全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 3期，2009年 3月 239
收稿 2008-11-13 修定 　2009-02-10
资助 高等学校国家 “98 5 工程 ” 科技创新平台项目(20005)。
* 通讯作者(E-mail: sw_xml@hnu.cn; Tel: 0731-8821721)。
特矮稻ED基因的遗传定位和分析
梅进 1, 杨远柱 2, 林建中 1, 胡小淳 2, 周波 1, 赵小英 1, 符辰建 2, 黄星群 1, 唐冬英 1, 刘选明 1,*
1湖南大学生命科学与技术研究院, 生物能源与材料研究中心, 长沙 410082; 2湖南亚华种业科学研究院, 长沙 410119
提要: 赤霉素(GA3)鉴定表明, 一种新型特矮稻(命名为 ‘特矮稻 -2’)的GA3信号转导途径正常, 施加外源GA3不能恢复到正
常植株的高度, 说明此种矮稻的矮化机制与GA3无关。来源于组合 ‘特矮稻 -2’ב日本晴 ’的 F2群体的遗传分析表明, ‘特
矮稻 -2’的特矮性状受 1对隐性基因控制。采用SSR分子标记, 将该矮秆基因定位于第12染色体上的RM519和RM235标
记之间, 遗传距离分别为 15.9和 22.0 cM, 该基因暂命名为ED。
关键词: 水稻; GA3鉴定; 矮秆基因; 遗传分析; 基因定位
Characterization and Genetic Mapping of ED from a Novel Dwarfing Rice
(Oryza sativa L.)
MEI Jin1, YANG Yuan-Zhu2, LIN Jian-Zhong1, HU Xiao-Chun2, ZHOU Bo1, ZHAO Xiao-Ying1, FU Chen-Jian2, HUANG Xing-
Qun1, TANG Dong-Ying1, LIU Xuan-Ming1,*
1Bioenergy and Biomaterial Research Center, Institute of Bioscience and Biotechnology, Hunan University, Changsha 410082,
China; 2Academy of Seed Industry of Hunan Yahua, Changsha 410119, China
Abstract: We investigated gibberellin (GA3) signaling in a novel dwarfing rice (Oryza sativa) ‘Teaidao-2’, the
results showed that exogenous GA3 could not rescue the dwarfing phenotype of ‘Teaidao-2’. So GA3 was not
involved in the dwarfing phenotype. The dwarfing gene was referred to as ED, a F2 population derived from
cross between ‘Teaidao-2’ and ‘Nipponbare’ was constructed for mapping of the ED locus. The dwarfing
phenotype of ‘Teaidao-2’ was regulated by a single recessive gene. Simple sequence repeat (SSR) marker
analyses revealed that ED was located between RM519 and RM235 with the genetic distance of 15.9 and 22.0
cM on chromosome 12.
Key words: rice (Oryza sativa); GA3 identification; dwarfing gene; genetic analysis; gene mapping
矮秆或半矮秆作物品种不但能提高抗倒伏能
力, 而且不影响穗部的育性和结实率, 从而能提高
作物产量(Borlaug 1983)。但在籼稻矮化育种中所
采用的矮秆材料主要受一个相同或等位的隐性矮秆
主基因控制(顾铭洪和朱立宏1979), 同一矮秆基因
的利用潜伏着由遗传单一带来的风险。因此, 创
建、筛选新矮源以扩大水稻矮秆基因的遗传基础,
或者作为矮秆基因的储备是极为重要和必要的。
经典遗传学表明, 水稻株高既属于数量性状, 又表
现为质量性状遗传(Huang等 1996)。在籼稻中大
多数自然发生或人工诱变的矮秆突变体是由单隐性
基因控制的, 少数是由 2~3对隐性基因控制, 仅有
极少数的矮源受控于多基因(Peng等 1999)。本文
以一个特矮籼稻突变体为材料, 对其作了赤霉素
(gibberellin, GA3)鉴定和遗传分析, 并用简单重复序
列(simple sequence repeat, SSR)分子标记对特矮基
因进行连锁分析, 希望能找到新的矮源基因并进行
分子定位, 为水稻遗传育种和分子机制研究提供基
因资源。
材料与方法
以一种自然突变的特别矮化的籼稻(Oryza sa-
tiva L. var. indica)‘特矮稻 -2’为材料(其来源亲本
已无法确定), 以常规籼稻品种 ‘特青 ’为GA3处理
和高度调查的对照。以粳稻(Oryza sativa L. var.
