全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 6 期，2009 年 6 月 591
收稿 2009-03-02 修定 　2009-05-06
资助 国家 “863” 计划(2007AA10Z418)和国家自然科学基金
(3 0 7 00 4 9 9 )。
* 通讯作者(E-mail: yylltt@sjtu.edu.cn; Tel: 021-34204869)。
实时荧光定量 PCR 技术及其在植物转基因产品检测中的应用
王荣谈 1, 刘冬儿 2, 厉建萌 3, 张大兵 2, 杨立桃 2,*
1 上海瑞丰农业科技有限公司, 上海 201106; 2 上海交通大学生命科学技术学院, 上海 200240; 3 农业部科技发展中心, 北京
100026
Quantitative Real-Time Fluorescence PCR Technology and Its Application in
Genetically Modified Organisms Detection
WANG Rong-Tan1, LIU Dong-Er2, LI Jian-Meng3, ZHANG Da-Bing2, YANG Li-Tao2,*
1Shanghai Ruifeng Agricultural Technical Company, Shanghai 201106, China; 2School of Life Science and Biotechnology, Shanghai
Jiao Tong University, Shanghai 200240, China; 3Development Center for Science and Technology, Ministry of Agriculture, Beijing
100026, China
提要: 实时荧光定量PCR技术因其实时、快速、高效和准确定量的优点, 已经广泛用于转基因产品定量检测。本文介绍荧
光定量探针技术的原理、特点及其在植物转基因产品检测中的应用情况。
关键词: 实时定量PCR; 荧光探针; 转基因生物
随着全球转基因产品阈值标识制度的实施, 转
基因产品的定量检测技术日益重要, 越来越多的检
测技术用于转基因产品品的定量检测。如实时荧
光定量 PCR、ELISA 和传感器技术等, 特别是定
量 PCR技术已经成为转基因产品定量的核心技术
而广泛使用(Michelini 等 2008; Elenis等 2008)。但
是, 由于荧光信号发生原理很多, 实时荧光定量PCR
方法多种多样。本文主要根据荧光信号发生原理
的差异, 介绍了已有的实时荧光定量PCR方法及其
在植物转基因产品检测中的应用, 并对其在定量检
测时的特异性、灵敏度、成本等优缺点等作了比
较。
1 荧光染料技术
根据染料与双链 DNA 分子的结合能力, 荧光
染料可分为非饱和性荧光染料和饱和性荧光染料两
类。染料型探针产生的荧光属于可逆荧光。
1.1 非饱和性荧光染料 最早应用于实时荧光定量
PCR的染料为溴化乙啶, SYBR Green I荧光染料出
现后, 因为毒性小、灵敏度高(为溴化乙啶的10~25
倍)和荧光信号强的优势很快代替了溴化乙啶, 成为
应用十分广泛的双链 DNA 插入染料(Zipper 等
2004)。SYBR Green I 可以与双链 DNA 的小沟结
合, 而不与单链 DNA 结合, 结合后在约 488 nm和
254 nm激发光的激发下, 发射出大约 560 nm的荧
光, 信号增强 800~1 000 倍(Querci 等 2006)。随着
PCR 循环的进行, 染料结合到新合成的 DNA 分子
上, 使其荧光信号与 PCR 产物同步增加, 通过实时
监测反应过程中的荧光信号就可以测定 PCR产物
的增加量, 从而定量测定起始模板 DNA 量。在
PCR 反应结束后该染料还可用于融解曲线分析。
每一个特定的 DNA 分子都有其特定的熔链温度
