全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (11): 1942~1946　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.04131942
收稿 2015-07-25　　修定 2015-09-01
资助 农业部农业公益性行业科研专项(201103007)。
* 通讯作者(E-mail: hrcui@zju.edu.cn; Tel: 0571-86971405)。
转基因抗虫水稻矮秆突变体的表型鉴定及其对外源赤霉素的反应
崔海瑞1,*, 沈希宏2, 朱斌1, 宋悦1, 舒庆尧1
1浙江大学原子核农业科学研究所, 农业部核农学重点开放实验室, 杭州310029; 2中国水稻研究所, 杭州311401
摘要: 从粳稻品种‘秀水11’导入cry1Ab基因的后代获得了一个矮杆突变体。PCR检测结果显示突变体携带着cry1Ab基因。
对F2分离群体的GUS组织化学分析揭示, 矮杆性状与插入的T-DNA不呈现共分离, 是无性系变异引起的。与对照相比, 因
少1个节间和各节间均缩短, 突变体的株高显著降低。突变体的农艺性状也发生了变化, 分蘖数显著增多, 但穗长、穗粒数
和单株粒重则显著降低。苗期和拔节期赤霉素处理表明该突变体及其野生型亲本均为赤霉素敏感型。
关键词: 转基因水稻; 无性系变异; 矮杆突变体; 赤霉素
Phenotypic Characterization and Response to Gibberellic Acid (GA3) of a
Dwarf Mutant Derived from Insect-Resistant Transgenic Rice
CUI Hai-Rui1,*, SHEN Xi-Hong2, ZHU Bin1, SONG Yue1, SHU Qing-Yao1
1Key Laboratory of Nuclear Agricultural Sciences, Ministry of Agriculture, Institute of Nuclear Agricultural Sciences, Zhejiang
University, Hangzhou 310029, China; 2China National Rice Research Institute, Hangzhou 311401, China
Abstract: A dwarf mutant was obtained from the progeny of japonica rice variety ‘Xiushui 11’ transformed
with a cry1Ab gene mediated by Agrobacterium tumefaciens. PCR detection showed that the mutant still carried
the transgene cry1Ab. Histochemical GUS assay revealed that the dwarf trait did not co-segregated with T-DNA
insertion in F2 segregating population, suggesting the dwarfism was caused by somaclonal variation. Compared
with the wild type, the mutant was significantly decreased in plant height because of less internode number and
shorter internode length. Agronomical traits of the mutant were also changed with a significant increase in tiller
number, but a significant decrease in spike length, grain number per spike and grain weight per plant. Both the
mutant and its wild type were sensitive to exotic GA3 treatment at seedling and jointing stages.
Key words: transgenic rice; somaclonal variation; dwarf mutant; GA3
矮化是水稻育种目标中的一个重要农艺性状,
对于提高产量和抗倒伏具有重要作用, 矮秆资源
的发现、研究与矮秆品种的推广引发了水稻生产
的第一次绿色革命(Zhang等2013; Hedden 2003)。
生产上大面积应用的水稻矮秆品种几乎全部与隐
