全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (8): 1257~1264　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0227 1257
收稿 2015-04-16　　修定 2015-07-20
资助 国家自然科学基金(31470085和31201148)。
* 通讯作者(E-mail: wangdj@henu.edu.cn; Tel: 0371-23881387)。
油菜抗逆相关基因FOX拟南芥文库构建
王道杰1,*, 杨翠玲1, 柴冬梅2, 董龙1, 李艳萍1
1河南大学生命科学学院, 棉花生物学国家重点实验室, 植物逆境生物学重点实验室, 河南开封475004; 2河南农业职业学院,
河南中牟451450
摘要: 利用FOX hunting system技术, 结合高通量的Gateway技术, 以模式植物拟南芥为载体, 建立了一个油菜抗逆相关基因
功能研究体系, 构建了一个超表达油菜抗逆相关基因的拟南芥文库, 并将其命名为油菜-FOX-拟南芥文库。根据拟南芥抗
逆信号转导研究基础, 筛选出80个拟南芥抗逆相关基因并与油菜基因组信息进行同源性比对, 最终获得70条具有完整ORF
的EST序列。PCR扩增上述70个候选基因。利用Gateway技术构建35S强启动子驱动的70个候选基因的植物表达文库。农
杆菌介导的拟南芥Flower-dip法转化600多株Col-0生态型拟南芥, 收获种子约30 000粒。PPT筛选和PCR鉴定得到355个转
化株, 其中328个单株收获到种子。经Mannitol、NaCl和ABA平板培养基上筛选, 获得根长不敏感植株68株, 根长敏感植株
65株。在Mannitol和NaCl平板培养基上筛选到子叶变绿不敏感植株11株。同时在FOX库中发现5株形态表型异常的植株
(包括叶片卷曲, 植株矮小等)。
关键词: 非生物胁迫; FOX hunting system; Gateway; 油菜; 拟南芥
Construction of Rape-FOX-Arabidopsis Library Overexpressed Stress-Related
Genes in Brassica napus
WANG Dao-Jie1,*, YANG Cui-Ling1, ChAi Dong-Mei2, DONG Long1, Li Yan-Ping1
1National Key Laboratory of Cotton Biology, Key Laboratory of Stress Biology, College of Life Science, Henan University,
Kaifeng, Henan 475004, China; 2Henan Vocational College of Agriculture, Zhongmou, Henan 451450, China
Abstract: in this study, a platform was set up for function analysis of oilseed rape stress-related genes using
FOX hunting system and high throughput Gateway technology. We constructed a rape-FOX-Arabidopsis
library overexpressed the Brassica napus stress-related genes, designated as rape-FOX-Arobidopsis library. 80
Arabidopsis stress-related genes were selected based on stress signal transduction and aligned with rape ge-
nome sequence. 70 rape EST sequences with complete ORF were screened out. 70 genes were all amplified
by PCR, and an overexpression library were constructed driven by CaMV 35S (cauliflower mosaic virus 35S)
promoter using Gateway technology. Then the library with 70 genes was introduced into Col-0 ecotypes Arabi-
dopsis thaliana (more than 600 plants) by floral-dip method, and harvested about 30 000 seeds. 355 transfor-
mants were screened out by PPT and confirmed by PCR, and 328 transformants completed growth period and
set seeds. According root growing, 68 stress-resistant plants and 65 sensitive plants were screened out on MS
medium with Mannitol, NaCl or ABA, and based on cotyledon greening, 11 plants were screened out on MS
medium with Mannitol or NaCl. 5 plants were found with abnormal phenotypes in the FOX library, which were
leaf curl, dwarf, etc.
