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Photosynthetic C4-Microcycle in Transgenic Rice Plant Lines Expressing the Maize C4-Photosynthetic Enzymes

转玉米C4光合酶基因水稻株系中的光合C4微循环



全 文 :Vol. 30 , No. 6
pp. 536~543  June , 2004
作  物  学  报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 30 卷 第 6 期
2004 年 6 月  536~543 页
转玉米 C4 光合酶基因水稻株系中的光合 C4 微循环
季本华1  朱素琴1  焦德茂2 , 3 Ξ
(1 南通师范学院生命科学与技术系 ,江苏南通 226007 ;2 江苏农业科学院农业生物遗传生理研究所 ,江苏南京 210014)
摘  要  用转 PEPC、PPDK、NADP2ME、PEPC + PPDK等酶基因的水稻株系及原种野生型 (WT) 为材料 , 研究了不同基因型
水稻叶片中的 C4 光合微循环及其功能。用外源 OAA 或 MA 饲喂叶切片或离体叶绿体后 ,光合放氧速率在野生型水稻中
增加了 50 % ,在 NADP2ME2和 PPDK2转基因水稻中增加了 50 %~54 % ,在 PEPC2和 PEPC + PPDK2转基因水稻中增加了
100 %~150 %。证明原种水稻 Kitaake 叶片中具有一个原初的和有限的 C4 光合微循环 ,除 PPDK基因、NADP2ME基因外 ,
外源 PEPC基因或 PEPC + PPDK双基因导入原种水稻 Kitaake 后 ,可大幅度提高 C4 光合微循环的运行。水稻中 C4 光合微
循环的增强有降低光呼吸速率 ( Pr) 、增加净光合速率 ( Pn)的作用 ,在光能利用上 ,可增加 PSⅡ光化学效率 ( Fv/ Fm) 、光化
学猝灭 ( qp) 、降低非光化学猝灭 ( qN)的作用 ;这些结果为转 C4 光合酶基因水稻中建立 C4 微循环系统来提高光合作用效
率的可能性提供了依据。
关键词  转基因水稻 ;C4 微循环 ;叶绿素荧光 ;C42光合酶 ;草酰乙酸 ;苹果酸
中图分类号 :S511
Photosynthetic C42Microcycle in Transgenic Rice Plant Lines Expressing the Maize
C42Photosynthetic Enzymes
J I Ben2Hua1 ,  ZHU Su2Qin1 ,  J IAO De2Mao2
(1 Department of Life Sciences and Technology , Nantong Normal University , Nantong 226007 , Jiangsu ; 2 Institute of Agrobiological Genetics and Physiology , Jiang2
su Academy of Agricultural Sciences , Nanjing 210014 , Jiangsu , China)
Abstract  Photosynthetic C42microcycle and its function in photosynthetic apparatus were explored by comparing the trans2
genic rice lines expressing the maize C42specific PEPC gene , PPDK gene , NADP2ME gene and PEPC + PPDK double genes
with their wild type rice Kitaake. The activities of photosynthetic C42pathway related key enzymes , PEPC , NADP2ME ,
PPDK were detected in both wild type rice Kitaake and transgenic rice. Photosynthetic oxygen2evolution rates of leaf seg2
ments or intact chloroplasts in vitro fed with oxaloacetate (OAA) or malate (MA) increased by 50 % in wild type rice Ki2
taake , by 50 % - 54 % in NADP2ME2 and PPDK2transgenic rices (no significant difference with wild type rice Kitaake) ,
by 100 % - 150 % in PEPC2 and PEPC + PPDK2 transgenic rices , which indicated that there was a primitive and limited
photosynthetic C42microcycle in wild type C32rice Kitaake , and heterogenous PEPC gene and/ or PEPC + PPDK double
genes , with the exception of PPDK gene and NADP2ME gene , from C42plant could enhance the operation of existed C42mi2
crocycle in C32transgenic rice Kitaake. As the photosynthetic C42microcycle enhanced , the rates of photorespiration ( Pr)
were lowered and the net photosynthetic rates increased by determining the CO2 exchanging rates , and as a consequence ,
PSⅡphotochemical efficiency ( Fv/ Fm) and photochemical quenching ( qp) increased accompanied with a decrease in the
non2photochemical quenching ( qN) by determining the chlorophyll fluorescence characteristics. Above results might offer
the experimental evidences for photosynthetic efficiency2raising gene engineering of rice.
