全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (1): 80~848 0
收稿 2010-10-11 修定 　2010-11-28
资助 国家自然科学基金项目(30740013)、河南省自然科学基
金项目(0611030600)、河南省重大科技专项(091100110100)
和洛阳市科技支撑计划项目(0901063A)。
* 通讯作者(E-mail: gashi1963@163.com; Tel: 0379-64283552)。
牡丹品种 ‘胡红 ’开花和衰老过程中花瓣脂肪酶活性的变化
史国安 1,*, 郭香凤 1, 高双成 1, 李昕 1, 李友军 1, 包满珠 2
1 河南科技大学农学院, 洛阳市牡丹生物学重点实验室, 河南洛阳 471003; 2 华中农业大学园艺林学学院, 园艺植物生物学教
育部重点实验室, 武汉 430070
摘要: 以牡丹品种‘胡红’为材料, 采用改良铜皂法测定了牡丹花发育过程中花瓣脂肪酶活性的变化。结果表明, 牡丹花瓣粗
脂肪酶作用的最适 pH为 6.5, 最适温度为 35 ℃。OP乳化剂提高酶活性 3.5倍, Mg2+对酶活性没有影响。露色期(I级)脂肪酶
活性和游离脂肪酸含量最高, 之后各时期酶活性逐渐下降并维持在低水平; 而游离脂肪酸含量在盛开期(V级)有一小高峰。
关键词: 牡丹; 开花和衰老; 花瓣; 脂肪酶活性
Change in Lipase Activity in Petal during Flowering and Flower Senescence of
Paeonia suffruticosa Andr. cv. ‘Huhong’
SHI Guo-An1,*, GUO Xiang-Feng1, GAO Shuang-Cheng1, LI Xin1, LI You-Jun1, BAO Man-Zhu2
1College of Agriculture, Luoyang Key Laboratory of Peony Biology, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003,
China; 2Key Laboratory of Horticultural Plant Biology, Ministry of Education, College of Horticultural and Forestry Science,
Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China
Abstract: Using peony (Paeonia suffruticosa) cv. ‘Huhong’ as the experimental material, we investigated the
change in lipase activity of petal during flowering and flower senescence by the improved copper soap method.
The results indicated that the optimum pH value was 6.5 and that optimum temperature was 35 ℃ for lipase
activity. OP could increase the lipase activity by 3.5- fold, but Mg2+ had no effect. The peaks of lipase activity
and free fatty acid content occurred at bud color-occurring stage. The lipase activity kept at low level from bud
