全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (4): 392~398392
收稿 2011-01-10　　修定 2011-02-14
资助 国家自然科学基金(30460016)。
* 通讯作者(E-mail: gongming63@163.com; Tel: 0871-
5516516)。
Cd2+胁迫诱导烟草悬浮细胞脯氨酸积累的生化途径及外源脯氨酸对Cd2+
胁迫下H2O2产生的抑制作用
文锦芬1, 2, 3, 杨双龙2, 龚明2,*
1中国农业大学水利与土木工程学院, 北京100083; 2云南师范大学生命科学学院, 教育部生物能源持续开发利用工程研究中
心, 云南省生物质能与环境生物技术重点实验室, 昆明650092; 3昆明理工大学现代农业工程学院, 昆明650224
摘要: Cd2+可提高烟草悬浮细胞脯氨酸的含量, 顺序上调脯氨酸合成关键酶鸟氨酸转氨酶(OAT)、精氨酸酶、D1-吡咯啉-5-
羧酸合成酶(P5CS)和谷氨酸脱氢酶(GDH)的活性, 降低脯氨酸降解关键酶脯氨酸脱氢酶(ProDH)的活性, 表明Cd2+胁迫诱导
烟草细胞脯氨酸的积累是脯氨酸合成的鸟氨酸途径和谷氨酸途径顺序激活、而脯氨酸降解途径显著抑制的综合结果。此
外, Cd2+能导致烟草细胞H2O2的快速产生及H2O2产生相关酶(质膜NADPH氧化酶、细胞壁多胺氧化酶及共价结合与离子结
合细胞壁过氧化物酶)活性升高和脂质过氧化产物丙二醛(MDA)增加, 导致烟草细胞的氧化胁迫。外源脯氨酸预处理显著
抑制了Cd2+诱导的烟草细胞H2O2的产生与MDA的增加, 减轻了Cd
2+诱导的氧化胁迫。而脯氨酸抑制Cd2+诱导的H2O2产生可
能是由于脯氨酸抑制了H2O2产生相关酶的活性所致。
关键词: Cd2+; 烟草悬浮细胞; 脯氨酸; 代谢途径; 过氧化氢
Biochemical Pathways of Cd2+ Stress-Induced Proline Accumulation and In-
hibitory Effect of Exogenous Proline on Cd2+-Induced H2O2 Production in To-
bacco (Nicotiana tabacum L.) Suspension Cells
WEN Jin-Fen1,2,3, YANG Shuang-Long2, GONG Ming2,*
1College of Water Conservancy & Civil Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 2Key Laboratory of
Biomass Energy and Environmental Biotechnology, Yunnan Province; Engineering Research Center of Sustainable Development
and Utilization of Biomass Energy, Ministry of Education; School of Life Sciences, Yunnan Normal University, Kunming 650092,
China; 3College of Modern Agricultural Engineering, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650224, China
Abstract: Cd2+ treatment could lead to a significant accumulation of proline, sequential up-regulation of activi-
ties of the key enzymes (ornithine-δ-aminotansferase, arginase, D1-pyrroline-5-carboxylate synthetase and glu-
tamate dehydrogenase) for proline biosynthesis, and inhibition of activity of the key enzyme proline dehydroge-
nase for proline degradation in tobacco (Nicotiana tabacum L.) suspension cells. These results indicated that
the Cd2+ stress-induced proline accumulation in the tobacco cells might be a combined result of the orderly acti-
vation of the ornithine pathway and the glutamate pathway of proline biosynthesis, and inhibition of proline
degradation pathway. Furthermore, Cd2+ stress increased the production of H2O2, activities of the H2O2 produc-
ing-related enzymes (plasma membrane NADPH, cell wall polyamine oxidase, covalently and ionically-bound
cell wall peroxidases), the product (MDA) of membrane lipid peroxidation and oxidation stress in the tobacco
cells. Exogenous application of proline significantly decreased H2O2 production, MDA content and oxidation
stress induced by Cd2+ stress. The inhibition of H2O2 production by exogenous proline might be due to the de-
clined activities of the H2O2 producing-related enzymes under Cd
2+ stress.