Key words  Transgenic rice ; Photosynthetic C42microcycle ; Chlorophyll fluorescence ; Photosynthetic C42enzyme ; Ox2
aloacetate ; MalateΞ基金项目 :国家重点基础研究发展规划 ( G1998010100)和国家自然科学基金 (39870533)项目。
作者简介 :季本华 (1948 - ) , 男 ,硕士 ,教授 , 从事光合作用高效光合机理研究。E2mail : jibenhua @nttc. edu. cn3通讯作者 :焦德茂 (1938 - ) , 男 , 研究员 ,从事光合作用高效光合机理研究。E2mail : photosyn @public1. ptt . js. cn
Received(收稿日期) :2003203206 ; Accepted (接受日期) : 2003208211.

  近 10 年来 ,将 C4 光合基因转入 C3 水稻以提高
其光合能力的研究备受关注[1 ] 。随着分子生物学技
术的发展 , 已获得转磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
(PEPC) [2 ] 、丙酮酸磷酸双激酶 ( PPDK) [3 ] 、NADP2苹
果酸酶 (NADP2ME) [4 ]等基因和转 PEPC + PPDK[5 ]双
基因的水稻。在高光、高温条件下 ,与原种水稻相
比 ,转 PEPC基因水稻具有高光合速率和耐光氧化
的特性[6 ] 。对此 ,我们开始的研究认为将 PEPC 基
因导入水稻后是叶片气孔导度的增加提高了叶片光
合能力[7 ] 。但进一步的研究[8 ]表明 ,转 PEPC 基因
水稻中光合速率的增加与气孔导度无相关 ,而是由
于叶片细胞中浓缩 CO2 能力的增加。这与 Magnin N
C等[22 ]在无 Kranz 结构的 C3 植物 Hydrilla verticilata
中的研究结果一致。陈根云等[9 ]用外源 C4 二羧酸
饲喂 C3 菠菜叶片 ,看到光合能力的提高 ,为 C3 植物
叶片中具有 C4 微循环提供了充分的证据。在上述
工作基础上 ,本文用稳定的转 PEPC、转 PPDK、转
NADP2ME、转 PEPC + PPDK双基因水稻株系和原种
水稻 Kitaake (WT)进行了实验。旨在了解 C3 水稻中
是否具有 C4 光合微循环 ,以及转基因水稻株系中相
关外源 C4 光合酶基因的生理功能 ,为进一步探讨 C3
植物中增强 C4 光合特性的机理和技术应用提供依
据。
1  材料与方法
1. 1  植物材料
以日本水稻品种 Kitaake ( Oryza sativa L. subsp .