soft stage to wilting, peak of free fatty acid content occurred at full opening stage.
Key words: Paeonia suffruticosa; flowering and flower senescence; petal; lipase activity
脂肪酶(EC 3. 1. 1. 3)属胞内酶, 可催化酯类化
合物分解、合成和酯交换; 脂肪酶具有化学选择性
和高度立体异构专一性, 在食品、药品、化工等
行业得到广泛应用(Patel 2006)。关于植物脂肪酶
的研究, 无论是在植物生理方面, 还是植物保藏方
面都具有很重要的意义(夏小乐等 2008)。
脂肪酶广泛存在于各种植物体内, 在脂肪酶的
作用下甘油酯水解产生游离脂肪酸和甘油。植物
离体的叶、果实和种子仍含有较高的脂肪酶活力,
而且脂肪酶的活性直接影响植物的生长发育过程
(李丙东等1993)。Brown等(1991)和Hong等(2000)
认为, 膜结构的破坏是植物衰老的一个早期典型特
征。在酯酰水解酶作用下, 从膜脂双分子层上释放
出游离脂肪酸, 被乙醛酸循环的酶代谢, 能够诱导
衰老过程的启动。Borochov 等(1982)研究月季花
衰老时发现, 衰老启动时酯酰水解酶活性的升高伴
随着膜功能的丧失。但国内对植物花瓣中脂肪酶
的研究很少。
史国安等(1999; 2008; 2009)指出, 活性氧代谢
失衡是牡丹花衰败迅速的重要原因, 其中超氧自由
基起着主要作用。王荣花等(2005)研究结果表明,
牡丹开花与衰老过程中花瓣不饱和脂肪酸含量降
低, 不饱和指数下降, 膜脂过氧化加剧导致细胞膜
透性增加。这些结果揭示脂质代谢在牡丹开花和
衰老过程中可能起着重要作用。本文研究了牡丹
花瓣中脂肪酶的某些性质与活性变化, 以期为阐明
牡丹开花和衰老的生理基础以及切花保鲜技术提供
理论依据。
史国安等: 牡丹品种 ‘ 胡红 ’ 开花和衰老过程中花瓣脂肪酶活性的变化 8 1
材料与方法
供试材料为牡丹品种 ‘ 胡红 ’ (Paeonia suffru-
ticosa Andr. cv. ‘Huhong’) 采自洛阳市新华丰牡丹
园。在 ‘ 胡红 ’ 花立蕾后, 选择生长状况一致的花
蕾做标记留做样品。于晴天上午 8:00 左右, 按史
国安等(2008; 2009)的标准, 从同一花圃6年株龄的
牡丹上采摘不同发育状态的花朵, 分别是露色期(I
级)、绽口期(II 级)、初放期(III 级)、半开期(IV
级)、盛开期(V 级)和始衰期(VI 级)。采集样品放
入聚乙烯保鲜袋内保湿立即带回实验室, 拨去外层
花瓣后取内层花瓣置于-35 ℃低温冰箱备用。
试验所用设备仪器如下: 赛多利斯 BS-200S型
分析天平(北京塞多利斯天平有限公司); pHS-3型数
显酸度计(江苏金坛市荣华仪器制造有限公司) ;
JY92-II超声波细胞粉碎机(上海新芝生物技术研究
所); Sigma 3K18台式高速冷冻离心机; UV-755B紫
外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。
试验所用试剂均为化学纯或分析纯试剂。
取 3.0 g冷冻保存的牡丹花瓣, 加8 mL样品提
取液(含 1% 巯基乙醇, 65 mmol·L-1 PBS, pH 6.5)冰
浴中研磨至匀浆, 于 4 ℃下 10 000×g 离心 30 min,
将上清液再于12 500×g离心30 min, 上清液为粗酶
提取液, 置于 4 ℃冰箱备用。
参照高贵等(2002)和张弛等(2003)的方法进行
乳化底物的制备。取150 mL 4%聚乙烯醇(polyvin-
ylalcohol, PVA)和50 mL橄榄油, 冰浴超声波乳化5
min, 反复 2 次, 制成乳白色的橄榄油乳化底物, 置
于 4℃的冰箱中保存备用。
称取 5 g乙酸铜, 溶解于 100 mL蒸馏水中, 过