Key words: abiotic stress; FOX hunting system; Gateway; Brasicca napus; Arabidopsis thaliana
随着基因组学的发展, 高通量、高效率地鉴
定基因并进行功能研究显得尤为重要。FOX hunt-
ing system (Full-length cDNA Over-eXpressing gene
hunting system)是一项新的高通量基因功能研究技
术。2006年, FOX hunting system作为一种独创的
植物功能获得性基因筛选方法首次被提出(ichikawa
等2006), 可用于系统性研究植物基因的功能。
FOX hunting system可以应用于各种植物, 这项技
术的运用并不依赖于该植物的基因组详细信息,
只需获得该植株的全长cDNAs即可。这一特性使
得该项技术在不同植株的基因功能分析中具有很
大优势, 因为在许多非模式植物中, 基因组的信息
植物生理学报1258
还很匮乏。另外, 对于一些基因功能有冗余的多
倍体植物功能基因组的研究, 传统的功能缺失型
突变很难奏效。比如, 有些基因家族的成员较多,
功能冗余, 使用T-DNA插入技术突变其中一个基
因, 植株的表型与野生型相比并不会有太大的改
变。因此, 对于这类基因的研究, FOX hunting
system有它的独到之处。
FOX hunting system能够在转基因植株中超量
表达单个或有限数量的目标基因的全长cDNA, 这
些异常表达的全长cDNA有可能会导致转基因植
株显著的突变表型。根据研究者的实验目的对表
型发生改变的功能获得型突变植株进行PCR筛选
和测序分析, 鉴定转基因突变植株中所携带外源
基因及其功能。ichikawa等(2006)将约10 000个独
立的拟南芥全长cDNA进行均一化处理, 在相同的
摩尔比例下混合创建全长cDNA超表达文库并转
入拟南芥 , 得到约15 000株超表达拟南芥全长
cDNA的转基因拟南芥植株, 通过以上实验获得了
这些转化后的植株并命名为拟南芥FOX植株。运
用同样的技术方法, 有研究者也建立了FOX文库
并对筛选出的部分拟南芥FOX植株进行筛选和功
能分析, 成功克隆了与高碳/氮胁迫、高海藻糖胁
迫及毛状体发育相关的基因ATL31 (CN1)、bZIP11
和GT-2-LIKE1 (GTL1) (Breuer等2009; Sato等2009;
Ma等2011)。Kondou等(2009)利用FOX hunting
system建立了23 000多株独立的水稻FOX拟南芥
植株。并已经利用水稻FOX拟南芥植株分离克隆
到一些水稻的功能基因(higuchi-Taktnch等2012;
Dubouzet等2011)。在此基础上Sakurai等(2011)建
立了水稻FOX数据库(rice FOX database)。目前,
FOX hunting system已经成功应用到水稻功能基因
的研究中。Kinoshita等(2007)建立了约12 000株转
基因水稻, 超表达水稻全长cDNA, 命名为FOX水
稻植株。通过对FOX水稻植株的表现型分析, 发
现了许多可见突变表型 , 包括矮化、失绿和灰
绿、虚弱和致死、受伤害、生活周期缩短、愈伤
组织变绿、窄叶和高分蘖等。FOX hunting system
也可以用于逆境相关基因功能的研究。Fujita等
(2007)根据转录因子的微阵列分析数据, 将其中与
逆境应答相关的43种胁迫诱导转录因子的全长
cDNA混合转入到拟南芥。在鉴定T1代筛选出的
224株耐高盐胁迫植株时, 发现这些抗性植株几乎
都含有相同的转基因AtbZIP60。AtbZIP60基因编
码bZiP型转录因子, 与内质网相关, 涉及盐胁迫和
强光胁迫应答。
FOX hunting system技术首先在拟南芥中得到
成功应用, 并在水稻中也得到成功应用。higuchi-
Taktnch等(2012)首先构建了13 000个水稻基因的
全长cDNA文库, 然后借助FOX hunting system技术
构建了水稻FOX拟南芥超表达库。本研究运用
FOX hunting system技术, 构建了含70个油菜抗逆
相关基因的FOX拟南芥文库, 为油菜抗逆基因的
快速筛选和功能鉴定奠定了基础, 同时为油菜等
多倍体大基因组且生育期较长的植物功能基因组
的研究提供了新的思路。
材料与方法
1 实验材料
1.1 植物材料
甘蓝型油菜(Brassica napus L.)品系R29是从
20个来源不同的甘蓝型油菜品系中经抗旱性鉴定
筛选出来的抗旱性较好的品系(王道杰等2012)。
拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)为Col-0生态型。
1.2 引物与载体图谱
实验所用的引物(表1)利用Primer 5.0软件设
计并交由invitrogen公司合成。
2 试验方法
2.1 材料处理及RNA提取
hoagland营养液置于长、宽、高为40 cm×30
cm×25 cm的塑料盒中, 将饱满的种子消毒后均匀
排列于尼龙网框上, 间隔距离为2 cm。将尼龙网框
置于塑料水盒中, 漂浮在培养液上且种子接触液
面。置于25 ℃培养室中, 16 h/8 h光/暗培养7 d后,
用含20% (W/V) PEG-6000的hoagland营养液处理
12 h后取样, 液氮速冻, TRizol法提取RNA。
2.2 cDNA合成及目的基因扩增
用First cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)反转录
合成cDNA第一链。以cDNA为模板, 根据目的基
因序列设计的上述70对引物 , 用KOD高保真酶
(ToYoBo)进行PCR扩增。由于引物的GC%含量不
