全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (3): 241~246 241
收稿 2011-10-21　　修定 2012-02-02
资助 安徽农业大学茶叶生物化学与生物重点实验室开放基
金(ltbb201102041)和云南省农业科学院茶叶研究所项目
(SL20100819-01)。
* 通讯作者(E-mail: liangmingzhi@126.com; Tel: 0691-
5127079)。
干旱胁迫下茶树基因表达的AFLP分析
孙云南, 陈林波, 夏丽飞, 李友勇, 田易萍, 梁名志*, 黄玫
云南省农业科学院茶叶研究所, 云南勐海666201
摘要: 利用cDNA-AFLP技术分析了茶树在干旱胁迫诱导下的基因表达差异, 通过256对引物组合共获得27个差异表达片段
(TDF), 通过BLAST比对分析, 按其功能分为转录因子、基础代谢相关蛋白、抗逆蛋白、信号转导蛋白, 此外还有一些假设
蛋白、未知蛋白和没有比对的基因片段。同时利用RT-PCR对片段GH2和GH15进行验证, 表明GH2和GH15片段均受到干
旱胁迫诱导表达。这些研究结果显示茶树在干旱胁迫下的逆境反应非常复杂, 涉及多种代谢过程中的众多基因。
关键词: cDNA-AFLP; 茶树; 干旱胁迫; RT-PCR
AFLP Analysis of Genes Expression in Tea (Camellia sinensis var. assamica)
under Drought Stress
SUN Yun-Nan, CHEN Lin-Bo, XIA Li-Fei, LI You-Yong, TIAN Yi-Ping, LIANG Ming-Zhi*, HUANG Mei
Tea Research Institute of Yunnan Academy of Agricultural Science, Menghai, Yunnan 666201, China
Abstract: Differences of gene expression of tea plant under drought stress were studied by cDNA-AFLP.
The results showed that 27 transcript-derived fragments (TDFs) were obtained. According to blasting
results, these TDFs included transcription factors, primary metabolism proteins, proteins related to
stress and signal transduction proteins. In addition, there were some genes for predicted protein and un-
known protein and no significant homology found. The RT-PCR results showed that expression of GH2
and GH15 were both induced by drought stress. These results showed that response of tea plant to
drought stress were very complex, involving many genes of several metabolism.
Key words: cDNA-AFLP; tea plant; drought stress; RT-PCR
干旱胁迫是自然界中最主要的非生物胁迫之
一, 对许多植物的生长和发育造成很大的伤害。
然而, 植物在长期的进化过程中, 逐渐演变并形成
一系列生理或发育的机制来响应环境中的这种胁
迫, 最大限度地减轻干旱胁迫造成的伤害(吴波和
卢琦2002; Ashraf和Foolad 2007; 陈善福和舒庆尧
1999)。茶树性喜湿润, 对水的依赖性比较大, 一般
认为茶树生长最适宜的年降水量在1 100~1 300
mm, 月平均供水量一般不能少于80 mm (黄福平和
陈荣冰2000; 潘根生等1981)。但是在我国部分茶
区降水量分布存在较大的差异, 如云南茶区的冬
春季节降水量少, 严重影响春茶产量和品质。2010
年持续干旱, 为历史罕见, 全省茶叶受灾面积达到
489.5万亩, 成灾面积172.1万亩, 茶叶干枯死亡面
积达28.1万亩, 茶产业受旱灾影响严重。
抗旱一直是研究的热点, 有关茶树的抗旱性
防御机制研究主要集中在茶树形态 , 如叶片结
构、气孔大小和叶片、根系的含水量等, 以及在生
