全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 6 期，2009 年 6 月 603
收稿 2009-03-25 修定 　2009-05-04
资助 江苏省环洪泽湖生态农业生物技术重点实验室基金
(HZH L0 8 0 7)。
* 通讯作者(E-mail: qyang19@njau.edu.cn, luw@njau.edu.cn;
Tel: 025-84395221)。
水稻胚性悬浮细胞的包埋脱水法超低温保存
曾博雅, 王智, 张云峰, 杨清 *, 陆巍 *
南京农业大学生命科学学院, 南京 210095
Cryopreservation of Rice (Oryza sativa L.) Embryonic Cell Suspensions by En-
capsulation-Dehydration
ZENG Bo-Ya, WANG Zhi, ZHANG Yun-Feng, YANG Qing*, LU Wei*
College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
提要: 用包埋脱水法冷冻保存水稻胚性悬浮细胞。整个过程包括: 胚性悬浮细胞预培养、细胞包埋、二次预培养、包埋细
胞脱水、液氮冰冻、细胞解冻和冷冻细胞恢复培养。结果表明, 在细胞水分含量为 25.17%和蔗糖浓度依次递增以及第 2
次预培养 3~4 d的存活率最好。在培养基中加 2.5 g·L-1活性炭有利于细胞的恢复生长。细胞恢复培养后, 能再产生愈伤组
织, 但生长变慢, 有约 5 d的滞后期。
关键词: 水稻; 悬浮细胞系; 包埋脱水; 冰冻保存
植物胚性悬浮细胞系不仅是全能性原生质体
的重要来源, 而且它本身也可作为植物基因转移的
受体(黄纯农等 1994)。然而, 胚性细胞在长期继代
培养过程中经常丢失潜在的形态发生能力, 或者分
化出形态学上变态的小苗(Wang和Gafny 2002), 从
而增加了遗传学上的不稳定性; 而且长期继代培养
费时费事, 成本较高。因此, 胚性悬浮细胞系的长
期保存是人们一直试图解决的问题。
超低温液氮保存是胚性悬浮细胞系保存的一
种常用方法。迄今为止, 已经报道的适合于悬浮细
胞系保存的方法有快速冷冻法(Meijer等1991; 黄纯
农等 1994; 尹德东和胡宝忠 2006)、慢速和逐步冷
冻法(严庆丰等1994; 章志宏和胡中立2000; Jain等
1996; Cho 等 2007)、干冻法、玻璃化法(黄纯农
等1994; 刘峰等1998; Wang等1997)和包埋脱水法
(陈勇等 2002; Kobayashi 等 2005; Shibli 等 2001;
Fang 等 2008; Wang 等 2006; Burritt 2008)等。采
用这些方法, 一些植物的幼嫩外植体和全能性培养
细胞能成功地贮存在液氮中, 为生物工程研究提供
了优良的受体材料(王君晖等 1999)。在水稻中,
Sala 等(1979)曾报道水稻悬浮细胞超低温保存, 经
冷冻的细胞能恢复生长。Meijer等(1991)从超低温
保存后的水稻悬浮细胞制备原生质体, 经培养可分
化出根和芽, 但植株不能正常结实。严庆丰等
(1994)在超低温保存的水稻悬浮细胞系中采用复合
保护剂二甲基亚砜(DMSO)+山梨醇, 保存的水稻悬
浮细胞系再生绿苗并长成正常结实的植株。王君
晖等(1996)用玻璃化法冰冻保存水稻悬浮细胞系,
从恢复生长的细胞再生获得了可育植株。虽然这
些方法获得了较好的保存效果, 但还存在着设备昂
贵、方法复杂和保护剂伤害等问题。
包埋脱水法是将样品用海藻酸钙包埋和脱水
后, 投入液氮中保存的方法。该方法容易掌握, 可
缓和脱水过程, 简化脱水程序, 减少环境因子的影
响, 而且一次能处理较多的材料。用蔗糖作为保护
剂和脱水剂, 可提高胞质浓度, 增加抗冻力和抗脱
水力, 避免冰冻保护剂对细胞的毒害。该方法最早