同, 因此退火温度也有所差异。先通过预实验选
择合适的退火温度。扩增产物经电泳检测, 回收
王道杰等: 油菜抗逆相关基因FOX拟南芥文库构建 1259
表1 引物编号及序列
Table 1 Primer iD and sequences
引物编号 引物序列(5′→3′) 引物编号 引物序列(5′→3′)
DrT1F CACCATGGTGGGCACGAGGGT DrT38F CACCATGAAAAAACTCAAACTCATGGATC
DrT1R TCATTCCCTTAGCCATTTAGC DrT38R CTAGTAAGTTCCCGAGAAGAAAGG
DrT2F CACCATGGGGATTTGCATGAGTGT DrT39F CACCATGAACACATTCCCTGCGT
DrT2R TCAGACAAACAGAGGCGAAG DrT39R CTAATAACTCCAAAGGGACACG
DrT3F CACCATGGGTGAGAAGAAAGTGACAGA DrT40F CACCATGAGCTCTGAGCAAAACAAC
DrT3R TCAAAAGTTCTTCTTCTGGTGGA DrT40R TCAAATCCTCTGGACTTTATCC
DrT4F CACCATGTCTGGTAAAGGAGAAGGTC DrT41F CACCATGGCTGCTCCGGATCGA
DrT4R TTAGTCGACCTCTTCGATCTTAG DrT41R CTACGAGCATACACGTGCTCTTCT
DrT5F CACCATGGAGTGGGAGGAACAAG DrT42F CACCATGACGGAGCCGACGATGA
DrT5R TTACTTCTTCCTCTTCTTTGGTG DrT42R TTAACCAATCTTTGAGATTAAACTCG
DrT6F CACCATGACCTCATTTTCTACCTTTTCT DrT43F CACCATGGAATTTGTAAGGTTTCCG
DrT6R CTAATAACTCCAAAGGGACACG DrT43R TCAAGCAACTTGGACTTGGAT
DrT7F CACCATGGCTGTTGCGATGGATAT DrT44F CACCATGGCAACCCGTCTCCTC
DrT7R TCACTTGTAAGGAGCAAAAATGA DrT44R TCACGCAATTCCAGCGAT
DrT8F CACCATGGAGGAGCTAGATCGTTCAC DrT45F CACCATGGCGACTGTAATCGACG
DrT8R CTAAGCTTGGATGGGAATGTC DrT45R CTAGTGATTGAATTCTATCATTCCTG
DrT9F CACCATGGAGGATGAGATAGATCGTTCC DrT46F CACCATGGTAAGAGAGAGTATGGGAGAA
DrT9R CTAATGCCCGTTCTGCACTG DrT46R TTAGTCTTGCTTGCGAGAATC
DrT10F CACCATGGTCGGAGCAAAACCTAT DrT47F CACCATGGGAGAAGAGTCAGAGGC
DrT10R TCAAGCAGGTGTAGTAGAAGTCC DrT48F CACCATGTCGTCCACTTCTTTCACC
DrT11F CACCATGAACTCAGTCTCTACTTTTTCTG DrT48R CTAGTACTTCAGCCCCAAGGT
DrT11R1 CTAATAATTCCAGAGGTTCATGTC DrT49F CACCATGTCCAATGAAACCAAAGATT
DrT12R CTAATAACTCCAGAGGTTTATGTCA DrT49R TCAATGCTCTTGCTTGAAGA
DrT13F CACCATGACCTCATTTTCTGCCTTC DrT50F CACCATGGACCAGTACTCATCGTCTT
DrT13R TTAATAACTCCAAAGGGACACKTC DrT50R1 CTATTTCTCGGTTTGATTCTGTT
DrT14F CACCATGGGTTGGATCCCGTG DrT50R2 CTACTTGTCGGTTTGATTCTGTT
DrT14R TCAGACCACCCTCTTTGATCT DrT51F CACCATGTCTAATGAAACCAAAGATCTTAAC
DrT15F CACCATGTTGGATTCTCTAGTGTCGAA DrT51R TCAAGGTTCTTGTTTGAAGAAAAC
DrT15R CTAGTGATTAGAGTCATCAAATTGTC DrT52F CACCATGTACGGACAGAGCGAGGT
DrT16F CACCATGAAGGCTGAGCTAAATTTACC DrT52R TTACACAACCTCGCATTTCAC
DrT16R TCACCCCTGATGACCAAAAC DrT53F CACCATGGCATCGCTTTTGGAT
DrT17F CACCATGAAAGCAGAGCTAAACTTACCT DrT53R TCAAGCTCTACTGAGATCAGTAGG
DrT17R TTACCCCTGTGGAGCAAAAC DrT54F CACCATGGGCTCAACTCCCTTCTG
DrT18F CACCATGAAGGCGGAGCTAAATTT DrT54R TCAAGCAGCCTGAAGCAATT
DrT18R TTACCCCTGAGAACCAAAACT DrT55F CACCATGAATTTCAAGAACAACAACAAC
DrT19F CACCATGAAAGCAGAGCTGAACTTACCA DrT55R TCACCAAGGTCCTGACTCTG
DrT19R TCACCCCTGTGGAGCAAAACT DrT56F CACCATGGCCGAAGAGTACAAGAA