Japonica Kitaake ) 为基因受体 , 分别导入玉米的
PEPC、PPDK、NADP2ME 基因 ,获得不同的转基因水
稻材料 ;另外通过常规杂交的方法获得转 PEPC +
PPDK双基因水稻材料。由美国华盛顿州立大学 Ku
教授[2 ]提供已转入 C4 光合酶基因的第 3 代水稻及
原种材料 ,我们经过逐代繁殖、检测和选择 ,已得到
第 7 代稳定的材料[6 ,8 ] 。这些材料盆栽于江苏省农
业科学院农业生物遗传生理研究所网室盆钵中 ,5
月上旬播种 ,每个材料播 25 盆 ,每盆直播 8 穴 ,每穴
1 苗。在自然温光条件下按常规管理。
1. 2  测定方法
取苗期 5 叶龄生长在网室盆钵中的水稻功能叶
片制备叶绿体、提取酶液 ,测定叶切片的光合放氧速
率、CO2 气体交换速率、叶绿素荧光特性等。
1. 2. 1  离体完整叶绿体制备与光合放氧速率的测
定  水稻叶片在光下激活 30 min , 加入 3 倍体积
预冷的缓冲液 A(山梨醇 330 mmol/ L , MES 50 mmol/
L , EDTA 2 mmol/ L , MgCl2 2 mmol/ L , 抗坏血酸 Na
盐 2 mmol/ L , pH 611) , 间歇捣碎 3~4 次 ,每次 6 s ,
8 层纱布过滤 , 滤液于 2 500 ×g 和 4 ℃下离心 30 s。
弃上清液并洗去破碎叶绿体 , 悬浮于缓冲液 B (山
梨醇 330 mmol/ L , HEPES 50 mmol/ L , EDTA 2 mmol/
L , MgCl2 2 mmol/ L , pH 617) 中 , 以浓度 > 2 mg/ mL
的叶绿素保存备用。根据叶济宇和米华玲[10 ]的氧
电极法测定叶绿体完整度 , 其完整度应在 80 %以
上。将水稻完整叶绿体放入含 014 mmol/ L NaHCO3
的缓冲液 C(山梨醇 330 mmol/ L , HEPES 50 mmol/ L ,
EDTA 2 mmol/ L , MgCl2 2 mmol/ L , pH 715) 中 , 在不
同浓度 OAA 或 PEP 或MA(Sigma 公司产品)条件下 ,
分别用氧电极[Oxylab system (liquid phase) Hansatech
UK]测定其光合放氧速率。外源 OAA 或 MA 母液用
NaOH调节其 pH至与反应液相同。
1. 2. 2  叶切片光合放氧速率的测定   取网室中
生长的水稻叶片切成约 115 mm ×115 mm 小块 , 然
后将叶切片置含 014 mmol/ L NaHCO3 的 STN 缓冲液
(蔗糖 400 mmol/ L , Tris2Cl 50 mmol/ L , pH 715 , NaCl
10 mmol/ L) , 在不同浓度的 OAA 或 PEP 或 MA 条件
下 ,分别用氧电极 [ Oxylab system ( liquid phase )
Hansatech UK]测定其光合放氧速率。
1. 2. 3  叶片 CO2 气体交换速率测定   取水稻叶
片 , 分别插入含 OAA ( 200 μmol/ L ) 或 MA ( 200
μmol/ L) 的水溶液 (对照叶片插入蒸馏水) 中 , 在 1
000μmol·m - 2·s - 1光强下 30 min 后 , 用便携式光合
气体分析系统 ( TPS21 型 ,英国 PP Systems 公司) 在
350μL/ L 的 CO2 和 1 000μmol·m - 2·s - 1光强下测定
叶片的净光合速率。用 2 % O2 与 21 % O2 下的光合
速率之差来表示光呼吸速率。
1. 2. 4  酶液的提取和酶活性的测定   取水稻叶
片 2 g 在 Tris2HCl 缓冲液 [ 50 mmol/ L Tris2HCl pH
718 , 10 mmol/ L MgCl2 , 5 mmol/ L DTT , 2 % PVP ( W/
V) 和 10 % 甘油 ]中冰浴研磨 ,8 层纱布过滤后 ,将
滤液在 HITACHI (20PR252D) 型离心机上于 4 ℃下
10 000 ×g离心 20 min , 弃沉淀 , 上清液即为酶液。