(Tm), 当 DNA 分子解链时, SYBR Green I 染料从
DNA分子中释放出来, 荧光信号显著降低, 出现特
异的熔链峰, 根据其对应的Tm值就可以判断DNA
产物的特异性(Elenitoba-Johnson 等 2001)。
SYBR Green I 的最大优势在于其低成本和高
度的通用性, 几乎可以用于任何型号的定量PCR仪
和任何目标DNA序列的扩增。然而它的局限性也
很明显, 其非特异性双链DNA结合模式决定了它不
能用于特定目标 DNA 序列的分析, 不能用于复合
PCR, 其信号容易受引物二聚体的干扰(Bus tin
2005)。由于 SYBR Green I 的低成本和良好的适
用性, 现已成为转基因定量检测中的常用的荧光染
料之一, 特别是在对定量准确性和灵敏度要求不高
技术与方法 Techniques and Methods
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检测和高通量的检测以及复合 PCR产物的溶解曲
线分析中应用得十分广泛(Levin 2005)。2003 年
Hernández等用SYBR Green I定量检测转基因玉米
Maximizer 176、Bt11、MON810、GA21 和转基
因大豆GTS 40-3-2, 并利用融解曲线分析多重PCR
的产物特异性, 检测各种转基因事件的灵敏度都达
到 0.1% (Hernández 等 2003)。
1.2 饱和性荧光染料 饱和性的荧光染料技术的原
理与非饱和的荧光染料相同, 具备 SYBR Green I
的一般优势和缺点。相比之下, 饱和性荧光染料的
优点在于其有更高的定量准确性和较高的分辨率。
在定量PCR反应体系中染料浓度一般很低, 较高浓
度会抑制 PCR 反应。饱和性染料与双链 DNA 分
子结合的饱和度比非饱和性染料的小, 在低浓度下
就可以与 DNA饱和性结合, 因此其对 PCR反应的
抑制性比非饱和性染料小, 同时对 PCR 产物的Tm
值影响较小, 更适合于融解曲线分析, 很好地弥补
了非饱和性染料的这一缺点。Monis等(2005)比较
饱和性染料SYTO9与SYBR Green I在实时荧光定
量 PCR 和融解曲线分析时的特性中, 以 0.5~33
μmol·L-1的SYTO9与SYBR Green I用于Legionella
的 16S rDNA、hlyA和 mip基因的 real-time PCR扩
增, 发现高浓度的 SYBR Green I 会使 16S rDNA的
Tm增加10 ℃以上, 以致复合PCR产物的熔链峰变
形, 难以区分各个产物, 而高浓度的SYTO9只能使
16S rDNA的Tm增加2 ℃, 同时对熔链峰的影响较
小。
用于转基因检测的饱和性荧光染料主要有Eva
Green、LC Green和 SYTO9 等。这些染料对 PCR
的抑制性较低, 可以使用较高的反应浓度, 对融解
曲线分析影响较小, 适用高分辨 DNA 融解分析
(HRM)。转基因检测通常需要使用复合定量 PCR
同时分析多个目标序列, 为了检验扩增的特异性, 对
其产物进行融解曲线分析就十分必要, 然而在扩增
的目标序列大小相近时, 饱和性的染料在其融解曲
线分析中有极大的优势。现在荧光染料法已经是
转基因作物的实时定量 PCR检测中应用得十分广
泛的技术, 不仅可以用来定量测定未知样品中转基
因成分的百分含量, 还可以在融解曲线分析中区分
等位基因变异等(Gibson 2006)。
2 荧光探针技术
荧光探针是用特定荧光基团标记的, 可以与特
异DNA序列结合的寡聚核苷酸, 只有在与其杂交的
序列发生 PCR 扩增时, 其荧光信号才会发生变化,
因此可以很好的指示目标序列的扩增。荧光探针
根据其发光原理可以分为序列特异性探针和引物特
异性探针两类(Gibson 2006)。
2.1 靶序列特异性探针 序列特异型探针是添加到
PCR 反应体系中的引物以外的一段寡聚核苷酸序