DrT20F CACCATGAAAGCAGGGCTAAACTTACCA DrT56R TTAAGCATCAGACACCTTTTCT
DrT20R TCACCCCTGTGGAGCAAAAC DrT57F CACCATGGACGGTGGAACGGGT
DrT21F CACCATGTCAGAAYTACAGCTGCCTC DrT57R TCAAACTATTTGCTGATACTCTGGA
DrT21R CTARTAAGGCTTGGGCATGTT DrT58F CACCATGGAGACTAATTCGTCTGGAG
DrT23F CACCATGGTGAAAGCAGGGGCT DrT58R TCATGTTGAAGTTTGTGTTTCC
DrT23R TTAGAAAGTTCTCTGCCGAACA DrT59F CACCATGGTTCTCGACGGAAACG
DrT24F CACCATGGGAGTTAGAGAGAAGGATCC DrT59R TCAGATCATACCAGCGTATCCC
DrT24R TCATTGCCTAAACTCGTACATTTG DrT60F CACCATGTCTACCACCGGACAGATC
DrT25F CACCATGGCGATTCGTCTTTCG DrT60R TCAAGCACCCATGGTGATG
DrT25R CTAGTAGCTGAACCAAACAACATG DrT61F CACCATGGATCCTTACAAGTACCGTC
DrT26F CACCATGGCCACTATCACCGTCG DrT61R CTAGATGCTTGGCCTCACGT
DrT26R CTAGTACGGCTCCACAGGCT DrT62F CACCATGAAGATACAGTGTGATGTGTGTG
DrT27F CACCATGACGATTAGAAGAGTGGGC DrT62R TTAGCCTAGATCAGGGACAATG
植物生理学报1260
纯化特异性的单一扩增片段。取1 μL DNA纯化产
物, 测量其浓度(c, ng·μL-1), 以每个DNA片段的长
度(bp)表示其近似相对摩尔质量(M), c/M为其近似
摩尔浓度, 根据该近似摩尔浓度, 等比例混合70个
目的基因的扩增产物。
2.3 Gateway入门文库构建
按照pENTR™ Directional TOPO® Cloning
Kits反应体系进行连接反应(PCR产物和载体的摩
尔比例为1:1), 室温(22~23 ℃)静置10 min。使连接
产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, LB固体抗性
筛选培养基(50 mg·L-1卡那霉素)上37 ℃过夜培养
筛选, 使长出的单菌落数量为克隆基因数目的10
倍以上, 保证每个基因都成功克隆。随机挑选单
菌落进行PCR鉴定。将所有的单菌落洗脱下来, 于
LB液体培养基(50 mg·L-1卡那霉素)中37 ℃、200
r·min-1振荡培养后提取质粒备用。
2.4 植物表达文库构建
根据Gateway® LR Clonase™ Enzyme Mix Kit
(invitrogen)说明书进行LR反应, 将目的基因片段
由入门载体转移到表达载体pEarlygate100 (Earley
等2006)中。按下面反应体系进行加样: 2 μL Entry
Clone (300 ng·μL-1); 1 μL pEarlygate100 (150
ng·μL-1); 2 μL 5×LR Clonase Reaction Buffer; 3 μL
TE Buffer。
混匀后加2 μL LR Clonase™ Enzyme, 轻轻混
合均匀, 25 ℃静置1 h。向反应液中加入1 μL的蛋
白酶K (2 μg·μL-1) 37 ℃水浴10 min终止LR反应。
取3 μL LR反应液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,
LB固体筛选培养基中37 ℃过夜培养, 同样要保证
长出的单菌落数量为克隆基因数目的10倍以上。
随机挑选单菌落进行PCR鉴定。将所有的菌落洗
脱下来, 于LB液体培养基(50 mg·L-1卡那霉素)中
37 ℃、200 r·min-1振荡培养后提取质粒备用。
2.5 农杆菌文库构建
取上述LR反应后转化成功的质粒电击转化农
杆菌GV3101, YEP固体抗性筛选培养基(50 mg·L-1
卡那霉素+50 mg·L-1利福平)进行筛选, 保证菌斑的
数量是目的基因数目的10倍以上。随机挑取单菌
斑进行PCR鉴定, 保证阳性克隆的效率为90%以
上。将所有的阳性克隆洗脱下来, 置于250 mL YEP
液体培养基(50 mg·L-1卡那霉素+50 mg·L-1利福平)
中, 28 ℃、200 r·min-1过夜培养, 保存菌种备用。
2.6 植物转化
种植野生型(Col-0)拟南芥, 待其生长到花蕾
表1 (续)
引物编号 引物序列(5′→3′) 引物编号 引物序列(5′→3′)
DrT27R TTATAATTCGCTTGATAGAACATAA DrT63F CACCATGGTGGCGTCAGCTTT
DrT28F CACCATGATGAAGAGATTAAGCAGTTCAG DrT63R TTAGAGGTACTTGAACAGGATACC
DrT28R TCAGTTCCACTGATCAACGG DrT64F CACCATGACGGGGAAGGCGTT
DrT29F CACCATGGCGATTACGGTGCC DrT64R TCACGAGAAGATCCTGAAGAGG
DrT29R TTAAAGCTTGGAAGGAGACTTG DrT65F CACCATGGAGAAGTACGAGCTGGTG
DrT30F CACCATGGCTGAAGAGTACAAGAACG DrT65R1 TCAACTGATTCTCACTTCTCCG