C4 光合酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 ( PEPC) 、丙酮酸
磷酸双激酶 ( PPDK) 、NADP2苹果酸酶 (NADP2ME) 、
735 6 期 季本华等 :转玉米 C4 光合酶基因水稻株系中的光合 C4 微循环    

NADP2苹果酸脱氢酶 (NADP2MDH) 的活性分别参照
Gonzalez 等人[11 ] 、Hatch 等人[12 ] 、陈景治等人[13 ]和李
斌等人[14 ]的方法测定 ,碳酸酐酶 (CA)活性的测定按
郭敏亮等[15 ]的方法 , RuBP 羧化酶 ( RuBPC) 活性测
定参照魏锦城等人[16 ]和 Kung 等人[17 ]的方法。
1. 2. 5  叶片叶绿素荧光参数的测定   水稻叶片
经暗适应 10 min 后用 PAM22000 荧光仪和数据采集
软件 DA22000 进行测定 ,测定温度 30 ℃。参照文
献[18 ,19 ]的方法测定荧光动力学参数 ,按下式计算 :
PS Ⅱ光化学效率 Fv/ Fm = ( Fm - Fo) / Fm ;光化学猝
灭 qp = ( F′m - Fs) / ( F′m - Fo) ; 非光化学猝灭 qN
= ( Fm - F′m) / ( Fm - Fo) 。
2  结果
2. 1  光抑制条件下转 C42光合酶基因水稻和原种水
稻( WT)叶内光合酶活性的变化
在对照条件 (350μmol·m - 2·s - 1 , 21 % O2 , 350
μL/ L CO2 , 30 ℃, 3 h) 下 ,外源基因在水稻中都得到
表达 ,因为转 C42光合酶基因水稻中外源基因编码的
酶的活性均高于其他基因型水稻中相关酶的活性 ,
其中外源 PEPC 基因的表达活性最高。例如 ,转
PEPC基因水稻中除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
(PEPC)活性明显高于原种水稻 (WT)外 ,丙酮酸磷酸
双激酶 (PPDK) 、NADP2苹果酸酶 (NADP2ME) 、NADP2
苹果酸脱氢酶 (NADP2MDH) 、碳酸酐酶 (CA) 以及 C3
光合酶 RuBPC 的活性均与原种水稻 (WT) 中的相近
(图 12A ,B , C , D , E) 。在光抑制条件 (1 000μmol·
m
- 2·s - 1 , 2 % O2 , 60μL/ L CO2 , 30 ℃, 3 h) 下 ,转
C42光合酶基因水稻和原种水稻 (WT) 中 C3 光合酶
RuBPC活性约增加了 4 %左右 (未达显著水平) ,且
在不同基因型水稻间无差异。但 C4 光合酶活性有
了较明显的提高 ,如 PEPC、CA、NADP2MDH、NADP2
ME、PPDK的活性在野生型 (WT) 水稻中分别增加了
21317 %、27819 %、22317 %以及 23516 %和 21510 %
(转 NADP2ME、转 PPDK基因型水稻与野生型相似)
(图 12A ,B ,C) ,在转 PEPC 基因水稻中分别增加了
36417 %、34213 %、30411 %、29412 %和 39811 % (转
PEPC + PPDK基因型水稻与转 PEPC 基因水稻的相
似) (图 12D , E) 。上述结果说明 ,在光抑制条件下 ,
转 PEPC、转 PEPC + PPDK双基因水稻中除 PEPC 活
性增加且仍然高于原种水稻 (WT) 中的外 ,其他 C4
光合酶 (CA、NADP2MDH、NADP2ME、PPDK) 的活性也
诱导增加了 ,且高于原种水稻 (WT) 中有关酶的活
性。图 12F、G、H、I 和 J 中用 PEPC/ RuBPC 比值和
CA/ RuBPC比值描述了不同基因型水稻在逆境下 C3
光合途径和 C4 光合途径的协调运转情况。在对照
条件下原种水稻 (WT) 、转 NADP2ME 和转 PPDK基
因水稻的 PEPC/ RuBPC比值和 CA/ RuBPC 比值分别
为 0124 和 0132 ,光抑制条件下分别增加到 0149 和
0188 左右 (图 12F , G, H) ; 而转 PEPC 基因和转
PEPC + PPDK双基因型水稻在对照条件下的 PEPC/