性半矮秆基因sd-1有关(高奋明等2005; 朱立宏等
1980), 但单一遗传资源的利用会导致遗传基础过
分狭窄, 也存在潜在的风险(Liang等2004)。大多
数植物矮化是由于体内赤霉素(gibberellic acid, GA)
和油菜素内酯(brassinolide, BR)合成或信号转导受
到影响, 少数植物矮化的发生与生长素(indole acetic
acid, IAA)有关(白丽君和尹淑霞2014; 武涛等
2005)。GA有着广泛而复杂的生物学功能, 调节植
物整个生命周期不同阶段的生长和发育(张迎迎和
何祖华2010)。与GA相关的矮化突变体可以分为
GA缺陷型及GA不敏感型两种(白丽君和尹淑霞
2014; 高润红等2014; 武涛等2005), GA缺陷型突变
体GA合成途径上基因的突变导致GA合成受阻引
起植株矮化, 外施GA可以使株高恢复; GA不敏感
型矮杆突变体是GA响应途径缺陷, 不能够响应外
源GA, 株高不能恢复。研究结果业已表明, 水稻的
矮生性状与GA有着密切的关系(黄秀芝等2012; 侯
雷等2012; 李晨晨等2013; 刘清等2014; Piao等
2014; Sakamoto等2004)。因此, 水稻矮杆新资源的
创制、鉴定与应用对于水稻矮化育种具有重要意
义, 研究矮杆突变体对GA处理的反应也可以为了
解植物生长发育的调控和进一步揭示矮化发生的
分子生物学机制奠定基础。
“克螟稻” (KMD)系通过农杆菌介导法将苏云
金杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫晶体蛋白质基
崔海瑞等: 转基因抗虫水稻矮秆突变体的表型鉴定及其对外源赤霉素的反应 1943
因cry1Ab导入粳稻品种‘秀水11’而培育出的转基
因抗虫水稻(舒庆尧等1998; Shu等2000)。在导入
cry1Ab基因再生植株的后代中, 转基因植株除表现
导入目的基因控制的性状外, 还出现了包括矮秆
等多种性状的变异(Shu等2002), 从中选育到了一
个稳定的矮杆突变体, 其稻米营养成分和淀粉食
用品质与对照无显著差异(崔海瑞等2005)。本研
究对该突变体进行了表型鉴定, 研究了其矮杆性
状与T-DNA插入的关系及其在苗期和拔节期对外
源GA处理的反应, 为其育种应用和进一步揭示矮
杆突变发生的机理提供参考。
材料与方法
1 材料
粳稻(Oryza sativa L. subsp. japonica)品种‘秀
水11’及其导入cry1Ab基因的矮秆突变体。
2 方法
2.1 突变体的培育
利用农杆菌介导法将苏云金杆菌(Bacillus
thuringiensis)的杀虫晶体蛋白质基因cry1Ab导入粳
稻品种‘秀水11’ (舒庆尧等1998; 项友斌等1999), 观
察T1和T2代转基因植株的性状变化(Shu等2002),
选择其中的矮杆变异株, 经过连续自交获得矮杆
性状表现稳定的突变体。
2.2 突变体的表型鉴定
在杭州和海南两地种植, 单本插秧, 种植密度
为15 cm×15 cm, 按常规方法管理。杭州田间种植
时, 在分蘖末期考查分蘖数; 在抽穗期测量上三叶
长度; 在成熟期测量株高后收回, 室内考查节间长
度、穗长、粒数、结实率、千粒重和单株粒重。
海南种植时, 分别在苗期、分蘖期、成熟期考查
苗(株)高。各考查30株, 取平均值。
2.3 苗期GA3点滴处理
突变体和‘秀水11’的种子经升汞消毒, 催芽至
第一叶鞘长度约2 mm时移至石英砂上培养, 在一
叶一心期挑选均匀一致的幼苗分成5组, 每组20株,
设3个重复。在刚出现的第二叶和第一叶之间, 用
微量注射器分别滴加2 μL不同浓度的GA3溶液, 5
种处理浓度分别为0.08、0.4、2、10和50 mg·L-1。
处理后继续培养至二叶一心期, 测量第二叶鞘长
度(Mitsunaga等1994)。
2.4 拔节期GA3喷洒处理
对海南种植的矮杆突变体和‘秀水11’, 在拔节
期用50 mg·L-1的GA3溶液进行整株均匀喷雾, 于完
熟期测量穗下第一、第二和第三节间的长度及株
高。每个处理30株, 3次重复。
2.5 PCR检测
随机抽取20株矮杆突变体不同植株, 在分蘖期
取叶片提取DNA进行PCR (王忠华等2001), 扩增产物
用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙锭染色检测,
以明确突变体在变矮的同时是否携带cry1Ab基因。
2.6 F2群体的GUS组织化学检测
用矮杆突变体与‘秀水11’进行正反交配组, 将
F1代自交后的种子种植形成F2群体。鉴于KMD中
gus基因与cry1Ab基因紧密连锁遗传(王忠华等
2001), 在分蘖期对各单株取叶片进行了GUS组织
化学检测(Wu等2000; Jefferson 1987), 以明确矮杆
性状与转基因是否关联。显色的记为GUS+, 未显