DrT30R TCATCCTTCTAAATCATCGGACT DrT65R2 TCACACTTCTCCACTTGCGT
DrT31F CACCATGACCTCATTTTCTGCCTTT DrT67F CACCATGTCGTCGGATGAGGAAG
DrT31R CTAATAACTCCAAAGGGACACG DrT67R TCAAGAGGAAGAACAGCAAGAG
DrT32F CACCATGACCTCATTTTCTACCTTCTCTG DrT68F CACCATGGCAGACAACAAGCAGAG
DrT32R TTAATAACTCCAAAGGGACACG DrT68R CTACTTGTTCATGCCGGTCT
DrT33F CACCATGGCGATGTCWTTCTCAGG DrT69F CACCATGGGAAARAGCGAGGAAC
DrT33R TCATGCCTTTGTRGTGTCCT DrT69R TTAGCGAGCAGCTACACCRT
DrT34F CACCATGTTGAAAGAAGAGAGTAATGAGAGTG DrT70F CACCATGGCTCTTGAGACTCTCAATTC
DrT34R TTAGAAGGAMGGAACAATTCCATAA DrT70R1 TTAAGATATCACAACTGCGACTTG
DrT35F CACCATGACCTCAGTTTCTGCGTTCT DrT70R2 TCAACGTTTAGATATCACAACTGC
DrT35R TTAATAACTCCAGAGGGATATGTCG M13F GTAAAACGACGGCCAG
DrT36F CACCATGAACTCAGTCTCTACTCTTTCTGAA M13R CAGGAAACAGCTATGAC
DrT36R CTAATAACTCCAGAGGTTCATGTCA AttB1 ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT
DrT37F CACCATGGTTGCTATTTCAGAGATCA AttB2 ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT
DrT37R TCAACAAACAGGTCTTCCAAG
王道杰等: 油菜抗逆相关基因FOX拟南芥文库构建 1261
期时进行转化。取保存的农杆菌菌液5 μL加入到5
mL含抗生素(50 mg·L-1卡那霉素+50 mg·L-1利福平)
的YEP液体培养基中, 28 ℃、200 r·min-1培养16 h
活化菌种。取1 mL活化后的菌种接种到200 mL的
YEP液体培养基(50 mg·L-1卡那霉素+50 mg·L-1利
福平)中, 28 ℃、200 r·min-1过夜培养至OD600为
1.2~1.6。室温5 000 r·min-1离心20 min。弃上清,
沉淀用1 mL缓冲液(1/4MS盐、5%的蔗糖、0.03%
的Silwet L-77)重悬。用上述缓冲液将菌液OD600值
调到0.8左右。将拟南芥花序浸入上述转化液中
30 s, 用保鲜膜把整盘植株罩起来保湿, 培养室内
避光处理24 h。去除保鲜膜, 将植株重新放置于培
养室继续光照培养。一周后植株若长出新花蕾,
可重复浸染1次, 以提高转化效率。
2.7 转基因材料筛选鉴定
转基因植株收获的种子, 经干燥及2周以上的
后熟处理, 于4 ℃放置3 d进行春化后, 均匀播撒在
含有营养土的托盘中。约3 d之后, 视种子的萌发
情况, 喷洒PPT (35 mg·L-1), 每隔1 d喷洒1次, 连续
喷洒3次, 待无抗性的幼苗与有抗性的幼苗可以明
显区分为止。挑取阳性单株移栽于营养钵。待拟
南芥抽苔后, 剪1~2片叶片, 提取DNA, 用载体上重
组位点的通用引物attB1和attB2进行PCR扩增鉴定
(扩增条件: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 56 ℃ 30 s,
72 ℃ 2.5 min, 30个循环; 72 ℃ 10 min)。
2.8 FOX植株抗逆性鉴定
将拟南芥种子点在正常的MS培养基上, 竖直
培养5 d, 根长大约为1 cm时, 挑取根长一致的植株,
摆到不同的处理板上, 生长7~10 d, 比较FOX植株
与WT的差异, 差异比较明显的植株初步确定为突
变株。筛选条件根据文献报道和预实验确定为
NaCl 150 mmol·L-1、甘露醇 300 mmol·L-1、ABA 5
µmol·L-1和30 µmol·L-1。每种胁迫处理筛选1 000株。
实验结果
1 油菜抗逆相关基因的克隆
根据拟南芥抗逆信号转导研究相关文献和芯
片数据库信息, 筛选拟南芥中对盐、旱、冷、高
温等非生物胁迫相关的基因, 共筛选出80个与拟
南芥逆境信号相关的基因。以这些基因为种子序
列, 与油菜基因组序列进行同源性比对, 筛选出相
似度极高的具完整ORF的EST序列70条。
以课题组前期筛选出的耐旱油菜品系R29为
材料, 经PEG-6000胁迫处理后提取的RNA反转录
合成的cDNA为模板进行PCR扩增, 设计的70对引
物全部扩增出预期大小的目的基因片段, 部分基
因的扩增结果如图1所示。
图1 油菜潜在抗逆相关基因PCR扩增
Fig.1 Potential stress resistant genes were amplified by PCR
1~42: 扩增的目的基因; M: DL2000 Marker。
2 油菜抗逆相关基因文库构建
上述目的片段回收后进行定量, 等摩尔混匀
后克隆入Gateway入门载体pENTR™/D-TOPO®。
为了保证每个目的片段都能够克隆入载体, 转化
后的菌斑数至少应为目的基因数的10倍以上, 即
至少达到70×10=700个克隆。经估算, 培养出的菌
落有1 000个以上(分布于不同培养皿)。每个培养