RuBPC比值较高 ,约为 019 , CA/ RuBPC 比值与 WT
相似 ,约为 0132 ,但在逆境下 PEPC/ RuBPC比值增至
410 左右 ,CA/ RuBPC比值增至 114 左右 (图 32I ,J ) 。
上述结果说明 ,无论在何种条件下 ,RuBPC 都起着重
要的作用。但在光抑制条件下 ,PEPC 和 CA 所起的
作用明显大于对照条件下 ,并且在转 PEPC 基因型
水稻(PC)中的作用明显大于在野生型(WT)中的作用。
2. 2  OAA、MA和 PEP 分别对转 C4 光合酶基因水
稻叶切片和叶绿体光合放氧的影响
图 22A 显示 ,未加 OAA 时 ,所有基因型水稻叶
切片在含 014 mmol/ L 的 NaHCO3 的 STN 缓冲液中的
光合放氧速率在 512μmol·m - 2·s - 1左右 ,随着外加
OAA 浓度的增加 ,光合放氧速率也随之增加 ,当
OAA 浓度为 200μmol/ L 时 ,野生型 (WT)和转 NADP2
ME、PPDK基因型的光合速率分别增加了 7112 %、
7614 %和 7816 % ;转 PEPC、PEPC + PPDK双基因型的
光合速率分别增加了 13314 %和 14416 %。当 OAA
浓度高于 200μmol/ L 时 ,随 OAA 浓度的增加 ,光合
速率明显下降。由于 OAA 可能作为一种电子受体
被还原 ,因此 ,还需要确定其对光合放氧的促进 ,是
否源于 OAA 作为碳源的贡献[9 ] 。所以我们在同样
的反应体系中将 HCO -3 的浓度增加到 1 mmol/ L ,此
时离体叶绿体的光合放氧速率几乎是原来的 2 倍 ,
外加 OAA 对光合放氧无促进作用。这说明反应液
在低浓度 HCO -3 (014 mmol/ L) 时 ,OAA 对光合作用
的促进至少其中一部分来自其提供额外的碳源。我
们进一步用 MA 代替 OAA 进行同样的实验 ,可以排
除电子受体效应带来的影响。结果 (图 22B) 显示 ,
MA 对水稻叶切片光合放氧的作用及其变化趋势均
与OAA 类似 ,当 MA 浓度增加时 ,叶切片的光合放
氧速率迅速增加。图 22C 显示 ,叶切片光合放氧对
PEP 的浓度十分敏感 ,低于 100μmol/ L 时有显著的
促进作用 ,高于 100μmol/ L 后有极其显著的抑制作
用。上述结果表明 ,一定浓度的 OAA、MA 或 PEP 对
水稻叶切片的光合放氧速率有较大的促进作用 ,在
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图 1 光抑制条件下原种水稻( WT)和转 C4 光合酶基因水稻株系叶内光合酶活性的变化
Fig. 1 Changes in activities of photosynthetic enzyme in leaves of wild type ( WT) rice cultivar kitaake and photosynthetic C42enzyme
transgenic rice plant lines under photoinhibitory conditions
WT:野生型水稻 Kitaake ;ME:转 NADP2ME基因水稻 ;PK:转 PPDK基因水稻 ;PC :转 PEPC基因水稻 ;PC + PK:转 PEPC和 PPDK双基因水稻。
数据为 5 次实验数据的平均值。下同。
WT:Wild type rice Kitaake ;ME:NADP2ME2transgenic rice ;PK:PPDK2transgenic rice ;PC:PEPC2transgenic rice ;PC + PK:PEPC + PPDK double transgenic
rice. Mean values from 5 independent experiments. The same below.
对照 (Control) :350μmol·m - 2·s - 1 , 21 % O2 , 350μL/ L CO2 , 30 ℃, 3 h. 处理 (Treatment) :1 000μmol·m - 2·s - 1 , 2 % O2 , 60μL/ L CO2 , 30 ℃, 3 h.