列, 根据其工作原理可分为水解型探针和杂交型探
针。水解型探针利用 Taq DNA 聚合酶 5 → 3 端
外切酶活性, 将探针酶切水解而促使其标记基团分
离而释放荧光, 其荧光信号不可逆, 不能进行融解
曲线分析, 如 TaqMan、锚定核苷酸探针(LNA)、
Allglo探针; 杂交型探针是通过与目标序列杂交而使
其标记基团分离而释放荧光, 其自身不被降解, 其
荧光信号是可逆的, 可以进行融解曲线分析, 如荧
光能量共振转移探针(FRET)、分子信标(MB)。各
种不同的靶序列特异性探针的优缺点比较见表 1。
2.1.1 TaqMan 探针 TaqMan 探针一般是长度为
表 1 序列特异性探针的比较
特征 TaqMan TaqMan MGB LNA Allglo FRET MB
特异性 +++ ++++ +++++ +++++ ++++ +++
灵敏度 +++ ++++ ++++ +++++ +++ +++
多重反应 +++ ++++ ++++ ++++ + +++
融解曲线分析 - - - - ++ ++
成本 ++ ++++ ++++ ++ +++ ++
　　“ + ” 表示肯定, “ + ” 越多表示等级程度越高。“- ” 表示否定。下表同此。
20~30 个碱基的寡聚核苷酸, 其退火温度一般比引
物的高 10 ℃, 其 5 端含有一个报告基团, 在 3 端
含有一个淬灭基团(Holland等 1991)。当探针完整
时, 报告基团受 Forster 型能量转移的抑制不发荧
光。当目标序列存在时, 该探针杂交到 2条引物结
合位点之间的区域, 在 PCR 的延伸阶段通过 Taq
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DNA聚合酶的 5→ 3外切酶活性在探针的报告基
团和淬灭基团之间降解该探针, 促使报告基团与淬
灭基团分离而释放荧光(Holland等1991), 产生的荧
光属于积累荧光。该探针设计简单、应用方便、
体系优化比较容易、成本相对较低, 而且可连接多
种荧光基团, 用于多个目标序列的检测。常用的报
告基团有 FAM、TET、VIC、HEX、JOE、ROX
等。这些优点为TaqMan探针应用于复合定量PCR
提供了良好的基本条件。该技术以其良好的特异
性、稳定性和灵敏度成为目前在转基因检测中应
用得最广泛、最成熟的实时定量 PCR 荧光探针技
术。该技术的缺点就是荧光基团和淬灭基团标记
在探针的两端, 相隔较远, 常存在荧光淬灭不彻底
的情况, 减小探针的长度可以解决该问题但同时又
降低了探针的特异性和稳定性(Levin 2005)。
在 TaqMan 探针基础上进一步发展出了一种
TaqMan MGB 探针, 该探针是在 TaqMan探针的 3
端连接上小沟结合物(Querci 等 2006)。MGB 是一
个小的新月形分子, 可以与双螺旋 DNA 的小沟结
合。当 TaqMan 探针与目标序列杂交时, MGB 稳
定地退火掺入到在探针和目标序列之间形成的
DNA双螺旋小沟内, 增强探针与目标序列的结合和
识别能力(Kutyavin等 2000), 该探针产生的荧光属
于积累荧光。相比TaqMan探针, TaqMan MGB探
针提高了探针的Tm值, 因此可以设计得更短(一般
13~20个碱基), 这样荧光基团与淬灭基团靠得更近,
淬灭更加彻底, 可降低本底荧光信号, 另外 3 端引
入非荧光的淬灭基团, 可大大提高信噪比。这些优
点使得 TaqMan MGB 探针在定量 PCR 中, 特别是
多重 PCR 中, 有更好的准确性、稳定性、特异性
和灵敏度。La Paz 等(2007)以转基因玉米 Mon810
事件特异性分析为模型, 比较了 SYBR Green I、
TaqMan和TaqMan MGB等荧光技术的适用性, 发
现三者都具备良好的稳定性和灵敏度, 可以准确测
定 0.1% Mon810, 另外 TaMan 和 TaqMan MGB 的
PCR 扩增效率(E)达到 90% 以上, 测定的相对标准