Key words: Cd2+; tobacco suspension cells; proline; metabolic pathways; H2O2
镉(Cd)被广泛地应用于机械、化工、电镀、
印染等部门, 但它又是一种毒性高、迁移性大的
重金属元素, 容易随这些工业排放的废弃物进入
环境, 从而成为Cd的污染源(Alumaa等2002; Dina-
kar等2008)。Cd不是植物生长发育所必需的元素,
但易被植物吸收, 并且通过作物对其的吸收而进
文锦芬等: Cd2+胁迫诱导烟草悬浮细胞脯氨酸积累的生化途径及外源脯氨酸对Cd2+胁迫下H2O2产生的抑制作用 393
入人体, 影响人们的健康(Metwally等2005)。Cd胁
迫会影响植物的多种生理生化过程, 抑制水稻光
合作用, 降低叶绿素含量(Hsu和Kao 2004), 影响万
寿菊(Uraguchi等2006)、豌豆(Sandalio等2001)的
生长, 促进过氧化氢的产生, 诱导氧化胁迫。
脯氨酸是植物体内的渗透调节物质 , 在干
旱、高盐、极端温度、冰冻、紫外线胁迫等条件
下, 脯氨酸合成的增加和降解的减少会导致植物
体内脯氨酸大量累积, 植物通过提高体内脯氨酸
的含量保护细胞膜系统, 维持胞内酶的结构, 减少
胞内蛋白质的降解(Kishor等2005; Ashraf和Foolad
2007; Yang等2009)。重金属Cu、Cd胁迫均可诱导
植物体内脯氨酸含量的增加, 由于脯氨酸可以螯
合单线态氧, 高效清除羟自由基, 从而降低重金属
胁迫诱发的氧化胁迫对植物的伤害(Zhang等2008;
Dinakar等2009)。但Cd胁迫对脯氨酸代谢途径的
影响却尚未见报道。本文以烟草悬浮细胞为材料,
研究了Cd2+胁迫下烟草悬浮细胞脯氨酸含量及脯
氨酸代谢途径关键酶活性的变化, 试图揭示Cd2+胁
迫下脯氨酸积累的生化机制; 并用外源脯氨酸预
处理烟草悬浮细胞, 研究Cd2+胁迫下过氧化氢产生
及其相关酶活性的变化, 以确定脯氨酸预处理抑
制Cd2+胁迫下过氧化氢产生的机制, 以探讨Cd2+胁
迫诱导烟草细胞脯氨酸积累的生理意义。
材料与方法
烟草(Nicotiana tabacam L.)品种‘Bright Yel-
low’的愈伤组织由其幼嫩的茎髓诱导而成, 悬浮细
胞的具体培养方法参照本实验室以前方法(李忠光
等2005, 2009)。继代3代在26 ℃、110 r·min-1摇床
中培养4 d的悬浮细胞用于下列实验。
Cd胁迫处理方法: CdCl2用蒸馏水溶解, 配制
成0.5 mol·L-1母液, 以0.25 μm的滤膜过滤除菌。分
别将Cd2+母液加到悬浮细胞培养液中, 使其终浓度
为0.1~3.0 mmol·L-1, 对照加入相同体积的无菌蒸馏
水。
脯氨酸预处理方法: 脯氨酸用蒸馏水溶解, 配
制成1.0 mol·L-1母液, 以0.25 μm的滤膜过滤除菌。
分别将脯氨酸母液加到悬浮细胞培养液中, 使其
终浓度为20~50 mmol·L-1, 预处理20~50 min, 对照
加入相同体积的无菌蒸馏水。
脯氨酸含量用酸性茚三酮法测定(Bates等
1973); D1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)的提取和活
性测定参照之前(杨双龙和龚明2009; Yang等2009)
的方法 ; 鸟氨酸转氨酶 (OAT)和脯氨酸脱氢酶
(ProDH)活性测定参考Sánchez等(2001)的方法; 谷
氨酸脱氢酶(GDH)的提取与测定参考Robinson等
(1991)的方法; 精氨酸酶(arginase)活性的测定按照
Roubelakis和Kliewer (1978)的方法; 用荧光探针