此基础上 ,我们进一步研究了 OAA、MA 或 PEP 分别
对水稻离体叶绿体光合放氧速率的影响。图 22D、E
和 F 的结果表明 ,外加 OAA、MA 和 PEP ,野生型
(WT) 、转 NADP2ME 和转 PPDK基因型水稻完整离
体叶绿体光合放氧速率分别增加了 3718 % ~
4612 %、3112 %~4718 %和 4310 %~6311 % ,转 PEPC
和 PEPC + PPDK双基因型水稻完整离体叶绿体光合
放氧速率分别增加了 9815 %~11218 %、10917 %~
13118 %和11010 %~13112 %。这与叶切片实验所得
结果基本一致 ,说明离体叶绿体内 OAA 和 MA 等四
碳双羧酸浓度的增加 ,确能提高光合放氧速率。从
图 2 还可看出 ,与野生型水稻 (WT) 、转 NADP2ME 和
转 PPDK基因水稻相比 ,转 PEPC、转 PEPC + PPDK双
基因水稻叶切片或离体叶绿体经 OAA、MA 或 PEP
935 6 期 季本华等 :转玉米 C4 光合酶基因水稻株系中的光合 C4 微循环    

图 2 草酰乙酸( OAA) 、苹果酸( MA)和磷酸烯醇式丙酮酸( PEP)分别对原种水稻( WT)和转 C42光合酶基因水稻叶切片(左)
和离体叶绿体(右)光合放氧的影响
Fig. 2 Effect of oxaloacetate ( OAA) , malate ( MA) and phosoenolpyruvate ( PEP) on photosynthetic oxygen evolution of leaf discs ( left) and
chloroplasts ( right) in vitro in wild type ( WT) rice kitaake and photosynthetic C42enzyme transgenic rice plant lines , respectively
测定光强 1 000μmol·m - 2·s - 1 ;测定温度 30 ℃。Testing light intensity : a PFD of 1 000μmol·m - 2·s - 1 ;testing temperature : 30 ℃.
处理后 ,光合放氧速率增加的幅度大 ,充分说明外源
PEPC基因在转基因水稻中确实发挥着重要作用。
2. 3  OAA、MA 分别对转 C42光合酶基因水稻株系
叶片 CO2 气体交换的影响
上述实验都是将叶切片置含四碳双羧酸的反应
液 ,测定其对光合放氧的影响。为了进一步验证这
些结果。我们将叶片分别插入 OAA (200μmol/ L)
和MA (200μmol/ L)水溶液中 30 min , 在饱和光强下
完成光诱导后 , 用英国 PP Systems 公司 TPS21 型便 携式光合气体分析系统测定叶片的净光合速率和光呼吸速率。从图 3 可见 ,OAA 和 MA 依然表现出对光合作用的促进作用 ,在 WT 水稻中净光合速率( Pn ) 比对照分别增加了 1516 %和 1111 % , 在转NADP2ME 和 PPDK基因水稻中分别增加了 1419 %和 1017 %、1510 %和 1019 % ,均达到极显著水平。同时 ,在 WT、转 NADP2ME、转 PEPC基因型水稻中的光呼吸速率分别下降了 217 %和 312 %、214 %和 411 %
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图 3 草酰乙酸( OAA) 、苹果酸( MA)分别对原种水稻( WT)和转 C42光合酶基因水稻( PC) 叶片光呼吸速率( Pr)和净光合速率( Pn)的影响
Fig. 3 Effect of oxaloacetate ( OAA) and malate ( MA) on photorespiration rates ( Pr) and net photosynthetic rates ( Pn) in leaves of
wild type ( WT) rice kitaake and photosynthetic C42enzyme transgenic rice lines , respectively
以及 419 %和 416 %(图 32A ,B ,C) ,虽然未达到显著
水平 ,但 Pr/ Pn 比值分别下降了 1519 %和 1218 %、
1318 %和 1211 %以及 1612 %和 1213 % (图 32F , G,
H) 。上述变化在转 PEPC 和转 PEPC + PPDK基因型
水稻中更为显著。经 OAA 和 MA 处理后 ,净光合速
率 ( Pn ) 分别增加了 2516 %和 1916 %、2712 %和