色的记为GUS-, 在完熟期测量株高, 根据不同高度
植株的GUS组织化学检测结果判断矮杆性状与
T-DNA插入是否共分离。
实验结果
1 突变体株高性状与T-DNA插入的关系
为确认KMD矮杆突变体是否携带外源杀虫
晶体蛋白基因cry1Ab, 对矮杆突变体进行了PCR检
测。结果(图1)表明随机抽取的不同植株均能扩增
出预期大小为559 bp的片段, 说明矮杆突变体携带
着杀虫晶体蛋白质基因cry1Ab, 而且已经纯合。
若矮杆性状是由于T-DNA插入特定基因导致
的, 那么矮杆与导入的外源基因间应存在共分离
现象。对突变体与‘秀水11’正反交组合的519个F2
单株进行GUS活性的检测, 结果见表1。GUS+有
348株, GUS-有171株, 分离比符合3:1分离, 与KMD
图1 矮秆突变体cry1Ab基因的PCR扩增
Fig.1 PCR products of cry1Ab gene in dwarf mutant plants
M: 100 bp Maker; 1~6: 矮秆突变体不同植株。
植物生理学报1944
中T-DNA单位点插入的结果一致。矮秆植株中有
3株为GUS-, 而正常植株中有186株为GUS+, 说明
矮秆性状与GUS+不呈现共分离。显然, 矮杆突变
不是由于T-DNA插入引起的, 而是来自转基因植
株再生过程中的体细胞变异, 即矮杆性状是无性
系变异造成的。
表1 F2群体中不同高度植株的GUS组织化学分析
Table 1 Histochemical GUS assay of plants with
different heights in F2 population
GUS活性 矮株 半矮株 正常株 总数
GUS+ 30 132 186 348
GUS- 3 54 114 171
表2 突变体与‘秀水11’的株高及节间长度的比较(杭州)
Table 2 Comparison of plant height and internode length between the mutant and ‘Xiushui 11’ (Hangzhou)
水稻 株高/cm 第一节间长/cm 第二节间长/cm 第三节间长/cm 第四节间长/cm 第五节间长/cm
矮秆突变体 29.99±4.89** 9.87±2.17** 3.92±1.05** 3.66±0.94** 1.68±0.86** 0**
‘秀水11’ 73.63±5.94 22.25±3.36 13.76±2.46 11.77±1.48 6.33±1.56 1.86±1.12
　　*代表5%水平上的显著性, **表示1%水平上的显著性, 下表同此。
表3 不同发育时期的突变体株高变化(海南)
Table 3 Changes in plant height of the mutant at different developmental stages (Hainan)

水稻
株高/cm
二叶一心期 分蘖期 拔节期 成熟期
矮秆突变体 5.35±0.49** 10.90±0.93** 25.98±1.33** 42.67±3.02**
‘秀水11’ 10.63±0.74 20.93±1.03 46.06±2.08 74.20±2.04
表4 矮秆突变体与‘秀水11’的主要农艺性状比较
Table 4 Comparison of agronomic traits between dwarf mutant and ‘Xiushui 11’
水稻 分蘖数/个 穗长/cm 穗粒数 结实率/% 千粒重/g 单株粒重/g 剑叶长/cm 倒二叶长/cm 倒三叶长/cm
矮秆突变体 11.5±1.92* 12.4±0.88** 47.0±5.03** 83.4±5.42 21.6±2.16 9.8±2.79* 14.8±1.56** 20.0±1.90* 22.2±1.53**
‘秀水11’ 9.8±1.68 18.4±1.47 98.9±8.42 83.8±6.85 22.9±2.54 14.9±2.86 25.2±2.58 26.7±2.78 31.4±2.62
2 突变体的表型分析
矮秆突变体在杭州和海南两地的株高均比对
照‘秀水11’显著降低。在杭州种植时, 矮秆突变体
的植株高度在20~40 cm之间, 平均比对照降低
59.27%。进一步检测节间的数目和长度时发现,
突变体少1个节间, 各节间长度也明显变短, 其中
以中下部节间缩短比例较大(表2)。在海南短日照
条件下, 尽管矮秆突变体的株高比在杭州种植时
增加45%左右, 但在不同发育时期的株高仍显著低
于对照‘秀水11’, 而且其矮秆特性在幼苗期就表现
明显(表3)。
突变体的农艺性状也发生了变化(表4)。在
杭州常规种植条件下, 矮秆突变体播始历期83 d左
右, 生育期与‘秀水11’相仿, 结实率和千粒重也无
显著差异, 但穗长、穗粒数和单株粒重均比对照
明显减少, 分蘖数则比‘秀水11’显著增多, 上部3片