H2DCF-DA测定过氧化氢含量变化及质膜NADPH
氧化酶的测定参照Hao等(2008)的方法; 丙二醛
(MDA)的测定参照赵世杰和李德全(2004)的方法;
细胞壁多胺氧化酶(PAO)的测定参照汪天等(2005)
的方法; 细胞壁共价结合过氧化物酶(POD)和细胞
壁离子结合过氧化物酶(POD)的提取参照Ranieri
等(2001)的方法 ; 细胞壁共价结合过氧化物酶
(POD)和细胞壁离子结合过氧化物酶(POD)的测定
按照Jan等(2001)的方法。蛋白质的测定按照Brad-
ford (1976)的方法, 以牛血清蛋白为标准样品。
所有实验均重复3次, 每次实验中取样重复3
次。实验数据用SPSS 13.0分析, 用Sigmaplot 10.0
作图。数据均为平均值±标准误。
实验结果
1 Cd2+胁迫诱导烟草悬浮细胞内脯氨酸的积累及
其生化途径
预备实验表明, 0.1~3.0 mmol·L-1 Cd2+处理均
可显著诱导烟草细胞积累脯氨酸(结果未列出)。
在1.0 mmol·L-1 Cd2+胁迫下, 烟草悬浮细胞脯氨酸
的含量迅速上升, 在12 h达到峰值, 约为对照的2.7
倍, 随后略有下降, 但仍极显著(P<0.01)高于对照
(图1)。
植物体内脯氨酸合成有鸟氨酸和谷氨酸两条
途径。鸟氨酸途径中的精氨酸酶(arginase)催化精
氨酸到鸟氨酸的转化反应, 控制鸟氨酸的含量。
鸟氨酸转氨酶(ornithine-δ-aminotansferase, OAT)是
该途径的核心调节酶, 能将底物鸟氨酸转化为γ-谷
氨酰半缩醛(glutamic-γ-semi-aldehyde, GSA), 进一
步生成D1-吡咯啉-5-羧酸(D1-pyroline-5-carboxylate,
P5C) (Kishor等2005)。如图2所示, 1.0 mmol·L-1
Cd2+胁迫下烟草悬浮细胞内的精氨酸酶和鸟氨酸
转氨酶活性都快速上升, 在胁迫后8 h达到最高值,
植物生理学报394
分别是对照的2.18倍和1.8倍, 8 h后二者的活性开
始下降。
谷氨酸途径中限速酶之一的谷氨酸脱氢酶
(glutamate dehydrogenase, GDH)具有双重作用, 一
方面催化谷氨酸的降解反应, 另一方面在逆境下
主要功能是催化游离氨基酸生成谷氨酸。谷氨酸
合成途径的另一关键酶是D1-吡咯啉-5-羧酸合成酶
(D1-pyroline-5-carboxylate synthetase, P5CS), P5CS
以谷氨酸为底物, 催化其到D1-吡咯啉-5-羧酸的合
成反应, P5C再进一步生成脯氨酸(Kishor等2005)。
1.0 mmol·L-1 Cd2+胁迫下烟草细胞内的谷氨酸脱氢
酶和D1-吡咯啉-5-羧酸合成酶活性都快速上升, 在
胁迫后12 h达到最高值, 分别是对照的1.45倍和1.7
倍, 12 h后二者的活性开始下降(图3)。图1 Cd2+胁迫下烟草细胞脯氨酸含量的变化
Fig.1 Changes of proline content in the tobacco cells under
Cd2+ stress
图2 Cd2+胁迫下烟草细胞精氨酸酶(A)和鸟氨酸转氨酶(B)
活性的变化
Fig.2 Changes of arginase (A) and ornithine-δ-aminotans-
ferase (B) activities in the tobacco cells under Cd2+ stress
图3 Cd2+胁迫下烟草细胞谷氨酸脱氢酶(A)和D1-吡咯啉-5-
羧酸合成酶(B)活性的变化
Fig.3 Changes of glutamate dehydrogenase (A) and
D1-pyroline-5-carboxylate synthetase (B) activities