在拟南芥和长春花悬浮细胞的保存中成功得到应用
(Bachiri 等 1995)。此后, Wang 和 Gafny (2002)用
此方法保存的葡萄悬浮细胞, 其细胞存活率达到
78%, 并获得胚状体和绿芽。本文通过对包埋剂浓
度和脱水时间的优化, 建立了一个便捷有效的适合
水稻悬浮细胞的超低温保存方法。
材料与方法
1 材料
粳稻(Oryza sativa L.)品种 ‘中花11’的胚性悬
浮细胞由本实验室于 2005 年 2月建立。我们实验
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中采用2种培养基: AA (徐林林等2006)和MS。AA
培养基中添加 3%蔗糖和 5 mg·L-1 2,4-D (固体培养
基加 0.8% 琼脂), pH 6.1。MS 培养基中添加 3%
蔗糖、5 mg·L-1 2,4-D 和 0.8% 琼脂, pH 5.8。两
种培养基均在 121 ℃高温高压灭菌 20 min。
2 方法
2.1 第 1次预培养 继代培养 3 d 的胚性悬浮细胞,
在添加了依次递增浓度为 0.25、0.5、0.75 和 1
mol·L-1 蔗糖的 AA 液体培养基中培养(每个浓度培
养 12 h), 培养在 25 ℃黑暗中进行, 时间 2 d。
2.2 细胞包埋 将预培养的细胞悬浮在含8% (W/V)
海藻酸钠、1 mol·L-1 蔗糖和 2 mol·L-1 甘油的混合
液中。用灭菌的胶头滴管将混合液滴入 0.1 mol·L-1
CaCl2 溶液(含 1 mol·L-1 蔗糖和 2 mol·L-1 甘油)中。
在室温下停放 30 min, 形成小珠。
2.3 第 2次预培养及脱水 包埋的小珠在包含 1
mol·L-1 蔗糖的 AA 液体培养基中再次预培养 3 d。
小珠表面迅速用灭菌的滤纸干燥, 放置在装有灭菌
滤纸的培养皿(直径 9 cm)中, 在室温下采用超净工
作台的层流空气脱水, 时间 20~200 min。放在烘
箱中 80 ℃干燥 6 h 后测其含水量, 以(小珠鲜重-
干重) / 鲜重的百分数表示。
2.4 冰冻保存 取 10 个脱水小珠转移到 2 mL 冻存
管中, 直接浸入液氮 1 h。
2.5 恢复培养 将冻存管从液氮中取出, 迅速在 40
℃水浴中解冻 3 min。小珠在 AA 固体培养基上置
25 ℃黑暗中培养, AA 固体培养基(0.8% 琼脂)含
2.5 g·L-1活性炭。分别将包埋脱水未冷冻与冷冻保
存的细胞在 4 种培养基上恢复培养。这 4 种培养
基为: AA固体培养基、添加了活性炭(AC)的AA固
体培养基、AA液体培养基、添加了活性炭的 AA
液体培养基。
2.6 再生培养和液体培养的再建立 将小珠置于添
加 2.5 g·L-1活性炭的MS固体培养基上, 在25 ℃黑
暗条件下进行再生培养, 时间为 30 d, 然后测定其
生长量。
2.7 存活率的测定 细胞存活率的测定采用TTC法
(Kalengamaliro等2000), 取5个包埋小珠加入5 mL
0.4% TTC溶液与等量的0.05 mol·L-1磷酸钠缓冲液
中, 25 ℃中静置 24 h, 用分光光度计比色法测定细
胞存活率。测定重复 3 次。
结果与讨论
1 脱水对冷冻细胞存活率的影响
为了分析脱水对冷冻细胞存活率的影响, 比较
10个脱水时间处理, 冷冻后测定不同处理细胞存活
率的结果(图1)显示, 细胞内的含水量随着脱水时间
的延长而呈下降趋势。在处理 20 min 含水量约为
70% 时, 冷冻的脱水细胞存活率只有 25% 左右, 随
着处理时间的延长, 存活率同步增加, 处理120 min
的含水量约为 25% 时, 细胞存活率最高, 达 50%,
但是, 随着处理时间进一步延长, 细胞存活率迅速
下降。未经冷冻的脱水细胞存活率则随着脱水时
间的延长而几乎是直线下降, 在处理120 min时, 细
胞存活率约为 55%。这表明处理 120 min 为合适
的脱水时间。