偏差(RSD)低于1.5%, 而且很容易适应快速循环模
式, 明显优于 SYBR Green I, 这些说明了二者在转
基因检测中的良好的适用性。
2.1.2 锚定核苷酸探针(locked nucleic acid, LNA)
锚定核苷酸探针的工作原理与TaqMan探针相同,
其独特之处在于其探针中包含一种核酸类似物, 即
锚定核苷酸, 其呋喃核糖环中形成 2- 氧 -4碳亚甲
基连接, 这个连接将其呋喃核糖环结构锁定成一个
刚性的双环模式。当其与目标序列结合时, 可以降
低核糖结构的柔韧性, 增强杂交稳定性和特异性, 提
高探针的 Tm 值, 该探针产生的荧光属于积累荧
光。一般每增加 1 个 LNA 分子可将探针的 Tm值
提高 8 ℃, 探针可以设计得更短, 具备更高的信噪
比、灵敏度和准确性(Costa 等 2004)。Salvi 等
(2008)设计了一个长为 8 bp 的 LNA 探针, 并用该
探针和TaqMan探针检测转基因玉米Mon810, 发现
LNA探针的检测下限(LOD)可以达到5个拷贝的模
板 DNA, 相对检测下限达到 0.0125%, 远低于欧盟
0.9%的标识阈值, 而且可以准确定量到 26 pg的转
基因玉米DNA, 显示其有良好的灵敏度和准确性。
2.1.3 Allglo 探针 Allglo 探针结构和工作原理与
TaqMan探针相似, 它具备TaqMan、TaqMan MGB
和MB的所有优点, 其独特之处在于其特殊的荧光
标记染料。该探针的荧光基团可以互为报告基团
和淬灭基团, 可以标记在探针的两端也可以标记在
探针的中间, 还可以标记 2 个以上的荧光基团, 未
杂交时其几乎没有背景荧光。其染料上含有可以
提高探针 Tm值的化学基团, 极大提高了杂交的特
异性和稳定性。杂交后其探针水解, 所有荧光基团
都成为荧光报告基团, 荧光信号大大提高, 信噪比
高于 TaqMan 和 MGB 很多(http://www.allelogic.
com), 而该探针的合成成本只有 MGB 的一半, 该
探针产生的荧光属于积累荧光。现在有多种荧光
染料可以用于 Allglo 探针, 如 MAR、JUP、SAT、
URA、NEP 等, 它们的激发波长和发射波长与
TaqMan 探针的常用染料的波长相似, 所以该探针
的使用不需要特殊仪器设备, 而且可以用于多重定
量 PCR。Allglo 探针具备极高的灵敏度, 不仅在基
因定量中具备极大的优势而且可以用于SNP分型。
2.1.4 荧光能量共振转移探针(fluorescence reso-
nance energy transfer, FRET) 该技术是在 PCR
反应体系中加入 2条探针, 在其中一条探针的 3端
标记荧光供体基团, 另一条探针的5端标记荧光受
体基团, 当2条探针结合到目标序列的相邻区域, 促
使荧光供体基团和荧光受体基团靠近, 荧光供体基
团受蓝光的激发其能量转移给受体基团, 后者就会
发射出荧光信号(Haugland 2002; Querci 等 2006)。
在PCR反应中, 这2条探针不断结合到合成的产物
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上, 从而积累荧光信号, 指示 PCR 产物的积累。该
技术使用的探针是成对的, 二者必须杂交到同一目
标序列的相邻区域(通常相距 1~5 个核苷酸), 而且
供体的发射光谱必须以受体的吸收光谱交错重叠
(Levin 2005)。FRET 探针由于采用的是 2 条探针,
故其特异性高, 同时该探针由于其需要设计2条探
针, 探针的末端要封闭以避免引发延伸反应, 所以
成本很高, 设计不太方便。另外该探针的背景荧光
比较强, 信噪比比较低, 也因此影响了它的灵敏度,
该探针产生的荧光属于实时荧光。该探针技术是
比较早期的技术, 主要用于基因定量, 现在应用的
比较少, 已逐渐为 Taq Man 等技术所代替。