in the tobacco cells under Cd2+ stress
脯氨酸降解是由两个连续的线粒体酶催化,
即脯氨酸脱氢酶(proline dehydrogenase, ProDH)和
D1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶(D1-pyroline-5-carboxylate
dehydrogenase, P5CDH), 其中脯氨酸脱氢酶(ProDH)
是脯氨酸降解的限速酶(Sánchez等2001; Kishor等
文锦芬等: Cd2+胁迫诱导烟草悬浮细胞脯氨酸积累的生化途径及外源脯氨酸对Cd2+胁迫下H2O2产生的抑制作用 395
2005)。如图4所示, 1.0 mmol·L-1 Cd2+胁迫过程中
烟草悬浮细胞内的ProDH活性连续极显著(P<0.01)
下降。
当用20~50 mmol·L-1不同浓度的脯氨酸预处
理不同时间后, 再加入1.0 mmol·L-1 Cd2+胁迫1.0 h,
检测烟草细胞中H2O2含量。结果表明, 脯氨酸预
处理显著抑制了Cd2+胁迫诱导的H2O2产生。当用
相同浓度的脯氨酸预处理时, 随着预处理时间的
增加, 脯氨酸对Cd2+胁迫下烟草细胞H2O2产生的抑
制作用增强; 而当预处理时间相同时(尤其在20
min和30 min), 则随着脯氨酸浓度的增加, 其对
H2O2的产生的抑制作用也越显著(P<0.01) (图6)。
在后面的实验中均以30 mmol·L-1脯氨酸预处理40
min为预处理条件。
图4 Cd2+胁迫下烟草细胞脯氨酸脱氢酶活性的变化
Fig.4 Changes of proline dehydrogenase activity in the
tobacco cells under Cd2+ stress
图5 Cd2+胁迫下烟草细胞中H2O2含量的变化
Fig.5 Change of H2O2 production in the tobacco cells under
Cd2+ stress
RFU: 相对荧光单位。
图6 脯氨酸预处理对Cd2+胁迫诱导的烟草细胞H2O2产生的
抑制效应
Fig.6 Inhibitory effect of proline pretreatment on the Cd2+-
induced H2O2 production in the tobacco cells
2 Cd2+胁迫诱导烟草细胞H2O2的产生及外源脯氨
酸的抑制效应
已有报道Cd2+胁迫可促进植物细胞H2O2的产
生(Olmos等2003; Kuo和Kao 2004)。我们用荧光探
针H2DCF-DA检测的结果表明, 在1.0 mmol·L-1的
Cd2+胁迫下, 烟草细胞H2O2的含量5 min内就有显
著的上升, 30 min达到峰值, 为对照的4.6倍, 此后
H2O2的含量逐步下降, 70 min后H2O2含量趋于平
稳, 但仍为对照的3.5倍(图5)。
丙二醛(MDA)是不饱和脂肪酸的降解产物,
常被用来作为脂质过氧化的指标。在1.0 mmol·L-1
Cd2+胁迫下, 烟草悬浮细胞丙二醛的含量逐渐上
升, 并随时间的延长, 其含量一直增加。30 mmol·L-1
脯氨酸预处理40 min后, 再转入用1.0 mmol·L-1 Cd2+
胁迫, 细胞丙二醛含量总体比未经预处理的含量
低(图7)。
3 Cd2+胁迫下与烟草细胞H2O2产生相关的酶活性
变化及外源脯氨酸的效应
质膜NADPH氧化酶通过还原分子O2而生成
超氧阴离子自由基O2·-, 后者歧化成H2O2, 这被认为
是各种环境刺激诱发H2O2产生的主要酶学途径之
一(Hao等2008)。本实验结果表明, 1.0 mmol·L-1 Cd2+
