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水稻胚性悬浮细胞的包埋脱水法超低温保存



全 文 :植物生理学通讯 第 45 卷 第 6 期,2009 年 6 月 603
收稿 2009-03-25 修定  2009-05-04
资助 江苏省环洪泽湖生态农业生物技术重点实验室基金
(HZH L0 8 0 7)。
* 通讯作者(E-mail: qyang19@njau.edu.cn, luw@njau.edu.cn;
Tel: 025-84395221)。
水稻胚性悬浮细胞的包埋脱水法超低温保存
曾博雅, 王智, 张云峰, 杨清 *, 陆巍 *
南京农业大学生命科学学院, 南京 210095
Cryopreservation of Rice (Oryza sativa L.) Embryonic Cell Suspensions by En-
capsulation-Dehydration
ZENG Bo-Ya, WANG Zhi, ZHANG Yun-Feng, YANG Qing*, LU Wei*
College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
提要: 用包埋脱水法冷冻保存水稻胚性悬浮细胞。整个过程包括: 胚性悬浮细胞预培养、细胞包埋、二次预培养、包埋细
胞脱水、液氮冰冻、细胞解冻和冷冻细胞恢复培养。结果表明, 在细胞水分含量为 25.17%和蔗糖浓度依次递增以及第 2
次预培养 3~4 d的存活率最好。在培养基中加 2.5 g·L-1活性炭有利于细胞的恢复生长。细胞恢复培养后, 能再产生愈伤组
织, 但生长变慢, 有约 5 d的滞后期。
关键词: 水稻; 悬浮细胞系; 包埋脱水; 冰冻保存
植物胚性悬浮细胞系不仅是全能性原生质体
的重要来源, 而且它本身也可作为植物基因转移的
受体(黄纯农等 1994)。然而, 胚性细胞在长期继代
培养过程中经常丢失潜在的形态发生能力, 或者分
化出形态学上变态的小苗(Wang和Gafny 2002), 从
而增加了遗传学上的不稳定性; 而且长期继代培养
费时费事, 成本较高。因此, 胚性悬浮细胞系的长
期保存是人们一直试图解决的问题。
超低温液氮保存是胚性悬浮细胞系保存的一
种常用方法。迄今为止, 已经报道的适合于悬浮细
胞系保存的方法有快速冷冻法(Meijer等1991; 黄纯
农等 1994; 尹德东和胡宝忠 2006)、慢速和逐步冷
冻法(严庆丰等1994; 章志宏和胡中立2000; Jain等
1996; Cho 等 2007)、干冻法、玻璃化法(黄纯农
等1994; 刘峰等1998; Wang等1997)和包埋脱水法
(陈勇等 2002; Kobayashi 等 2005; Shibli 等 2001;
Fang 等 2008; Wang 等 2006; Burritt 2008)等。采
用这些方法, 一些植物的幼嫩外植体和全能性培养
细胞能成功地贮存在液氮中, 为生物工程研究提供
了优良的受体材料(王君晖等 1999)。在水稻中,
Sala 等(1979)曾报道水稻悬浮细胞超低温保存, 经
冷冻的细胞能恢复生长。Meijer等(1991)从超低温
保存后的水稻悬浮细胞制备原生质体, 经培养可分
化出根和芽, 但植株不能正常结实。严庆丰等
(1994)在超低温保存的水稻悬浮细胞系中采用复合
保护剂二甲基亚砜(DMSO)+山梨醇, 保存的水稻悬
浮细胞系再生绿苗并长成正常结实的植株。王君
晖等(1996)用玻璃化法冰冻保存水稻悬浮细胞系,
从恢复生长的细胞再生获得了可育植株。虽然这
些方法获得了较好的保存效果, 但还存在着设备昂
贵、方法复杂和保护剂伤害等问题。
包埋脱水法是将样品用海藻酸钙包埋和脱水
后, 投入液氮中保存的方法。该方法容易掌握, 可
缓和脱水过程, 简化脱水程序, 减少环境因子的影
响, 而且一次能处理较多的材料。用蔗糖作为保护
剂和脱水剂, 可提高胞质浓度, 增加抗冻力和抗脱
水力, 避免冰冻保护剂对细胞的毒害。该方法最早
在拟南芥和长春花悬浮细胞的保存中成功得到应用
(Bachiri 等 1995)。此后, Wang 和 Gafny (2002)用
此方法保存的葡萄悬浮细胞, 其细胞存活率达到
78%, 并获得胚状体和绿芽。本文通过对包埋剂浓
度和脱水时间的优化, 建立了一个便捷有效的适合
水稻悬浮细胞的超低温保存方法。
材料与方法
1 材料
粳稻(Oryza sativa L.)品种 ‘中花11’的胚性悬
浮细胞由本实验室于 2005 年 2月建立。我们实验
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中采用2种培养基: AA (徐林林等2006)和MS。AA
培养基中添加 3%蔗糖和 5 mg·L-1 2,4-D (固体培养
基加 0.8% 琼脂), pH 6.1。MS 培养基中添加 3%
蔗糖、5 mg·L-1 2,4-D 和 0.8% 琼脂, pH 5.8。两
种培养基均在 121 ℃高温高压灭菌 20 min。
2 方法
2.1 第 1次预培养 继代培养 3 d 的胚性悬浮细胞,
在添加了依次递增浓度为 0.25、0.5、0.75 和 1
