob-
viously decreased. These ubiquitinated proteins might play important roles in TPD. This research provides a
base for further study on the roles of protein ubiquitination in TPD. Meanwhile it also provides a new perspec-
tive to elucidate the molecular mechanism involved in the TPD process.
Key words: Hevea brasiliensis; tapping panel dryness (TPD); ubiquitination
蛋白质的泛素化是真核细胞中一种非常重要
的蛋白质修饰过程。在许多生命活动中蛋白质均
可被泛素化途径修饰和降解, 包括细胞周期、信
号转导、转录、逆境胁迫、生物及非生物抗性等
(Craig等2009)。目标蛋白的泛素化需要ATP提供
能量, 由3种酶参与完成, 包括泛素激活酶(ubiquit-
in-activating enzyme, E1)、泛素结合酶(ubiquitin-
conjugation enzyme, E2)和泛素连接酶(ubiquitin li-
gase enzyme, E3) (Hershko和Ciechanover 1998), 泛
素化修饰的蛋白可被26S蛋白酶体识别和降解。
天然橡胶是关系国计民生的基础产业和战略
物资, 而巴西橡胶树是天然橡胶的主要来源。橡
胶树死皮(tapping panel dryness, TPD)是天然橡胶
生产中出现的一种割面症状, 表现为割线局部或
全部不排胶。TPD是一个世界性的难题, 给天然橡
胶生产带来了严重的危害。近年来, 从生理生化
以及分子生物学的角度对橡胶树TPD发生的机制
展开了广泛的研究, 并取得了一定进展, 但其发生
机制尚不清楚。其中, Venkatachalam等(2007)和Li
等(2010)先后通过抑制消减杂交技术(suppression
subtractive hybridization, SSH)鉴定了一系列TPD
相关基因, 这些基因涉及活性氧代谢、泛素-蛋白
酶体途径、细胞程序性死亡及橡胶生物合成等途
径。鉴于前人已有的研究结果以及泛素-蛋白酶体
途径在植物生长发育和胁迫响应等方面的重要调
控作用, 本研究以健康和不同级别TPD橡胶树为材
料, 研究TPD发生过程中蛋白质泛素化水平的动态
变化, 以揭示蛋白质泛素化修饰在TPD发生过程中
植物生理学报274
的作用, 为进一步阐明橡胶树TPD发生的分子机制
提供新的观点和依据。
材料与方法
巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell. Arg.)品
种‘PR107’采自中国热带农业科学院实验农场十二
队。以健康(排胶正常)、2级TPD (死皮长度为2
cm至割线的1/4)和5级TPD (死皮长度为割线的3/4
至全线)橡胶树为实验材料, 分别取其新鲜胶乳用
于Western blot分析。
取30 mL新鲜胶乳于4 ℃下16 500×g离心1 h
后, 取C-乳清直接用于Western blot分析。蛋白质
浓度用Bradford试剂盒(上海碧云天生物技术有限
公司)定量测定。取30 μg蛋白样品, 以12%的SDS-
PAGE凝胶电泳分离。Western blot参照Towbin等
(1979)和史敏晶等(2009)的方法进行。SDS-PAGE
电泳结束后 , 将凝胶中的蛋白质转移至0.2 μm
PVDF膜(Bio-Rad)上, 50 mA低温转移12 h, 转移电
极缓冲液含20 mmol·L-1 Tris碱、150 mmol·L-1甘氨酸
和20%甲醇(V/V); 一抗为抗泛素的抗体(Sigma, 稀
释倍数为1:100) (兔抗, 多克隆抗体), 二抗为碱性磷酸
酶标记的羊抗兔二抗(Pierce, 稀释倍数为1:2 000),
抗体在37 ℃孵育2.5 h, BCIP/NBT显色1~2 min。
实验结果
1 健康与TPD橡胶树胶乳蛋白质的提取与分离
提取等量的健康与TPD橡胶树胶乳蛋白, 经
12% SDS-PAGE电泳分离, 考马斯亮蓝染色。结果
显示, 提取的胶乳蛋白质条带清晰, 质量较好, 可
进一步用于Western blot分析(图1)。比较健康和不
同级别TPD橡胶树胶乳蛋白质带型发现, 两者中一
些蛋白的表达丰度存在显著差异, 其中一个大约20
kDa的蛋白(命名为P20)在TPD树中明显富集(图1,
黑色箭头所示), 而5个蛋白在TPD树中的表达丰度
明显下降, 包括P47 (约47 kDa)、P30 (约30 kDa)、