叶长度显著或极显著变短, 成熟时叶色比‘秀水11’
浓绿。
3 突变体对外源GA3处理的反应
在苗期进行了不同浓度GA3处理, 矮秆突变体
和‘秀水11’均表现敏感(表5)。总体来说, 随着GA3
处理剂量的增加, 第二叶鞘长度也逐渐增加, 而且
矮秆突变体对GA3的敏感性要比‘秀水11’高。
在拔节期喷洒GA3处理主要是促进穗下第
二、第三节间增长, 而第一节间长度则无显著变
化(表6)。矮秆突变体第二、第三节间长度分别增
长了65.68%和311.81%; ‘秀水11’则分别增长了
崔海瑞等: 转基因抗虫水稻矮秆突变体的表型鉴定及其对外源赤霉素的反应 1945
29.51%和361.99%, 均已达到显著或极显著水平,
说明矮杆突变体和‘秀水11’均为GA敏感型。
讨　　论
在水稻育种和生产上广泛应用的矮源主要是
s-d1及其衍生资源, 为防止遗传资源单一化带来的
风险, 水稻非sd-1矮生基因的发掘和利用也受到了
遗传育种学家的重视。矮化是由节间长度或节间
数减少所致, 也可能是共同作用的结果, 可通过多
种不同途径获得矮化突变体 (白丽君和尹淑霞
表6 GA3处理对拔节期株高和节间长度的影响
Table 6 Effects of GA3 treatment on the plant height and internode length at tillering stage
水稻 处理 株高/cm 第一节间/cm 第二节间/cm 第三节间/cm
矮杆突变体 对照 42.67±3.02 5.72±0.94 2.36±2.17 1.44±0.64
GA3处理 54.54±4.39
** 5.83±2.65 3.91±2.01* 5.93±0.85**
‘秀水11’ 对照 74.20±2.04 14.79±2.12 8.71±2.83 2.92±1.65
GA3处理 97.87±2.86
** 15.80±5.29 11.28±4.70* 13.49±2.32**
表5 GA3浓度对第二叶鞘长度的影响
Table 5 Effect of GA3 concentration on the
length of second sheath
GA3浓度/mg·L
-1
第二叶鞘长度/cm
矮秆突变体 ‘秀水11’
0 1.38±0.19 5.18±0.48
0.08 1.46±0.08 5.50±0.39
0.4 1.56±0.29 5.34±0.55
2 2.14±0.22** 5.72±0.61*
10 3.12±0.70** 7.32±0.83**
50 3.72±0.80** 7.08±0.61**
2014; 李西明等2005)。本研究中的突变体矮杆性
状不与T-DNA共分离, 是体细胞无性系变异造成
的, 不但节间减少1个, 而且各节间都显著缩短, 显
然是节间长度变短和节间数减少的综合结果。目
前发掘的水稻矮杆、半矮秆资源已达60多个(Piao
等2013), 但许多矮杆突变体常伴随其它性状的变
化, 诸如分蘖减少或增多、脆秆、小粒、不育、
卷叶、窄叶、叶色深等(胡江等2009), 大多数无明
显利用价值。本研究中的矮杆突变体产量性状大
多比‘秀水11’表现差, 也无直接利用价值, 但其籽
粒大小和结实率与对照相当, 更可贵的是它携带
抗虫基因cry1Ab, 兼具矮杆和抗鳞翅目害虫两大特
性, 对水稻育种来说是一份宝贵的资源。
根据矮化植株对GA响应的不同, 可将矮杆突
变体划分为GA敏感型和GA钝感型。本研究中, 在
幼苗期和拔节期的GA3处理实验均表明该突变体
为GA敏感型, 在添加外源GA3情况下, 植株高度显
著增加, 说明其GA信号传导途径正常, 推测其内源
GA合成可能受阻或GA合成量极低, 造成GA欠缺,
这尚需通过内源GA的测定来验证。Mitsunaga等
(1994)分析了携带不同矮杆基因的水稻品种对外
源GA的反应, 发现带有sd-1的籼稻品种对GA反应
敏感, 而带有与sd-1非等位基因的品种则反应不敏
感, 认为对GA的敏感性可作为不同矮杆基因的快
速鉴定方法。国内许多研究也有类似结果, 还发
现不同的矮杆基因对GA处理的敏感性也有差异
(董凤高等1992; 何祖华等1993; 李西明等2005; 林
鸿宣等1991)。若按此推论, 本研究中的突变体所
携带的矮杆基因应与sd-1等位。然而, 这种快速鉴
定方法并非适用于所有水稻矮源, 例如, 非sd-1的
矮源同样对GA反应敏感(刘建昌等1997; 钱前等
1997), 与sd-1等位的矮杆突变体既有敏感型也有
不敏感型(金卫和孙漱芗1995)。因此, 本研究中的
突变体所携带的矮杆基因与其它矮杆基因的等位
关系需做进一步遗传分析才能确认。另外, 该突
变体其它性状的变化是否是由于GA的一因多效所
引起也尚待研究。
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