图 1 脱水时间对包埋细胞含水量和细胞冷冻
前后存活率的影响
2 预培养对冷冻细胞存活率的影响
预培养有利于保存细胞的生活力。在冷冻前,
分别将包埋细胞预培养1~7 d, 再进行冷冻处理, 然
后测其存活率的结果表明, 预培养 3~4 d的冷冻细
胞存活率最高, 达到 55%, 为未经过预培养细胞存
活率的 2.5 倍, 但低于未经冷冻的预培养细胞的存
活率(89%) (图 2)。
3 恢复培养基对冷冻细胞存活率的影响
恢复培养是冷冻细胞恢复正常状态的重要环
节。比较 4 种培养基组分并检测冷冻小珠培养后
成活率的结果表明, 与液体培养基相比, 固体培养
基上的小珠存活率明显较高(图 3)。在固体培养基
中添加活性炭可提高冷冻小珠的存活率, 存活率约
为 52%。这可能是固体培养基可提供更好的培养
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环境之果。活性炭对细胞生存能力之所以有益可
能是其可通过减少坏死组织和吸附冰冻毒害后细胞
产生的毒素物质所致(Dussert 等 1992; Wang 和
Gafny 2002), 因而冷冻小珠的存活率得到提高。
4 冷冻细胞的再生
为了检测冷冻细胞的再生能力, 包埋小珠置添
加 2.5 g·L-1 活性炭的 MS 固体培养基, 然后进行再
图 2 预培养时间对包埋细胞存活率的影响 图 3 恢复培养基对冷冻细胞存活率的影响
生培养。结果表明, 培养 6 d 后, 从包埋小珠的周
围生长出再生细胞, 并逐渐形成较大愈伤组织块, 质
地疏松(图 4)。与包埋和包埋脱水未冷冻细胞相
比, 冷冻细胞的生长推迟, 有 5 d 的滞后期(图 5)。
培养30 d后, 冷冻细胞的鲜重增加量为正对照的一
半。但所有的包埋珠几乎都能再生愈伤组织, 再生
率达到 85%。这个结果高于鸢尾中获得 60% 的结
图 4 冷藏细胞的培养与再生
a: 多个包埋的小珠; b: 体视镜下包埋的单个小珠, 内包含细胞; c: 冷冻细胞的再生长; d: 生长 1 个月后的再生细胞。
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果(Shibli 2000), 与用同法保存的紫花苜蓿细胞存
活率 84% 相近(Shibli 等 2001)。
参考文献
陈勇, 王君晖, 黄纯农(2002). 胡萝卜悬浮培养细胞和原生质体的
玻璃化法超低温保存. 浙江大学学报(理学版), 29 (1): 94~98
黄纯农, 王君晖, 严庆丰(1994). 玻璃化法液氮冻存大麦和水稻的
胚性悬浮培养细胞. 浙江大学学报(自然科学版) , 2 1 (1) :
114~115
刘峰, 王君晖, 黄纯农, 颜秋生, 张雪琴(1998). 水稻胚性悬浮细胞
玻璃化冻存中的超微结构变化. 中国水稻科学, 12 (1): 17~20
王君晖, 郑泳, 颜秋生(1996). 水稻胚性悬浮细胞系的玻璃化法超
低温保存和可育植株再生. 科学通报, 41 (22): 2801~2804
王君晖, 边红武, 黄纯农(1999). 植物样品包埋脱水法超低温保存
的研究进展. 植物学通报, 16 (5): 582~586
徐林林, 芦笛, 陆巍, 张荣铣, 杨清(2006). 水稻悬浮细胞系的建立
及培养条件对生物产量的影响. 植物生理学通讯, 42 (4 ):
612~616
严庆丰, 王君晖, 黄纯农(1994). 水稻悬浮细胞的超低温保存研
究. 实验生物学报, 27 (4): 399~404
尹德东, 胡宝忠(2006). 日本晴水稻悬浮细胞系的建立和保存. 东
北农业大学学报, 37 (6): 750~754
章志宏, 胡中立(2000). 水稻单倍体不定芽超低温保存和植株再
生及其遗传稳定性研究. 武汉植物学研究, 18 (3): 169~173
Bachiri Y, Gazeau C, Hansz J, Morisset C, Dereuddre J (1995).