japonica)品种 ‘日本晴 ’和籼稻品种 ‘9311’为 sd-1
位点鉴定时对照, ‘日本晴 ’还用于构建定位群体。
用 Primer 5.0软件设计鉴定 sd-1位点的引物。
正向引物序列: 5 GCGCCAATGGGGTAATTAAA-
ACG 3, 反向引物序列: 5 TTGAGCTGCTGTCC-
GCGAAG 3, 预计产物大小为 238 bp。用 CTAB
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法(Clark 1998)提取纯化 ‘特青 ’、‘特矮稻 -2’、‘日本
晴 ’和 ‘9311’的基因组DNA作为模板, 用鉴定 sd-1
位点的引物序列进行 PCR扩增鉴定。
参照Lanahan和Ho (1988)文中的方法, 将 ‘特
青 ’和 ‘特矮稻 -2’的种子剥壳, 用 3% NaClO浸泡
15 min, 用无菌水洗6次, 然后于超净工作台上将种
子横切, 将无胚的半粒种子接种于含 0.2%淀粉、
2%琼脂、10 mmol·L-1乙酸钠和 2 mmol·L-1 CaCl2,
pH 5.3的平板培养基上, 每皿接种 20粒。向培养
基中加入过滤灭菌GA3, 至其浓度为 1 µmol·L-1, 不
加GA3的作为对照。将接种好的培养基于30 ℃暗
培养 4 d, 后加入 I-KI指示剂显色鉴别。
参照Ueguchi-Tanaka等(2000)文中的方法, 并
略作修改, 将经过和未经过烯效唑(6.85 µmol·L-1)预
处理的 ‘特青 ’和 ‘特矮稻 -2’种子, 分别播种于含
有 0、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4
mol·L-1 GA3浓度梯度的平板培养基中, 每皿播种20
粒, 于30 ℃持续光照(25 µmol·m-2·s-1)下培育, 6 d后
测定第二叶鞘的长度。
以 ‘特青 ’和 ‘特矮稻 -2’各 20株为一组, 重复
8组分开种植于温室中, 在圆秆拔节期喷施浓度分
别为 0、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4
mol·L-1的GA3雾液, 成熟时测量植株高度。
配制 ‘特矮稻 -2’ב日本晴’的杂交组合, 分别
于成熟时调查F1和F2各单株的表型, 计算表型分离
比, 进行遗传分析。
在F2各单株表型鉴定完成后, 按Wei等(2006)
文中的方法进行 SSR分析。扩增产物用 3.0%的
琼脂糖凝胶电泳, 经溴化乙锭染色后在紫外灯下观
察拍照。用Mapmaker/EXP Version 3.0 (Lander等
1987)软件进行连锁分析, 用Kosambi函数将重组率
转化为遗传距离(cM), 用MapChart 2.1 (Voorrips
2002)绘制分子标记连锁图。按照 ht tp://www.