2.1.5 分子信标(molecular beacons, MB) 分子信标
是一种自身可以形成茎环结构的DNA探针, 探针的
两端分别标记上荧光报告基团和淬灭基团。当探
针未与目标序列杂交时, 其茎环结构可促使2个基
团相互靠近, 荧光基团释放的所有光子被淬灭基团
吸收。杂交后茎环结构展开, 2 个基团就会分开,
报告基团发射出荧光(Tyagi 和 Kramer 1996), 该探
针产生的荧光属于积累荧光。该技术的特点就是
只需要一条探针, 比 FRET 探针的成本低, 但是其
缺点就是探针杂交时只有其环状部分与目标序列配
对结合, 因此稳定性比较差, 其茎环结构也容易受
其他因素的影响导致假阳性的出现(Levin 2005)。
另外应用于该探针的荧光基团比较少, 标记有一定
的困难, 背景信号比较强。分子信标已经是转基因
检测中的常用技术, 可用于区分等位基因, 定量转
基因百分含量等(Tyagi 1998)。Andersen 等(2006)
比较了 MB、SYBR Green I、TaqMan 和 TaqMan
MGB 在转基因大豆 RRS 的定量检测中的适用性,
发现四者都具备良好的适用性, 但MB的PCR反应
效率最低, 而且对PCR循环条件和反应体系的变化
特别敏感, 从而显示了其有一定的不稳定性。然而
正是由于MB的这些特点, Lin等(2008)利用了Hg2+-
DNA复合体诱导MB构型变化的特点, 研制了一种
通用分子信标, 用以检测SNPs, 这对分析转基因作
物的内源基因多态性和外源T-DNA插入后引起的
突变等有参考价值。
2.2 引物特异性探针技术 引物型探针就是以荧光
基团标记的引物, 在PCR反应中它既充当引物引发
DNA链的延伸, 也充当探针, 可与目标DNA序列结
合, 以其结构或构型的变化而引起荧光信号的变
化。这种技术不需要引物以外的探针, 使得反应体
系的优化更简单。但引物探针只能靠引物来保证
其反应的特异性, 因此其特异性一般低于序列特异
性探针。这类探针可以根据引物和探针序列通用
和特异性进一步分为通用引物探针和特异性引物探
针两类。
2.2.1 特异性引物探针
2.2.1.1 Scorpions 探针 Scorpions探针是杂交探针
技术进一步发展的产物, 它由一个茎环结构和特异
性引物组成, 茎环的 5 端标记荧光报告基团, 3 端
标记淬灭基团并与引物的 5 端连接。茎环结构闭
合时荧光被淬灭, 当引物引发了延伸反应后, 茎环
结构就会展开并与同一条链上的互补的特异性目标
序列杂交, 发射荧光(Querci 等 2006), 该探针产生
的荧光属于积累荧光。Scorpions 技术不需要引物
以外的单独探针, 其杂交区域处于同一条 DNA 链
上, 荧光信号可以迅速产生, 反应迅速, 同时具备较
好的特异性。该技术中其引物由于携带茎环结构,
容易影响 PCR 反应的效率和稳定性(Thelwell 等
2000; Whitcombe 等 1999)。
2.2.1.2 LUX (light upon extension)荧光探针 LUX
技术在PCR中的一条引物的3末端标记荧光基团,
该引物内部含有互补序列, 自身可形成能淬灭荧光
的茎环结构。在 PCR 延伸阶段, 引物可以展开茎
环结构, 与目标序列结合释放荧光, 使荧光信号显
著增加(Nazarenko等 2002a), 该探针产生的荧光属
于积累荧光。通过实时监测荧光信号的变化就可
以检测样品中的目标DNA序列。该技术的优点显
而易见, 它可以省略额外的探针, 节约成本。虽然
它仅靠 2条引物来确保反应的特异性, 但其不会形
成引物二聚体, 仍然可以获得较好的特异性, 其特
异性介于 SYBR Green I 和 TaqMan 探针之间。由
于荧光基团是标记在引物上的, 所以其PCR产物都
带有荧光基团, 因此可以进行融解曲线分析, 检验
产物的特异性和污染情况。同时该技术还可以在
一个反应管中进行多重反应, 检测多个目标序列
(Nazarenko 等 2002b)。它的缺点就是引物设计比