理、生化和各种保护性酶如SOD、POD、CAT等方
面(刘玉英等2006, 2010)。夏建冰(2010)利用DD-
PCR探讨了幼嫩茶树在干旱胁迫下的基因表达差
异, 发现有上调表达、下调表达和常量表达3种表
达量的变化。本研究通过cDNA-AFLP技术, 构建
茶树在干旱胁迫前后的差异表达谱, 研究茶树在
干旱胁迫前后的基因变化, 筛选与干旱胁迫相关
的基因, 从而为深入研究茶树在响应干旱胁迫的
分子机理和相关基因克隆打下基础。
材料与方法
选取两年生的‘紫娟’茶树(Camellia sinensis
植物生理学报242
var. assamica)扦插苗移栽到土肥一致的盆钵里, 按
同一标准进行肥水管理, 移栽1年后, 将未受病、
虫侵害的茶苗进行自然干旱处理, 3周后发现老叶
片开始脱落, 此时取成熟叶片以及取未作干旱处
理的同等部位的成熟叶片为对照, 按照GB/T8304-
2002进行含水量检测, 并用2%的CTAB提取液提
取, 再参照RNAprep pure Plant Kit试剂盒说明书提
取总RNA。
cDNA-AFLP体系与程序参考Bachem等(1998)
的方法, 采用MseI和EcoRI两种限制性内切酶对双
链cDNA进行酶切, 加上相应接头, 预扩后选扩。
选扩产物用6.0%的聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分析,
AFLP分析所用的接头和引物见表1。cDNA-AFLP
相关的酶试剂购自Promega公司; M-MLV RTase
cDNA Synthesis Kit、pMD18-T Kit购自Takara公
司; RNAprep pure Plant Kit、凝胶回收试剂盒购自
天根生化科技有限公司; 接头、接头引物、选扩
引物以及RT-PCR验证引物的合成由上海生工生物
工程技术服务公司完成; 序列测定由上海英骏生
物技术有限公司完成。
取一洁净的大头针, 从胶板上挑取目的差异
片段胶块, 放入干净的PCR管中, 加入50 µL ddH2O,
75 ℃水浴30 min, 取上清液8 µL作为模板进行PCR
扩增, 引物与cDNA-AFLP扩增该条带的引物相
同。产物回收后连接到pMD18-T vector, 进行转化
和克隆, 阳性鉴定后送上海英骏生物技术有限公
司测序。获得序列利用GenBank的Blastn和Blastx
(NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行序列同源
性搜索与相似性比对。
分别提取成熟叶片的总RNA (方法同上)并合
成cDNA第一链。以β-Actin为参照基因, 根据获得
的GH2和GH15片段设计了检测引物。采用RT-
PCR的方法检测目的基因的表达情况。检测片段
长度均在150 bp左右, 引物序列见表1。反应产物
用SYBR Green1的1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。图
片利用Quantity One软件进行分析。
实验结果
1 茶树叶片的水分检测与RNA的纯度及完整性检测
按照GB/T 8304-2002进行水分检测, 自然干
旱处理后茶树叶片的水分含量为67%, 不作处理的
水分为72%。本实验用2%的CTAB提取液再参照
RNAprep pure Plant Kit试剂盒说明书提取的总
RNA, 经紫外分光光度计检测, 干旱处理的总RNA
浓度为567.43 ng·µL-1, 不作处理的总RNA浓度为
625.64 ng·µL-1; 干旱处理的OD260/OD230值为2.13,
不作处理的OD260/OD230值为2.18; 干旱处理的
OD260/OD280值为2.06, 不作处理的OD260/OD280值为
2.01。以上数值均符合合成cDNA的要求。
2 干旱胁迫下茶树的AFLP分析
本实验采用16对EcoRI/MseI引物、256个组
合进行选择性扩增, 扩增产物经6.0%的变性聚丙
烯凝胶电泳, 银染拍照后进行分析。茶树干旱处
理前后的基因差异表达条带(transcript-derived frag-
ments, TDFs)显示如图1, 有诱导上调的(图2-A和B)
和下调的(图2-C和D)。
表1 AFLP的引物序列
Table 1 Primer sequences of AFLP
引物编号 序列 引物编号 序列
EcoR I 5′ CTCGTAGACTGCGTACC 3′ Mse I 5′ GACGATGAGTCCTGAG 3′
接头引物 5′ AATTGGTACGCAGTC 3′ 接头引物 5′ TACTCAGGACTCAT 3′
EcoR I
5′ GACTGCGTACCAATTCA 3′
Mse I