皿随机挑选40个单菌落进行PCR鉴定, 阳性克隆数
达到97%以上。克隆的70个目的基因的长度在
465~2 310 bp之间, 菌落PCR结果(图2-A)显示不同
大小的片段随机分布在500~3 000 bp之间, 表明目
的片段均已克隆成功。
上述入门文库菌落培养后提取质粒, 与植物
表达载体pEarlygate100 (Earley等2006)等摩尔比例
混合进行LR反应, 使目的基因由入门载体转移到
植物表达载体上, 即植物表达文库。这一转化步
骤同样要保证单菌落数量为目的基因数的10倍以
上。随机挑取单菌落进行PCR鉴定, PCR产物电泳
结果(图2-B)显示, 绝大多数克隆为单一条带, 少量
克隆为双带(5%), 条带大小依然随机分布在500~
3 000 bp之间, 表明目的片段均已成功克隆入表达
载体上。每个平板随机选取的50个菌斑PCR鉴定
结果表明, 阳性克隆占95%以上。
将LR反应后转化长出的菌落全部洗脱下来,
植物生理学报1262
富集培养后提取质粒, 电击转化农杆菌GV3101, 构
建农杆菌文库用于植物的转化。为了保证70个目
的基因全部成功转化入农杆菌, 同样要保证单菌
落数量大于700个。每个培养皿随机挑选48个单
菌落进行PCR鉴定, 结果显示, 阳性克隆占95%以
上, 条带的大小随机分布于500~3 000 bp之间(图
2-C), 克隆数约覆盖基因文库容量的9.5倍。其中
多数为单一特异性条带, 双条带仅占2%。将所有
菌落洗脱下来培养后保存菌种备用。
3 油菜FOX拟南芥文库构建
农杆菌文库转化Col-0野生型拟南芥626个单
株, 其中558株正常结实。两批转化共收获种子约
30 000粒。苗期经PPT筛选, 共获得381株抗性单
株, 其中第1批69株, 第2批312株。部分植株的PCR
鉴定结果如图3所示。PCR鉴定结果显示, 第1批69
株抗性株中, 含单一插入片段的有55株, 双片段插
入的9株, 插入3个片段的2株, 3株未扩增出条带, 为
PPT筛选的假阳性植株。第2批312株抗性株中, 含
单一片段的203株, 双片段插入的77株, 3片段插入
的7株, 4个片段插入的2株, 23株未扩增出条带, 为
PPT筛选的假阳性植株。阳性单株培养后混收种
子, 构建成一个小型的油菜-FOX-拟南芥文库。
4 FOX植株的抗逆性筛选
根据文献报道及浓度梯度预实验结果, 选取
300 mmol.L-1的甘露醇、150 mmol.L-1的NaCl、30
μmol.L-1和5 μmol.L-1的ABA进行抗逆植株的筛选,
主要筛选指标为根长及子叶变绿情况。部分FOX
植株与WT有明显差异, 将这些差异明显的植株标
记后移入营养钵中培养。经统计 , 目前在甘露
醇、NaCl和ABA板上分别筛选到根长不敏感表型
植株12、31和25株, 根长敏感植株分别为16、28
和21株。在甘露醇和NaCl板上分别筛选到子叶变
绿不敏感植株9株和2株(表2)。这些结果初步表明
我们构建的油菜-FOX-拟南芥文库是有效的, 将油
菜可能的抗逆基因转入拟南芥后, 确实可以筛选
到逆境胁迫相关的FOX植株, 同时说明这一方法
可以用于大量基因的初步鉴定工作, 快速验证基
因的功能。
5 T1代表型变异株鉴定
单株种植T1代转基因苗的过程中发现5株表
型异常植株, 这些植株表现为植株矮小、叶片发
图3 转基因植株PCR鉴定
Fig.3 Identification of transgenic plants by PCR
1~68: 不同转基因植株的PCR鉴定结果; W: 野生型; M: DNA
Marker 250 bp。
表2 FOX植株抗逆性筛选结果统计
Table 2 Statistics of stress selection in
rape-FOX-Arabidopsis library
筛选条件
根长相关表 子叶变绿表
型植株/株 型植株/株
不敏感 敏感 不敏感 敏感
甘露醇300 mmol·L-1 12 16 9 0
NaCl 150 mmol·L-1 31 28 2 0
ABA 30 μmol·L-1 10 11
ABA 5 μmol·L-1 15 10

图2 不同文库单菌落PCR鉴定
Fig.2 Identification of single colony by PCR in different
library
A: 入门文库, B: 表达文库, C: 农杆菌文库; M: DNA Marker
iii。数字指示不同文库随机挑选的单菌落PCR扩增产物。
王道杰等: 油菜抗逆相关基因FOX拟南芥文库构建 1263
育畸形、抽苔早、花期较短等表型(图4-A)。提取
这些表型异常株的叶片DNA, 利用载体上的通用
引物PCR扩增插入片段(图4-B), 产物回收后测序,
经生物信息学分析, 扩增到的序列确为转入的油
菜序列而非拟南芥序列。经Blast比对分析, 获得
这些表型异常的单株中所转入的目的基因及其同
源的拟南芥基因信息(表3)。从PCR扩增产物电泳
结果及测序信息可知, T1-11和T1-14为双基因转化
株, T1-20、T1-32和T1-66为单基因转化株(图4-B)。
讨　　论
随着油菜基因组测序的完成, 功能基因组学
的研究迫在眉睫。但目前应用于油菜功能基因组
学研究的遗传材料及技术依然匮乏。油菜是异源
四倍体植物, 多数基因存在冗余, 因此如果利用
T-DNA或者转座子插入突变体进行基因功能研究
时, 转化周期长, 工作量大, 单独沉默某一基因, 由
于有冗余基因的功能存在, 有时并不能获得具有
明显突变表型的突变体。而且甘蓝型冬油菜为两
年生越冬植物, 直接在油菜体内通过超表达或沉
默的方式研究基因的功能周期较长, 受自然条件
影响较大。另外, 构建重组自交系和近等基因系
进行QTL定位, 开发SSR等多态性标签等方式耗时