滤, 用吡啶将滤液的pH值调至6.1, 得到铜显色剂。
对江慧芳等(2007)采用的铜皂法进行改进。
将 1 mL底物乳化液与 3 mL PBS混合后在 37 ℃下
预热后, 加入1 mL粗酶液, 37 ℃反应1 h, 加入5 mL
甲苯终止反应, 振荡萃取生成的游离脂肪酸, 于
3 000×g 离心 5 min, 取 3 mL上层有机相加入 1 mL
显色剂反复振荡, 使产生的脂肪酸与Cu2+结合充分,
再次离心后取上层含有脂肪酸铜的甲苯溶液在715
nm 处测定吸光值。以未反应的做空白。用改良
铜皂法分别研究反应时间、底物浓度、酶液用
量、温度、pH 值以及乳化剂聚乙二醇辛基苯基
醚(polyglycol octylphenyl ether, OP)和 Mg2+ 对脂肪
酶活性的影响。
取1 mL粗酶提取液, 加入5 mL甲苯振荡萃取
游离脂肪酸, 用油酸做标准曲线, 按铜皂法测定测
定花瓣中游离脂肪酸含量。可溶性蛋白质含量用
紫外分光光度法测定。
实验测定重复 3~4 次, 采用 Excel 数据处理系
统对数据进行统计分析。
实验结果
1 牡丹花瓣中粗脂肪酶的部分酶学性质
1.1 脂肪酶与底物生成产物的吸收光谱图
为了找出油酸铜的最大吸收波峰, 测定了油酸
铜在 550~750 nm 范围内的吸光值。由图 1 可知,
反应体系在可见波长715 nm处有最大吸收峰(A715),
可用于检测脂肪酶的活性。因此以下实验均在
715 nm 波长下比色测定脂肪酶的活性。
图 1 油酸铜的吸收光谱
Fig.1 Absorption spectrum of copper oleate
1.2 酶促反应时间进程
在 35 ℃、pH 6.5 反应条件下测定不同反应
时间对应的脂酶活性。图 2显示, 粗酶活性随着反
应时间的延长而增大, 即反应产物脂肪酸含量的增
加。根据粗酶的反应进程曲线, 60 min 以前酶活
性随时间变化很快, 近似为线性关系, 60 min 后酶
活性变化趋于平稳。因此, 在以后的酶活性测定过
程中, 反应时间均控制在 60 min 以内, 以便测定脂
肪酶的初速度。
1.3 酶液用量对粗脂肪酶活性的影响
在脂肪酶促反应体系中, 设定底物浓度的条件
下, 酶活性取决于酶液的用量。0~1.0 mL 的粗酶
植物生理学报8 2
液用量范围内, 脂肪酶活性变化呈一级反应关系, 超
过 1.0 mL 后酶活性趋于饱和。
1.4 温度对粗脂肪酶活性的影响
图 4 所示, 牡丹花瓣脂肪酶在 35 ℃时活性最
高, 为脂肪酶的最适温度, 高于或低于35 ℃时酶活
性急剧下降, 15 ℃时仅有 60% 的酶活性。15 ℃
至 35 ℃时, 温度对牡丹花瓣脂肪酶酶促反应的加
速起主导作用; 但温度继续升高时, 高温对酶蛋白
的破坏起主导作用, 脂肪酶的活性呈下降趋势, 至
温度更高时脂肪酶失活。
1.5 pH值对脂肪酶活性的影响
由图5可知, 牡丹花瓣脂肪酶对pH变化非常敏
感。在一定反应体系 pH 值范围内, 随着反应体系
pH值的升高, ‘胡红 ’花瓣脂肪酶比活也逐渐提高。
但当反应体系pH值达到6.5时, 脂肪酶比活就不再
图 2 反应时间对脂肪酶活性的影响
Fig.2 Effect of reactive time on lipase activity
图 3 酶液用量对脂肪酶活性测定的影响
Fig.3 Effect of enzyme extract volume on lipase activity
determination
提高。由于脂肪酶除在 pH 6.5 附近有一活性高峰
外, 在 pH 7.5附近还有一活性肩峰, 因此推断在 ‘胡
红’花瓣中脂肪酶可能有两种同工酶类型, 即酸性脂
肪酶和碱性脂肪酶。
1.6 乳化剂OP和Mg2+对脂肪酶活性的影响
随着反应体系中乳化剂OP的含量增高, 花瓣
脂肪酶比活也逐渐提高。但当反应体系中乳化剂
OP的含量达到0.25%时, 脂肪酶活性出现峰值, 比