5′ GATGAGTCCTGAGTAA 3′
选扩引物 选扩引物
EcoR I 5′ GATGAGTCCTGAGTAANN 3′ Mse I 5′ GACTGCGTACCAATTCNN 3′
N为A、T、G和C任一碱基 N为A、T、G和C任一碱基
GH2 (上游): 5′ ACTACATCGGCGGCTTCATA 3′ GH2 (下游) 5′ TTAGCTTCCCCACGTCACTA 3′
GH15 (上游): 5′ GAGCATCTGCAATCCCATAA 3′ GH15 (下游) 5′ CCACTTCCACCATCACCAAC 3′
b-Actin (上游) 5′ GCCATCTTTGATTGGAATGG 3′ b-Actin (下游) 5′ GGTGCCACAACCTTGATCTT 3′
孙云南等: 干旱胁迫下茶树基因表达的AFLP分析 243
3 差异片段的克隆和测序
挑取PAGE胶上的差异表达片段, 用与选择
扩增相同的引物组合和相同的PCR扩增程序进行
二次扩增, 部分扩增产物的电泳结果如图3。二次
扩增效果好, 所选的27个片段都被扩增出, 其中
在干旱胁迫后上调的有22条 , 下调的有5条(表
2)。
4 差异表达片段的分析和功能预测
对克隆获得的cDNA差异片段进行测序和
Blastx同源性比对分析。结果(表2)所获得的差异
片段按功能分为: (1)转录因子, 如GATA域类和
RAV转录因子; (2)基础代谢相关蛋白, 如糖代谢
相关的甘油醛-3-磷酸脱氢酶、核酸代谢相关的
尿嘧啶磷酸核糖转移酶等; (3)抗逆蛋白, 有热休
图1 干旱胁迫下茶树叶片的AFLP 差异分析电泳
Fig.1 PAGE for cDNA-AFLP analysis of tea leaves under drought stress
M13为MseI预扩引物加上CC; E16、E17、E18、E19分别为EcoRI预扩引物加上CC、TA、GC、GT。
图2 AFLP分析的部分差异表达条带
Fig.2 AFLP analysis of partial TDFs
箭头所指为诱导出的TDFs; A、B为诱导上调; C、D为诱导下调。
植物生理学报244
克蛋白70、热休克蛋白90以及衰老蛋白等; (4)信
号传导蛋白, 如受体蛋白激酶。其他还有一些假
设蛋白、未知功能蛋白和无比对结果的基因片段
等。
表2 差异片段基因的同源性分析
Table 2 The homology analysis of TDFs
类型 编号 大小/bp 编码可能的蛋白 表达 e值
转录因子 GH1 521 GATA域类转录因子(GATA domain class transcription factor) 上调 4e-15
GH2 539 RAV 转录因子(RAV transcription factor) 上调 5e-110
基础代谢相关蛋白 GH3 383 鸟嘌呤核苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factor) 上调 3e-52
GH4 617 捕光蛋白(light-harvesting protein) 上调 6e-79
GH5 443 紫色酸性磷酸酶前体(purple acid phosphatase precursor) 上调 2e-11
GH6 483 核蛋白(ribosomal protein) 上调 2e-63
GH7 421 乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase) 上调 e-14
GH8 398 ATP柠檬酸裂合酶(ATP-citrate lyase) 上调 9e-79
GH9 274 磷酸变位酶蛋白(mutase-like protein) 下调 0.20
GH10 342 尿嘧啶磷酸核糖转移酶(uracil phosphoribosyltransferase) 下调 9e-41
GH11 459 甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenas) 上调 5e-69
GH12 302 核糖体蛋白L16 (ribosomal protein L16) 下调 3e-64
GH13 371 叶绿体A/B结合蛋白(chlorophyll a/b binding protein) 上调 5e-38
抗逆蛋白 GH14 320 衰老相关的蛋白质(senescence-associated protein) 上调 1e-16
GH15 318 热休克蛋白70 kDa (heat shock protein 70 kDa) 上调 3e-30
GH16 415 氨基酸转运(amino acid transporter) 上调 9e-66