较困难, 但现在有专门的软件 LUX® Designer 用于
设计此类引物。由于发夹结构的荧光淬灭能力有
限, 只能淬灭少数的荧光素的荧光信号, 目前可以
应用到该技术中的荧光素主要有 FAM、JOE 和
Alexa Fluor 546。
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2.2.1.3 Plexor 荧光探针 Plexor™ 技术利用了 2种
特殊的碱基: 异鸟嘌呤(iso-dG)和 5 甲基异胞嘧啶
(iso-dC), 二者可以形成独特的相互配对, 而不与其
他任何碱基配对。在合成引物时, 将 iso-dC 掺入
到其中一条引物中, 并用荧光素标记5末端, 在PCR
反应中, 将标记有淬灭基团的 Dabcyl-iso-dGTP 加
入到反应体系中, 在扩增过程中只有iso-dGTP能够
被掺入到与iso-dC互补的位置, 并有效淬灭荧光基
团(Krenke 等 2005)。该技术的独特之处在于随着
反应的进行, 荧光信号是不断减小。该技术的极大
优点是具有很高的特异性, 可以有效的避免假阳性,
其PCR产物还可以用于融解曲线分析, 可以很好的
检验反应的特异性。同时引物的设计与一般的引
物设计一样简单, 不需要特殊的结构和构型(Krenke
等 2005; Sherrill 等 2004)。Buh Gasparic 等(2008)
以 LNA、LUX、Plexor 和 TaqMan 等技术检测转
基因玉米Mon810的内源特异性基因和外源基因5
端旁侧序列, 测定了它们在检测中的特异性和灵敏
度以及定量的动力学范围和重复性, 实验结果显示
LUX 技术的特异性和灵敏度比其他 3 种技术的灵
敏度低, LNA探针具备特异性比其他3种技术的特
异性高。Plexor技术在定量测定Mon810的含量时
的准确性不理想, 测定值与真实值的偏差大于30%
(Buh Gasparic 等 2008)。
2.2.2 通用引物探针
2.2.2.1 通用模板(universal template, UT)探针 荧
光染料技术具备通用性但没有序列特异性, 一般的
探针技术具备序列特异性但不具备通用性, 通用模
板探针则是一种兼具通用性和序列特异性的实时定
量 PCR荧光技术。该技术是在一条引物的 5端连
接一段约 20 bp 的通用模板序列, 该序列可以与荧
光探针特异性杂交, 其探针的结构与 TaqMan 相
同。当反应进行到第 3 个循环时另一条引物与新
合成的含有通用序列的 DNA 链退火, 引发延伸反
应, 利用 Taq DNA 聚合酶的 5 → 3 外切酶活性在
探针的报告基团和淬灭基团之间降解杂交在通用序
列上 UT 探针, 释放荧光, 该探针产生的荧光属于
积累荧光(Zhang等 2003)。该技术要求 UT探针的
Tm 值比引物的目标特异性部分高 5~10 ℃, 并不
与模板 DNA 任何区域杂交。同一 UT探针可以用
于多个目标序列的检测, 可以大大节约成本。该技
术是 Zhang 等(2003)开发的, 他们将这种探针技术
用于检测转基因玉米 Event 176, 内源和外源基因
标准曲线可以检测到 0.01~100 ng的DNA, 线性相
关系数R2 达到 0.99以上。同时用不同的染料标记
UT探针, 进行复合定量PCR定量检测Event 176的
内源基因 Invertase 1 和外源基因 CryIA (b)可以检
测到10 pg的玉米基因组DNA, 显示了良好的特异
性、重复性和灵敏度。
2.2.2.2 Antiprimer 探针 Li等(2006)在 UT探针的
基础上发展了一种新的通用模板探针 Antiprimer。
该技术是将一条引物的 5 末端连接一段标记有荧
光报告基团的通用序列, 当该引物未参与PCR反应
时, 标记有荧光淬灭基团的 Antiprimer 可以与该引
物的通用序列结合从而淬灭荧光, 该探针产生的荧
光属于积累荧光。当引物参与了 PCR 反应, 由于