gramene.org/microsat/提供的序列, 由上海生工生物
工程技术服务有限公司合成 243对微卫星引物。
结果与讨论
1 ‘特矮稻 -2’的表型和 sd-1位点分析
‘特青’是半矮生性状的常规籼稻品种, 广泛应
用于生产栽培中。在成熟期与 ‘特青 ’比较的结果
表明, ‘特矮稻 -2’的植株高度明显矮化(图 1-a), 株
高仅 35 cm左右。另外, 其茎秆比 ‘特青 ’细, 节
间长度缩短, 穗短小, 但是分蘖数较 ‘特青 ’明显增
多, 达到 40个左右, ‘特青 ’仅为13个左右(图1-b)。
来源于低脚乌尖的sd1基因是目前生产上应用
最多的籼稻半矮秆基因, Monna等(2002)的研究表
明, sd1基因是含有 383 bp缺失突变的GA20ox-2,
在缺失位点之后产生了一个终止密码子, 从而编码
出完全无催化活性的GA20氧化酶 -2。本文设计
的正向引物在 sd1基因的 383 bp缺失突变区域内,
图 1 ‘特矮稻 -2’的表型和 sd-1位点分析
Fig.1 Phenotype and characterization of sd-1 locus of ‘Teaidao-2’
a: ‘特青 ’和 ‘特矮稻 -2’在抽穗期的表型(比例尺为 10 cm); b: ‘特青 ’和 ‘特矮稻 -2’抽穗期的分蘖数; c: sd-1位点扩增图谱。1:
‘特青 ’; 2: ‘特矮稻 -2’; 3: ‘日本晴 ’; 4: ‘9311’; 5: 空白对照; M: Marker。
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反向引物在缺失突变区域外。因此, 当携带有 sd-1
位点时, 即在GA20ox-2处有 383 bp缺失的品种不
能扩增出 238 bp的条带; 若没有携带 sd-1位点的
品种即能扩增出相应的条带。从图 1-c可见, ‘特
青 ’和 ‘特矮稻 -2’都携带有 sd-1位点, ‘日本晴 ’和
‘9311’都没有 sd-1位点。这表明 ‘特矮稻 -2’可能
来自于携带有 sd-1位点的亲本, 或者是在GA20ox-2
基因位点发生了缺失突变。
2 GA3对 ‘特矮稻 -2’ α-淀粉酶的诱导
水稻种子萌动时, 由胚分泌出的GA3在糊粉层
诱导合成或激活 α-淀粉酶。种子胚去除后, 无胚
的种子部分不能产生 α-淀粉酶, 但在培养基中外
加GA3时可诱导产生α-淀粉酶, 将培养基中的淀粉
分解成糖。用 I-KI指示剂显色时, 被水解的部分
呈现白色晕圈。从图 2可见, ‘特青 ’和 ‘特矮稻 -2’
的无胚种子部分在没有加入外源GA3时, 都没有表
现出α-淀粉酶的活性, 而加入外源GA3后, 则都表
现出α-淀粉酶活性, 表明 ‘特青 ’和 ‘特矮稻 -2’的
种子都能正常响应外源的GA3信号, 从而显示 ‘特
青 ’和 ‘特矮稻 -2’的GA3信号转导途径是正常的。
3 GA3和烯效唑对 ‘特矮稻 -2’第二叶鞘长度的影
响
水稻第二叶鞘是对GA3比较敏感的部位, 在幼
苗期就可以进行测定, 一般常以GA3对第二叶鞘长
度的影响作为植物是否对GA3敏感的一个生理指标
(汤日圣等1989; 史春余等1996; Ueguchi-Tanaka等
2000)。图 3表明, 未经烯效唑预处理的幼苗, 在相
同浓度GA3影响下, ‘特青’的第二叶鞘的伸长比‘特
矮稻-2’明显; 经过烯效唑预处理的幼苗, 其第二叶
鞘的伸长都明显受烯效唑的抑制, 但是随着GA3浓
图 2 α-淀粉酶活性的诱导
Fig.2 The α-amylase activity induction
图 3 GA3和烯效唑对第二叶鞘长度的影响
Fig.3 Effects of GA3 and uniconazole on elongation of the second leaf sheath
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度的升高, ‘特青’第二叶鞘的伸长仍然较‘特矮稻-
2’明显。这说明 ‘特青 ’ 对GA3的敏感度比 ‘特矮
稻-2’高。
4 GA3对 ‘特矮稻 -2’植株高度的影响