处理在10~20 min内快速而显著地(P<0.01)提高了
质膜NADPH氧化酶活性(图8-A)。30 mmol·L-1脯氨
植物生理学报396
图7 脯氨酸预处理对Cd2+胁迫下烟草细胞中丙二醛含量的
影响
Fig.7 Effect of proline pretreatment on MDA content in the
tobacco cells under Cd2+ stress
图8 Cd2+胁迫和脯氨酸预处理下烟草细胞质膜NADPH氧
化酶(A)和细胞壁多胺氧化酶(B)活性的变化
Fig.8 Changes of plasma membrane NADPH oxidase (A) and
cell wall polyamine oxidase (B) activities in the tobacco cells
under Cd2+ stress and the proline pretreatment
酸预处理40 min显著(P<0.01)降低了正常培养的烟
草细胞质膜NADPH氧化酶活性; 在1.0 mmol·L-1 Cd2+
胁迫下, 脯氨酸预处理的烟草细胞质膜NADPH氧
化酶活性也快速上升, 但均显著(P<0.05)低于未经
脯氨酸处理的细胞(图8-A)。
细胞壁多胺氧化酶(PAO)催化多胺氧化降解
直接生成H2O2 (汪天等2005)。本实验结果表明,
1.0 mmol·L-1 Cd2+处理在10 min内快速而显著地
(P<0.01)提高了细胞壁PAO活性(图8-B)。但30
mmol·L-1脯氨酸预处理40 min使正常培养的烟草
细胞细胞壁PAO活性升高; 在1.0 mmol·L-1 Cd2+胁
迫下, 脯氨酸预处理的烟草细胞细胞壁PAO活性也
快速上升(图8-B)。
细胞壁过氧化物酶 (POD)以还原型辅酶 I
(NADH)为还原剂, 通过还原分子O2而生成超氧阴
离子自由基O2·-, 然后歧化成H2O2, 这是植物细胞外
生成H2O2的另一途径(Jan等2001)。图9表明, 1.0
图9 Cd2+胁迫和脯氨酸预处理下烟草细胞细胞壁共价结合
过氧化物酶(A)与细胞壁离子结合过氧化物酶
(B)活性的变化
Fig.9 Changes of covalently-bound cell wall peroxidases (A)
and ionically-bound cell wall peroxidases (B) activities in
the tobacco cells under Cd2+ stress and the proline
pretreatment
文锦芬等: Cd2+胁迫诱导烟草悬浮细胞脯氨酸积累的生化途径及外源脯氨酸对Cd2+胁迫下H2O2产生的抑制作用 397
mmol ·L -1 Cd 2+处理在30 min内快速而显著地
(P<0.01)提高了细胞壁共价结合POD和细胞壁离
子结合POD活性。30 mmol·L-1脯氨酸预处理40
min显著降低了正常培养的烟草细胞细胞壁共价
结合POD活性, 但却使细胞壁离子结合POD活性
升高; 在1.0 mmol·L-1 Cd2+胁迫下, 脯氨酸预处理的
烟草细胞细胞壁共价结合POD和细胞壁离子结合
P O D活性也快速上升 , 但在7 0 m i n前均显著
(P<0.05)低于未经脯氨酸处理的细胞(图9)。
讨　　论
植物细胞中脯氨酸合成有谷氨酸和鸟氨酸两
条途径, 但两条途径在脯氨酸积累中的地位和作
用往往因植物的种类、生理状态及环境胁迫因子
的不同而不同(Kishor等2005; Ashraf和Foolad 2007;
Yang等2009)。Delauney和Verma (1993)发现, 在渗