对照提高 3.5 倍(图 6)。表明乳化剂 OP 能够显著
促进酶与反应底物的接触, 从而提高脂肪酶活性。
反应体系中加入Mg2+, 结果表明Mg2+对脂肪酶的活
性没有显著影响。
2 牡丹花瓣中脂肪酶活性和游离脂肪酸含量的变
化
图 7所示, ‘胡红 ’花瓣脂肪酶活性在露色期(I
级)处于最高值, 从绽口期(II 级)到始衰期(VI 级)酶
图 4 牡丹花瓣脂肪酶催化反应的最适温度
Fig.4 The optimum temperature of lipase in peony petals
图 5 牡丹花瓣脂肪酶催化反应的最适 pH
Fig.5 The optimum pH of lipase in peony petals
史国安等: 牡丹品种 ‘ 胡红 ’ 开花和衰老过程中花瓣脂肪酶活性的变化 8 3
活性持续下降, 始衰期脂肪酶比活仅为露色期的
40% 左右。这是因为 ‘胡红 ’花瓣在其整个开放期
间呼吸代谢十分旺盛, 要消耗大量的能量, 在露色
期(I级)启用其体内储存物质 -脂肪, 将脂肪分解为
脂肪酸, 同时启动脂肪酶激活机制, 提高脂肪酶的
活性, 在露色期(I级)较短时间内就能分解大量的脂
肪, 为其整个开花期间所需能量做准备。盛开期(V
级)呼吸高峰过后, 游离脂肪酸含量出现小幅回升,
始衰期(VI级)随着花瓣细胞膜系统的解体游离脂肪
酸含量降到最低。说明膜脂肪代谢与开花期间的
能量需求有关。
讨　　论
1 牡丹花瓣中粗脂肪酶的部分酶学性质
脂肪酶是一种蛋白质, 不适宜的温度会破坏活
图 6 乳化剂 OP 对脂肪酶活性的影响
Fig.6 Effect of OP on lipase activity in peony petals
性部位三维结构的完整性, 而活性部位三维结构是
保持酶活性的关键(王璋 1996)。牡丹花瓣中脂肪
酶的最适温度为35 ℃左右, 温度超过35 ℃脂肪酶
活性迅速下降。牡丹花瓣中脂肪酶的最适脂酶 pH
6.5, 在 pH 7.5有一肩峰, 推测牡丹花瓣脂肪酶有两
种同工酶类型, 即pH 6.5酸性脂肪酶和pH 7.5碱性
脂肪酶。由于脂肪酶具有明显的界面活性, 作用在
反应体系的亲水 - 疏水界面层, 作用位点是脂肪分
子的 1 (或3)位酯键, 乳化剂OP能够显著提高脂肪
酶活性。Mg2+ 对牡丹花瓣中的脂肪酶没有明显的
激活作用。
2 牡丹开花和衰老过程中脂肪酶的作用
‘胡红’属于呼吸跃变型花卉, 在半开期(IV级)
到盛开期(V级)出现呼吸高峰(史国安等 2011)。在
牡丹开花和衰老的过程中需要消耗大量的呼吸底
物, 产生足够的能量推动开花过程, 特别是花瓣的
扩张生长; 花朵开放后, 花瓣细胞膜降解功能下降,
加速细胞内含物发生外撤与再分配。而膜脂降解
可能是花瓣细胞死亡程序的中心步骤(van Doorn和
Woltering 2008)。我们的试验结果表明, 牡丹开花
和衰老过程中超氧阴离子是引起膜脂过氧化的主要
活性氧(史国安等 2008)。推测在牡丹开花和衰老
过程中, 初期高活性的脂肪酶促进膜磷脂降解, 产
生游离脂肪酸, 部分脂肪酸通过三羧酸途径生成糖
为呼吸代谢提供底物, 另一部分脂肪酸在脂氧合酶
参与下启动膜脂过氧化作用, 促使芳香物质的生产
与细胞膜的降解。因此, 脂肪酶活性升高是牡丹
开花和衰老的早期事件, 在活性氧信号传递体系中
的重要作用值得进一步研究。
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图 7 牡丹开花和衰老过程中花瓣游离脂肪酸含量
和脂肪酶活性的变化
Fig.7 Changes of free fatty acids content and lipase activity
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植物生理学报8 4
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