费力, 且往往不能进行精细定位。本研究采用FOX
hunting system技术和Gateway技术建立了油菜抗
逆相关基因高通量克隆和功能分析体系。不同于
传统的功能缺失型(loss of function)研究方法, 在转
基因植株中表达单个或有限数量的目的基因全长
cDNA就可能引起转基因拟南芥植株明显的表型
变化。
图4 T1代表型突变株及目的基因克隆
Fig.4 Identification of T1 plants with mutant phenotypes and
cloning of target genes
A: 表型突变体苗期植株生长状况; 其中, 1: T1-20; 2: T1-32; 3:
T1-66; 4: T1-11; 5: T1-14; WT: Col-0野生型拟南芥。B: 表型突变体
目的基因PCR扩增结果; 其中, M: DNA Marker iii; WT: Col-0野生
型拟南芥; 1: T1-20; 2: T1-32; 3: T1-66; 4: T1-11; 5: T1-14。
表3 有突变表型的T1突变体基因信息
Table 3 information of inserted genes in the morphological mutant T1 plants
编号 引物 插入基因 同源的拟南芥基因 基因注释
T1-11a DrT7 AF2445201 AT1G74960 编码质体β-酮酯酰合成酶ii, 参与16:0-ACP到18:0-ACP脂肪酸的延伸。基因
敲除纯合子突变体胚致死, 表明胚的早期发育对16:0含量的升高是敏感的。
T1-11b DrT61 JN163870.1 AT1G20630 利用亚铁血红素作为辅因子催化过氧化氢的还原。h2O2可保护细胞免受
U68219.2 毒性。
T1-14a DrT21 AY245884.1 AT4G27410 编码干旱响应的NAC转录因子, 定位于细胞核, 在ABA介导的干旱响应中
DrT22 AY245885.1 作为转录激活因子。
T1-14b DrT26 AY307449.1 AT2G36530 参与光依赖的耐冷性反应, 编码烯醇化酶, 是磷酸化酪氨酸蛋白, 在拟南芥
种子中磷酸化状态调控对ABA的响应。
T1-20 DrT34 AY496442.1 AT5G15850 花期调控基因CONSTANS的同源基因。
AY356370.1
T1-32 DrT8 AF314811.1 AT2G39800 编码一个Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶, 此酶是脯氨酸生物合成中的限速酶。
T1-66 DrT17 AY245880.1 AT5G63790 编码NAC家族的一个转录因子。ANAC102在幼苗萌发期介导低氧胁迫
DrT19 AY245882.1 (缺氧)的响应。
DrT20 AY245883.1
植物生理学报1264
在材料的选取上, 我们选择前期筛选出的耐
旱性油菜品系R29幼苗进行胁迫处理后提取RNA,
合成cDNA后作为基因扩增的模板。由于70个潜
在抗逆相关基因中多数为逆境胁迫诱导表达的基
因, 预实验结果显示, 未经胁迫处理的材料提取的
RNA, 有些基因不能有效得到扩增。因此, 我们选
用20% PEG-6000 (W/V)对材料进行处理后再提取
RNA。另外, 我们的前期研究发现, 干旱胁迫相关
基因的表达时间分布在PEG-6000处理后0.5~48 h
内(王道杰等2012)。因此, 我们选取不同时间段进
行取样, 等比例混合后, 液氮冷冻, 提取RNA, 以此
提高抗逆相关基因的表达和扩增效率。
研究所用的表达载体pEarley100上含有ccdB
自杀基因, 该基因翻译产物抑制质粒在F因子缺失
的E. coli中复制。未参加LR反应重组的表达载体
转化的细胞不能正常生长而被排除。发生位点特
异性重组的入门载体中被置换进了ccdB基因, 因
此参加反应后的入门载体也被排除, 另外载体上
的抗生素筛选标记也增加了表达载体构建的选择
效率。经PCR验证, 阳性克隆效率均达到90%以
上, 菌落数量覆盖文库容量9倍以上。除此之外,
还有一部分未参加反应的入门载体, 由于其抗生
素筛选标记和表达载体相同, 转化大肠杆菌后无
法通过抗生素筛选来排除。但未参加LR重组反应
的入门载体中不含有农杆菌复制起点, 即不能在
农杆菌中复制, 因此, 这一小部分可能存在的未参
加LR重组反应的入门载体转化的农杆菌不能产生
抗性而无法存活下来。也可以被排除。通过对农
杆菌GV3101的转化鉴定, 目的基因的克隆效率进
一步提高到95%以上, 约覆盖目的基因文库容量的
9.5倍, 保证了所有目的基因包括在文库中。
参考文献
王道杰, 杨翠玲, 桂月靖, 张书芬, 朱家成, 王建平(2012). 油菜抗旱
性及鉴定方法与指标. I. 油菜早期抗旱性鉴定模拟技术体系
构建. 西北农业学报, 20 (12): 77~82
Breuer C, Kawamura A, ichikawa T, Tominaga-Wada R, Wada T,
Kondou Y, Muto S, Matsui M, Sugimoto K (2009). The trihe-
lix transcription factor GTL1 regulates ploidy-dependent cell
growth in the Arabidopsis trichome. Plant Cell, 21: 2307~2322
Dubouzet JG, Maeda S, Sugano S, Ohtake M, hayashi N, ichikawa
T, Kondou Y, Kuroda h, horii Y, Matsui M et al (2011). Screen-