Antiprimer 的 Tm 值比引物的特异性部分低 5~10
℃, 引物的通用序列会结合到新合成的PCR产物中
而不能与Antiprimer结合, 这样合成的PCR产物就
可以发射荧光信号。该技术原理简单, 操作方便,
其引物和探针不需要任何特殊的设计, 荧光探针序
列具备通用性, 可以用于任何目标序列的检测, 显
然可以大大降低成本。相比于 UT 探针, 其通用模
板序列可以设计得很短, 荧光报告基团和淬灭基团
连接在 2 条序列上, 彼此可以靠得很近, 荧光淬灭
彻底, 本底荧光信号低, 信噪比大大提高。
2.2.2.3 AUDP (attached universal duplex probes)
AUDP是在UT探针和Antiprimer探针的基础上发
展而来的技术, 该技术采用了 2 种通用探针: 荧光
探针(FP)和淬灭探针(QP), 这 2 个探针序列不具备
特异性, 不与待扩增的目标序列结合, 但二者可以
相互结合而淬灭荧光信号。探针设计时, UT 序列
的 Tm 值大约比 UT 引物中的特异性引物部分高
5~10 ℃。UT 序列与靶序列特异性引物之间可以
认为加上一段 Linker, Linker 序列的选择与引物中
GC的含量及Tm值有关, 作用时是调节引物的GC
含量, 并且保证 2条引物的 Tm值相近。在 PCR反
应中, 将一条引物的 5 末端连接一段可与 FP 互补
配对的通用序列, 反应进行到第 3 轮时, FP 可以与
含有通用序列的模板结合, 充当引物引发延伸反
应。当反应进行到第 4轮时, 在另一条引物引发的
延伸反应中, 与 FP结合的QP在链置换作用和Taq
DNA 聚合酶的外切活性下被置换和水解, 从而使
FP 发生出荧光信号。该技术的优点在于其荧光信
植物生理学通讯 第 45 卷 第 6 期，2009 年 6 月596
号强, QP 可以链置换和 Taq DNA聚合酶的 5 → 3
外切酶活性双重作用下与 FP 分离, 迅速稳定的产
生高强度的荧光信号(Yang等2008), 该探针产生的
荧光属于积累荧光。该技术具备UT探针的所有优
点, 其成本大约是现在一般探针合成成本的一半, 其
荧光信号强度高而且稳定。其缺点是需要合成 2
条引物, 原理复杂, 操作不太方便, 而且荧光信号产
生比较晚, 反应缓慢。Yang 等(2008)利用该技术
检测转基因大豆RRS和转基因玉米Bt176, 在双重
PCR 中对 RRS 的检测灵敏度达到了 10 pg, 同时可
以检测到1%的Bt176, 证明了该技术在转基因检测
中的良好适用性。
表 2 引物特异性探针的比较
特征 Scorpions LUX Plexor U T Antiprimer AUDP
特异性 ++ ++ +++ ++ ++ ++
灵敏度 ++ ++ +++ ++ ++ ++
设计难度 +++ ++++ + + + +
稳定性 ++ ++ ++++ +++ +++ +++
成本 ++ ++ ++ ++ ++ ++
　　
总之, 转基因作物研究飞速发展, 其安全性也
常引起广泛的争议, 为了控制其可能存在的危险, 国
际上普遍实行转基因标识制度。美国的转基因标
识阈值为 5%, 欧盟为 0.9%。标识制度的实施要求
人们准确, 稳定的检测样品中的转基因物质的百分
含量。Real-time PCR 技术为转基因的定量检测提
供了良好的技术手段。SYBR Green I 和 UT 探针
的应用可以明显降低成本 , 用于高通量检测 ;
TaqMan MGB和Allglo已经具备很高的特异性, 在
复合PCR中有了很好的应用; 最新的技术如LNA探
针、CPT 探针、Plexor 探针和 AUDP 等不断涌现
并应用到转基因的检测中。应用于转基因检测的
实时荧光定量 PCR的荧光技术正在不断更新和发
展, 向着更高的稳定性、灵敏度、高通量和低成
本的方向发展。
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