从图4可以看出, 一定浓度的GA3对‘特青’和
‘特矮稻 -2’的植株高度都有一定的增长, GA3浓度
在 0~10-4 mol·L-1范围内, ‘特青 ’的株高从 85.5 cm
增高至 112 cm左右, ‘特矮稻 -2’的株高从 34.5 cm
增高至 43.6 cm左右。说明 ‘特矮稻 -2’对GA3没
有‘特青’敏感, 且施用外源GA3后不能恢复到正常
植株的高度。这些表明, ‘特矮稻 -2’的GA3信号
转导途径是正常的, 而且, 外源GA3也不能促使‘特
矮稻 -2’恢复到正常的植株高度, 显示 ‘特矮稻 -2’
的特别矮化机制与GA3似乎没有直接关系。
5 特矮突变性状的遗传分析
种植 ‘特矮稻 -2’ב日本晴 ’的F2群体共1 090
株, 成熟期调查的植株高度都在 40 cm以下, 表现
为 ‘特矮稻 -2’表型的单株 272株, 单株高度在 90
cm以上的植株 818株。卡平方测验的结果表明,
正常株和特矮株的表型分离比符合 3:1 (χ2=0.0012<
χ20.05=3.84, P>0.9), 这说明 ‘特矮稻 -2’的特矮性状
由 1 对隐性矮秆基因控制。
6 SSR分析和矮秆基因的初步定位
从 ‘特矮稻 -2’ב日本晴 ’的F2群体中, 选取表
现 ‘特矮稻 -2’表型的 150株单株为定位群体。采
用分布于水稻 12条染色体上的 243对SSR引物对
亲本 ‘特矮稻 -2’和 ‘日本晴 ’进行分析的结果表明,
位于第12染色体上的4对SSR标记RM101 (图5)、
RM519、RM235、RM17与矮秆基因表现连锁关
系。4对标记的 3种分子标记带型(‘特矮稻 -2’型、
图 4 GA3对 ‘特矮稻 -2’ 植株高度的影响
Fig.4 Effect of GA3 on plant height
图 5 RM101在亲本和 F2部分隐性单株间的表现
Fig.5 Amplification patterns of RM101 on parents and a part of F2 recessive individuals
M: Marker; N: ‘日本晴 ’; T: ‘特矮稻 -2’; F2: F2部分隐性单株。
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‘特矮稻 -2’ב日本晴 ’型和 ‘日本晴 ’型)均符合1:2:1
的分离比例, 无偏态分离。到目前为止, 在这一染
色体座位上尚未见表现为相同表型的隐性矮秆基因
的报道, 因此, 该隐性矮秆基因暂时命名为 ED
(especially dwarfing gene)。
用Mapmaker/EXP Version 3.0对分离群体的
150个单株进行田间表型性状与分子标记基因型的
连锁分析, 并计算标记间的遗传距离的结果表明, 隐
性矮秆基因ED定位在SSR标记RM519和RM235
之间。4个分子标记与ED间的排列顺序和遗传距
离为RM101-13.1 cM-RM519-15.9 cM-ED-22.0 cM-
RM235-5.3 cM-RM17 (图 6)。
新的水稻隐性矮秆基因或等位基因, 这对深入理解
和认识水稻矮化机制, 扩大水稻矮源基因的遗传基
础和有效利用该基因培育新的优良品种可能有一定
的意义。
参考文献
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另据Sakamoto等(2004)报道, 水稻中与GA3代
谢相关的酶基因分别分布在第 1、2、3、4、5、
6、7、9和 11染色体上, 而 ED基因定位在第 12
染色体上, 说明‘特矮稻-2’的特别矮化机制可能与
GA3没有直接关系。目前唯一报道过的定位在第
12染色体上的矮生性基因是 d33, 但是 d33突变体
是一种半矮秆的突变体, 其水稻叶片呈现出窄而且
卷曲的表型(http://www.gramene.org/), ‘特矮稻 -2’
没有相似的表型。因此, ‘特矮稻 -2’是一个还没
有报道过的新的水稻矮秆突变体, ED基因是一个
图 6 水稻第 12染色体上的 ED与分子标记的连锁图
Fig.6 Linkage map of ED on chromosome 12 in rice