GH17 606 热休克蛋白90 kDa (heat shock protein 90 kDa) 上调 7e-46
信号转导蛋白 GH18 517 丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine kinase) 上调 4e-16
GH19 340 受体样激酶(receptor-like kinase) 上调 5e-08
假设蛋白和未知蛋白 GH20 415 假设蛋白 上调 1.8
GH21 464 未知蛋白 上调 4.5
GH22 161 未知蛋白 上调 8.8
GH23 619 未知蛋白 上调 7e-23
GH24 320 假设蛋白 上调 3e-11
GH25 441 假设蛋白 下调 0.33
GH26 443 假设蛋白 下调 1e-23
GH27 474 没有搜索到同源序列 上调

5 差异片段的RT-PCR分析
选择干旱胁迫下叶片中上调表达片段GH2和
GH15进行RT-PCR验证。结果(图4)表明, 基因GH2
和GH15在干旱胁迫后其表达量均显著增加。
图3 部分差异条带的二次PCR电泳
Fig.3 Gel electrophoresis of the second PCR for the partial TDFs
差异片段的编号见表2; M: DL 1 000分子标记。
孙云南等: 干旱胁迫下茶树基因表达的AFLP分析 245
讨　　论
在基因表达差异研究中, cDNA-AFLP方法由
于具有灵敏度高, 重复性好的特点, 已被广泛应
用。邓晓艳等(2010)应用cDNA-AFLP技术, 以棉
花耐旱品种‘晋棉13号’幼苗为研究对象, 对干旱胁
迫早期叶片基因表达进行了mRNA指纹分析, 鉴定
了60个表达片段的干旱诱导基因。肖金平等(2011)
利用该技术分离和鉴定柑橘干旱胁迫应答基因
等。本研究采用MseI和EcoRI两种限制性内切酶
组合进行cDNA-AFLP技术分析, 获得了27个自然
干旱胁迫下的茶树特异差异表达片段。PAGE图
谱中既有诱导上调的表达条带, 也有诱导下调的
表达条带, 这说明在干旱胁迫下, 茶树部分基因表
达被诱导、部分被抑制。
干旱是影响植物生长发育最重要、最普遍的
逆境因子(李智念等2003), 植物主要通过两类基因
对其进行反应: 一是启动参与信号转导和调节代
谢途径的基因, 二是启动编码胁迫耐受蛋白以及
参与结构和功能代谢相关酶的基因(Seki等2003;
Shinozaki等2003)。本试验利用cDNA-AFLP技术
获得的茶树适应干旱胁迫所表达的基因主要涉及
以下几方面。
首先是转录因子和信号传导有关的基因片
段。参与信号转导有丝氨酸/苏氨酸激酶、受体蛋
白激酶和GATA域类转录因子、RAV转录因子。
受体蛋白激酶是一类包含胞外结构域、单次跨膜
结构域和胞内激酶结构域的蛋白分子, 胞外信号
分子通过与RLK的胞外结构域特异结合来激活胞
内激酶结构域的自磷酸化和互磷酸化活性, 完成
信号的跨膜传递功能(Davies等1991; Feuillet和
Zhang 2002)。基因表达的转录调控在植物应答环
境信号刺激反应过程中起着重要的作用, 陈林波
等(2010)研究发现茶树RAV转录因子能被低温、
脱水、乙烯及高盐等多种胁迫诱导。
其次, 分离得到11个基础代谢相关蛋白, 如与
糖代谢相关的ATP柠檬酸裂合酶、甘油醛-3-磷酸
脱氢酶和核酸代谢相关的尿嘧啶磷酸核糖转移
酶、核蛋白等。据报道, 甘油醛-3-磷酸脱氢酶(王
幼宁等2005)、乙醇脱氢酶(Bruxelles等1996)等与
植物对干旱、低温等逆境胁迫的应答也有着紧密
的关联。
第三, 得到了4个抗逆蛋白, 如衰老相关的蛋
白质、热休克蛋白70 kDa、氨基酸转运和热休克
蛋白90 kDa。热休克蛋白是植物在受到干旱、高
温等胁迫合成的细胞内重要的分子伴侣和植物对
逆境胁迫短期适应的重要组成成分, 对减轻逆境
胁迫引起的伤害起着重要作用(Cho和Choi 2009;
Rizhsky 2004)。
另外还获得一些假设蛋白、未知蛋白以及无
同源性基因, 这些未知蛋白与GenBank数据库中无
同源性的基因, 可能是有关植物, 特别是木本植物
对干旱诱导的分子机制研究较少, 在GenBank中缺
乏参比序列, 或者是所获取差异序列片段偏短或
者集中于cDNA的3′端, 这些片段序列提供的信息
相对较少, 再者可能是干旱诱导下茶树产生特异
差异基因所致。
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图4 差异表达片段的RT-PCR检测
Fig.4 The analysis of RT-PCR of TPFs
植物生理学报246
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