mol·L-1 蔗糖的 AA 液体培养基中培养(每个浓度培
养 12 h), 培养在 25 ℃黑暗中进行, 时间 2 d。
2.2 细胞包埋 将预培养的细胞悬浮在含8% (W/V)
海藻酸钠、1 mol·L-1 蔗糖和 2 mol·L-1 甘油的混合
液中。用灭菌的胶头滴管将混合液滴入 0.1 mol·L-1
CaCl2 溶液(含 1 mol·L-1 蔗糖和 2 mol·L-1 甘油)中。
在室温下停放 30 min, 形成小珠。
2.3 第 2次预培养及脱水 包埋的小珠在包含 1
mol·L-1 蔗糖的 AA 液体培养基中再次预培养 3 d。
小珠表面迅速用灭菌的滤纸干燥, 放置在装有灭菌
滤纸的培养皿(直径 9 cm)中, 在室温下采用超净工
作台的层流空气脱水, 时间 20~200 min。放在烘
箱中 80 ℃干燥 6 h 后测其含水量, 以(小珠鲜重-
干重) / 鲜重的百分数表示。
2.4 冰冻保存 取 10 个脱水小珠转移到 2 mL 冻存
管中, 直接浸入液氮 1 h。
2.5 恢复培养 将冻存管从液氮中取出, 迅速在 40
℃水浴中解冻 3 min。小珠在 AA 固体培养基上置
25 ℃黑暗中培养, AA 固体培养基(0.8% 琼脂)含
2.5 g·L-1活性炭。分别将包埋脱水未冷冻与冷冻保
存的细胞在 4 种培养基上恢复培养。这 4 种培养
基为: AA固体培养基、添加了活性炭(AC)的AA固
体培养基、AA液体培养基、添加了活性炭的 AA
液体培养基。
2.6 再生培养和液体培养的再建立 将小珠置于添
加 2.5 g·L-1活性炭的MS固体培养基上, 在25 ℃黑
暗条件下进行再生培养, 时间为 30 d, 然后测定其
生长量。
2.7 存活率的测定 细胞存活率的测定采用TTC法
(Kalengamaliro等2000), 取5个包埋小珠加入5 mL
0.4% TTC溶液与等量的0.05 mol·L-1磷酸钠缓冲液
中, 25 ℃中静置 24 h, 用分光光度计比色法测定细
胞存活率。测定重复 3 次。
结果与讨论
1 脱水对冷冻细胞存活率的影响
为了分析脱水对冷冻细胞存活率的影响, 比较
10个脱水时间处理, 冷冻后测定不同处理细胞存活
率的结果(图1)显示, 细胞内的含水量随着脱水时间
的延长而呈下降趋势。在处理 20 min 含水量约为
70% 时, 冷冻的脱水细胞存活率只有 25% 左右, 随
着处理时间的延长, 存活率同步增加, 处理120 min
的含水量约为 25% 时, 细胞存活率最高, 达 50%,
但是, 随着处理时间进一步延长, 细胞存活率迅速
下降。未经冷冻的脱水细胞存活率则随着脱水时
间的延长而几乎是直线下降, 在处理120 min时, 细
胞存活率约为 55%。这表明处理 120 min 为合适
的脱水时间。
图 1 脱水时间对包埋细胞含水量和细胞冷冻
前后存活率的影响
2 预培养对冷冻细胞存活率的影响
预培养有利于保存细胞的生活力。在冷冻前,
分别将包埋细胞预培养1~7 d, 再进行冷冻处理, 然
后测其存活率的结果表明, 预培养 3~4 d的冷冻细
胞存活率最高, 达到 55%, 为未经过预培养细胞存
活率的 2.5 倍, 但低于未经冷冻的预培养细胞的存
活率(89%) (图 2)。
3 恢复培养基对冷冻细胞存活率的影响
恢复培养是冷冻细胞恢复正常状态的重要环
节。比较 4 种培养基组分并检测冷冻小珠培养后
成活率的结果表明, 与液体培养基相比, 固体培养
基上的小珠存活率明显较高(图 3)。在固体培养基
中添加活性炭可提高冷冻小珠的存活率, 存活率约
为 52%。这可能是固体培养基可提供更好的培养
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环境之果。活性炭对细胞生存能力之所以有益可
能是其可通过减少坏死组织和吸附冰冻毒害后细胞
产生的毒素物质所致(Dussert 等 1992; Wang 和
Gafny 2002), 因而冷冻小珠的存活率得到提高。
4 冷冻细胞的再生
为了检测冷冻细胞的再生能力, 包埋小珠置添
加 2.5 g·L-1 活性炭的 MS 固体培养基, 然后进行再
图 2 预培养时间对包埋细胞存活率的影响 图 3 恢复培养基对冷冻细胞存活率的影响
生培养。结果表明, 培养 6 d 后, 从包埋小珠的周
围生长出再生细胞, 并逐渐形成较大愈伤组织块, 质
地疏松(图 4)。与包埋和包埋脱水未冷冻细胞相
比, 冷冻细胞的生长推迟, 有 5 d 的滞后期(图 5)。
培养30 d后, 冷冻细胞的鲜重增加量为正对照的一
半。但所有的包埋珠几乎都能再生愈伤组织, 再生
率达到 85%。这个结果高于鸢尾中获得 60% 的结
图 4 冷藏细胞的培养与再生
a: 多个包埋的小珠; b: 体视镜下包埋的单个小珠, 内包含细胞; c: 冷冻细胞的再生长; d: 生长 1 个月后的再生细胞。
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果(Shibli 2000), 与用同法保存的紫花苜蓿细胞存
活率 84% 相近(Shibli 等 2001)。
参考文献
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