ing for resistance against Pseudomonas syringae in rice-FOX
Arabidopsis lines identified a putative receptor-like cytoplasmic
kinase gene that confers resistance to major bacterial and fungal
pathogens in Arabidopsis and rice. Plant Biotech J, 9: 466~485
Earley KW, haag JR, Pontes O, Opper K, Juehne T, Song K, Pikaard
CS (2006). Gateway-compatible vectors for plant functional ge-
nomics and proteomics. Plant J, 45: 616~629
Fujita M1, Mizukado S, Fujita Y, ichikawa T, Nakazawa M, Seki M,
Matsui M, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K (2007). identi-
fication of stress-tolerance-related transcription-factor genes via
mini-scale Full-length cDNA Over-eXpressor (FOX) gene hunt-
ing system. Biochem Biophys Res Commun, 364: 250~257
higuchi-Takeuchi M, Mori M, Matsui M (2012). high-throughput
analysis of rice genes by means of the heterologous full-length
cDNA overexpressor (FOX)-hunting system. int J Dev Biol, 57:
517~523
ichikawa T, Nakazawa M, Kawashima M, iizumi h, Kuroda h, Kon-
dou Y, Tsuhara Y, Suzuki K, ishikawa A, Seki M et al (2006).
The FOX hunting system: an alternative gain-of-function gene
hunting technique. Plant J, 48: 974~985
Kinoshita A, Nakamura Y, Sasaki E, Kyozuka J, Fukuda h, Sawa S
(2007). Gain-of-function phenotypes of chemically synthetic
CLAVATA3/ESR-related (CLE) peptides in Arabidopsis thaliana
and Oryza sativa. Plant Cell Physiol, 48: 1821~1825
Kondou Y, higuchi M, Takahashi S, Sakurai T, ichikawa T, Kuroda
h, Yoshizumi T, Tsumoto Y, horii Y, Kawashima M et al (2009).
Systematic approaches to using the FOX hunting system to iden-
tify useful rice genes. Plant J, 57: 883~894
Ma J, hanssen M, Lundgren K, hernández L, Delatte T, Ehlert A, Liu
CM, Schluepmann h, Dröge-Laser W, Moritz T et al (2011). The
sucrose-regulated Arabidopsis transcription factor bZiP11 re-
programs metabolism and regulates trehalose metabolism. New
Phytol, 191: 733~745
Sakurai T, Kondou Y, Akiyama K, Kurotani A, higuchi M, ichikawa T,
Kuroda h, Kusano M, Mori M, Saitou T et al (2011). RiceFOX:
a database of Arabidopsis mutant lines overexpressing rice full-
length cDNA that contains a wide range of trait information to fa-
cilitate analysis of gene function. Plant Cell Physiol, 52: 265~273
Sato T, Maekawa S, Yasuda S, Sonoda Y, Katoh E, ichikawa T, Na-
kazawa M, Seki M, Shinozaki K, Matsui M et al (2009). CNi1/
ATL31, a RiNG-type ubiquitin ligase that functions in the car-
bon/nitrogen response for growth phase transition in Arabidopsis
seedlings. Plant J, 60: 852~864