P17 (约17 kDa)、P13 (约13 kDa)、P12 (约12 kDa)
(图1, 白色箭头所示)。
2 TPD发生过程中胶乳蛋白质的泛素化水平动态
变化
等量的健康与不同级别TPD橡胶树胶乳蛋白
质经12%的SDS-PAGE电泳分离后, 以抗泛素蛋白
作为抗体, 通过Western blot方法检测蛋白质泛素
化水平的动态变化。结果表明, 随着TPD症状的加
重, 总蛋白的整体泛素化水平明显降低(图2); TPD
树中有7个蛋白的泛素化水平明显低于健康树, 包
图1 健康与TPD橡胶树胶乳蛋白质的
SDS-PAGE电泳检测结果
Fig.1 The latex proteins from healthy and TPD rubber trees
were detected by SDS-PAGE
M: 蛋白分子量标准; H: 健康树; T2: 2级TPD树; T5: 5级TPD
树。白色箭头所示为健康树中表达丰度高于TPD树的蛋白; 黑色
箭头所示为TPD树中表达丰度高于健康树的蛋白。
图2 Western blot检测健康与TPD橡胶树中的
蛋白质泛素化水平
Fig.2 Analysis of the levels of protein ubiquitination in
healthy and TPD rubber trees by Western blot
M: 蛋白分子量标准; H: 健康树; T2: 2级TPD树; T5: 5级TPD
树。白色箭头所示是健康树中泛素化水平明显高于TPD树的蛋白;
黑色箭头所示是TPD树中泛素化水平明显高于健康树的蛋白。
覃碧等: 橡胶树死皮(TPD)发生过程中胶乳蛋白质的泛素化 275
括P70 (约70 kDa)、P47、P38 (约38 kDa)、P34 (约
34 kDa)、P30、P13、P12 (图2, 白色箭头所示); 而
5级TPD树中个别蛋白的泛素化水平显著高于健康
树, 包括P20和P9 (约9 kDa) (图2, 黑色箭头所示)。
这些结果表明, 蛋白泛素化途径参与了橡胶树的
TPD发生过程, 而在健康与TPD树中泛素化水平存
在显著差异的蛋白可能在橡胶树的TPD发生过程
中具有重要的调控作用。
讨　　论
蛋白质泛素化是真核生物中最重要的翻译后
修饰方式之一, 近年来的研究表明, 蛋白质泛素化
广泛地参与植物生长发育的各个环节, 如激素合
成、感知和下游信号转导(Santner和Estelle 2010;
Tan和Zheng 2009; Vierstra 2009)、植物形态建成
(Henriques等2009; Hoecker 2005; Sawa等2007;
Schwager等2007)、自交不亲和(Hua和Kao 2006;
Stone等2003)、抗病(Dielen等2010)和逆境反应
(Feussner等1997)等。蓝兴国等(2010)以抗泛素蛋
白作为抗体, 通过Western blot方法研究羽衣甘蓝
授粉过程中柱头蛋白质的泛素化, 结果表明, 蛋白
质泛素化特异性地参与了自花授粉后引起的自交
不亲和反应过程。在橡胶树中, 前人从基因转录
水平鉴定了一系列基因在健康与TPD橡胶树中的
差异表达, 其中Venkatachalam等(2007)和Li等
(2010)的研究均鉴定到泛素化途径相关基因(包括
编码泛素、E2、E3及26S蛋白酶体的基因)在健康
与TPD树中差异表达。Sookmark等(2002)通过2D-
SDS-PAGE方法鉴定了3个蛋白, 即P15 (15 kDa)、
P22 (22 kDa)和P29 (29 kDa)在TPD树中明显富集;
进一步测序验证的结果表明, P15和P22分别为REF
(Hev b1)和SRPP (Hev b3), 二者为橡胶生物合成过
程中的重要蛋白, P29为patatin-like protein family。
本研究直接从基因最终的产物即蛋白质水平出发,
进一步验证蛋白质泛素化在橡胶树TPD发生过程
中的调控作用, 发现P20蛋白在TPD树中明显富集,
而且该蛋白在TPD树中的泛素化水平也显著高于
健康树。P20与Sookmark等(2002)鉴定的P22 (即
SRPP)分子量相近, 可能是同一个蛋白, 由于我们
是根据蛋白分子量标准估计分子量, 可能会存在
一定偏差。SRPP是橡胶生物合成过程中的重要蛋
白, 该蛋白的泛素化水平提高可能会导致其被大
量降解, 从而导致TPD树中橡胶生物合成能力下
降, 最终出现TPD症状。但这还需要进一步对P20
进行蛋白质谱进行测序加以确定。对健康与TPD
树中泛素化水平存在显著差异的蛋白进行测序验
证, 根据蛋白测序结果进一步克隆基因全长, 阐明
基因功能 , 解析基因编码蛋白的泛素化修饰与
TPD之间的关系, 将有望揭示橡胶树TPD发生的
分子机制。
参考文献
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