Successful cryopreservation of suspension cells by encapsu-
lation-dehydration. Plant Cell Tiss Org Cult, 43: 241~248
Burritt DJ (2008). Efficient cryopreservation of adventitious
shoots of Begonia×erythrophylla using encapsulation-dehy-
图 5 包埋、包埋脱水未冷冻和包埋脱水冷冻
细胞再生的比较
dration requires pretreatment with both ABA and praline.
Plant Cell Tiss Org Cult, 95: 209~215
Cho JS, Hong SM, Joo SY, Yoo JS, Kim DI (2007). Cryopreservation
of transgenic rice suspension cells producing recombinant
hCTLA4Ig. Appl Microbiol Biotechnol, 73: 1470~1476
Dussert S, Mauro MC, Engelmann F (1992). Cryopreservation of
grape embryogenic cell suspensions influence of post-culture
conditions and application to different strains. Cryo Lett, 13:
15~22
Fang JY, Wetten A, Johnston J (2008). Headspace volatile markers
for sensitivity of cocoa (Theobroma cacao L.) somatic
embryos to cryopreservation. Plant Cell Rep, 27: 453~461
Jain S, Jain RK, Wu R (1996). A simple and efficient procedure for
cryopreservation of embryogenic cells of aromatic Indica
rice varieties. Plant Cell Rep, 15:712-717
Kalengamaliro NE, Gana JA, Cunningham SM, Volenec JJ (2000).
Mechanisms regulating differential freezing tolerance of sus-
pension cell cultures derived from contrasting a lfa lfa
genotypes. Plant Cell Tiss Org Cult, 61: 143~151
Ko ba ya s hi T , N i in o T , Ko ba ya s hi M (2 0 0 5 ) . S i mp le
cryopreservation protocol with an encapsulation technique
for tobacco BY-2 suspension cell cultures. Plant Biotech,
22: 105~112
Meijer EGM, Van IE, Schrijnemakers E, Hensgens LAM, Zijderveld
M, Schilperoort RA (1991). Retention of the capacity to
produce plants from protoplasts in cryopreserved cell lines
of rice (Oryza sativa L.). Plant Cell Rep, 10: 171~174
Sala F, Cella R, Rollo F (1979). Freeze-preservation of rice cells
grown in suspension culture. Plant Physiol, 45: 170~176
Shibli RA (2000). Cryopreservation of black iris (Iris nigricans)
somatic embryos by encapsulation-dehydration. Cryo Lett,
21 (1): 39~46
Shibli RA, Haagenson DM, Cunningham SM, Berg WK, Volenec JJ
(2001). Cryopreservation of alfalfa (Medicago sativa L.)
cells by encapsulation-dehydration. Plant Cell Rep, 20:
445~450
Wang JH, Zheng Y, Yan QF, Yan QS, Zhang XQ, Huang CN (1997).
Vitrificational cryopreservation and subsequently fertile plant
r egenera t ion from r i ce (O r y z a s a t i v a L . ) e mbryo-
genicsuspension cells. Chin Sci Bull, 42 (5): 422~426
Wang QC, Gafny R (2002). Cryopreservation of grapevine (Vitis
vinifera L.) embryogenic cell suspensions by encapsulation-
dehydration and subsequent plant regeneration. Plant Sci,
162: 551~558
Wang QC, Liu Y, Xie YH, You M (2006). Cryotherapy of potato
shoot tips for efficient elimination of potato leafroll virus
(PLRV) and potato virus Y (PVY). Potato Res, 49: 119~129