透胁迫条件和低氮条件下谷氨酸途径占主导地位,
而在非胁迫条件及高氮条件下鸟氨酸途径又居于
主导地位。Zhao等(2001)用200 mmol·L-1 NaCl处
理结合14C-Glu和14C-Arg叶面饲喂6 d龄大麦幼苗的
研究发现, 盐胁迫前8 h脯氨酸的积累主要受到谷
氨酸途径的控制, 随后鸟氨酸途径的贡献占主导
地位。我们实验室对玉米的研究表明H2O2诱导的
脯氨酸积累是先激活了脯氨酸合成的谷氨酸途径,
然后是鸟氨酸途径, 同时抑制了脯氨酸降解途径
的综合结果(Yang等2009)。而NO诱导的玉米幼苗
脯氨酸的积累结果是NO激活了鸟氨酸途径, 抑制
了降解途径的结果(杨双龙和龚明2009)。本研究
结果表明, Cd2+胁迫能诱导脯氨酸的积累, 其脯氨
酸积累一方面由于合成途径的酶活性上升, 从酶
的活性变化结果上看, 鸟氨酸途径两个关键酶精
氨酸酶和OAT活性在8 h达到峰值, 而谷氨酸途径
的GDH和P5CS活性在12 h达到峰值(图2、3), 表明
Cd2+胁迫诱导导致鸟氨酸途径和谷氨酸途径的顺
序激活。此外, Cd2+胁迫下脯氨酸降解途径的关键
酶ProDH快速下降。这些结果表明, Cd2+胁迫诱导
烟草细胞脯氨酸的积累是脯氨酸合成的鸟氨酸途
径和谷氨酸途径顺序激活, 而脯氨酸降解途径显
著抑制的综合结果。
一般认为脯氨酸除了作为渗透调节物质以外,
还具有保护蛋白质、生物膜、亚细胞结构和清除
活性氧等功能。因此, 脯氨酸在保护植物细胞免
受逆境胁迫伤害中起到非常重要的作用(Kishor等
2005; Ashraf和Foolad 2007)。Hoque等(2008)用外
源脯氨酸预处理烟草悬浮细胞, 能降低盐胁迫下
烟草悬浮细胞中蛋白质的羰基化, 提高谷胱甘肽
氧化还原态从而降低盐胁迫诱发的氧化胁迫。
Ozden等(2009)的研究则表明, 脯氨酸预处理葡萄
叶片, 能降低其在H2O2胁迫下的H2O2和MDA含
量。本研究结果表明, Cd2+胁迫促进H2O2的快速产
生(图5)和细胞脂质过氧化产物丙二醛的增加(图
7), 导致了烟草细胞氧化胁迫。脯氨酸预处理显著
抑制了Cd2+诱导的烟草细胞H2O2的产生与丙二醛
的增加(图6、7), 减轻了Cd2+胁迫诱导的氧化胁
迫。应该指出的是, 脯氨酸与细胞H2O2之间的关
系不只是单向的, 本实验结果表明脯氨酸能抑制
H2O2的产生; 但另一方面, 我们以前的结果表明
H2O2预处理能诱导植物细胞脯氨酸的积累(Yang等
2009), 暗示着脯氨酸与H2O2有着多重复杂的关
系。
已有一些研究表明脯氨酸能清除超氧阴离子
(O2·-)和单线态氧(
1O2) (Dinakar等2009), 但这些实验
主要是基于体外的脯氨酸对活性氧的直接清除。
而脯氨酸抑制植物细胞内H2O2产生的机制尚未见
报道。已知在高等植物中, 质膜NADPH氧化酶
(Hao等2008)、位于细胞壁的过氧化物酶(李忠光
等2009)和质外体的多胺氧化酶(朱丹等2006)是活
性氧产生的潜在来源。本实验结果表明, 在Cd2+胁
迫下, H2O2快速产生, 同时三类酶活性显著升高;
用脯氨酸预处理抑制了正常细胞质膜NADPH氧化
酶和细胞壁共价结合过氧化物酶活性; 在Cd2+胁迫
下, 脯氨酸预处理的细胞质膜NADPH氧化酶和细
胞壁过氧化物酶活性上升, 但显著低于未预处理
的细胞(图8、9)。
这些结果表明, 脯氨酸预处理抑制了Cd2+胁迫
诱导的烟草细胞H2O2的产生, 其机制可能不仅脯
氨酸能清除活性氧, 同时还与H2O2产生相关的酶
活性的降低有关, 但是这些酶活性的降低是由于
脯氨酸作为信号分子引起的还是有其他原因则有
待进一步研究。
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