2218 %(极显著水平) ,光呼吸速率 ( Pr) 分别下降了
712 %和 710 %、718 %和 910 % (图 32D , E) , 这样 ,
Pr/ Pn 比值分别下降了 2615 %和 2211 %、2715 %和
2519 %(图 32I ,J ) 。由此可见 ,OAA 和 MA 可提高净
光合速率 ( Pn) ,降低光呼吸速率 ( Pr) ,最终使 Pr/ Pn
比值大幅度降低。这种现象在转 PEPC和转 PEPC +
PPDK双基因水稻中尤为明显。
2. 4  OAA、MA 分别对转 C42光合酶基因水稻株系
和原种水稻( WT)叶绿素荧光参数的影响
取水稻叶片 , 分别插入含OAA (200μmol/ L) 和
MA (200μmol/ L)的水溶液中 (对照叶片插入蒸馏水
中) , 在 1 000μmol photons·m - 2·s - 1下照光 30 min ,
测得的荧光参数如图4所示。WT、转NADP2ME和 转 PPDK基因水稻的荧光特性相似 ,对照组叶片的PS Ⅱ光化学效率 ( Fv/ Fm) 、光化学猝灭 ( qp) 和非光化学猝灭 ( qN)大约为 0175、0171 和 0164 ,在 OAA 处理组上述参数的数值分别增加了 9 %、12 %和下降了 11 %左右 ,在 MA 处理组上述参数的数值分别增加了 8 %、11 %和下降了 10 %左右 (达极显著水平)(图 42A ,B ,C) 。转 PEPC 和转 PEPC + PPDK双基因水稻的荧光特性也很相似 ,对照组叶片的 Fv/ Fm、qp和 qN 大约为 01805、0177 和 0157 ,在 OAA 处理组上述参数的数值分别增加了 211 %、315 %和下降了215 %左右 ,在 MA 处理组上述参数的数值分别增加了 116 %、211 %和下降了 116 %左右 (未达显著水平) (图 42D ,E) 。换言之 ,在此实验条件下 ,WT水稻叶片的 Fv/ Fm、qp 明显低于转 PEPC基因型水稻 ,前者不耐光抑制、后者耐光抑制 ;经 OAA 或 MA 处理后 WT水稻叶片的 Fv/ Fm、qp 值大幅度增加 , PEPC基因型水稻叶片的 Fv/ Fm、qp 略有增加 ,两者都耐光抑制。可见 ,OAA 或 MA 可提高水稻抗光抑制的能力。
145 6 期 季本华等 :转玉米 C4 光合酶基因水稻株系中的光合 C4 微循环    

图 4 OAA, MA分别对原种水稻( WT)和转 C42光合酶基因水稻叶片叶绿素荧光参数的影响
Fig. 4 Effect of oxaloacetate ( OAA) and malate ( MA) on chlorophyll fluorescence parameters in leaves of wild type ( WT) rice
cultivar kitaake and photosynthetic C42enzyme transgenic rice lines , respectively
3  讨论
长期以来对 C3 植物中是否存在 C4 光合途径受
到质疑 ,因为 C4 植物叶片具有特殊的 Kranz 结构。
C4 植物在叶肉细胞中由磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP) 羧
化酶固定 CO2 成草酰乙酸 (OAA) 后 ,转运进入叶片
维管束鞘细胞 ,在维管束细胞中分别经天冬氨酸、苹
果酸 (MA)或 OAA 途径脱羧放出 CO2 ,导致维管束鞘
细胞中 CO2 浓度升高 ,提高了强光下的光合作用速
率[1 ] 。有趣的是近年来发现水生植物 Hydrilla verti2
cilata [22 ]和 Egeria densa [23 ]并无 Kranz 结构 ,但有 C4
光合途径的运行 , 说明在植物叶片的单一光合细胞
中可以进行 C4 光合微循环。实际上 ,早有报道在 C3
作物大豆[20 ] 、小麦[21 ] 、水稻[26 ]叶片中有 C4 光合酶
系统 ,由于酶活性较低 ,因此提出 C3 植物叶片中可
能具有有限的 C4 光合途径。陈根云等[9 ]的研究看
到 ,向 C3 植物菠菜中外加 C4 光合原初产物 OAA 或
MA 可提高叶片的光合能力 ,为在 C3 植物中建立 C4
微循环系统来提高光合作用的效率的可能性提供了
依据。为探明水稻中 C4 微循环及其生理功能 ,我们
借鉴这一技术 ,看到在离体叶绿体、叶切片和完整叶
片不同结构层次上 ,外加 OAA 或 MA 都可以使光合
速率不同程度地提高。特别是外加 OAA 或 MA 对
离体叶绿体光合放氧的促进作用尤为明显 ,说明提
高水稻叶绿体内的四碳二羧酸或 CO2 浓度能够明显
提高光合作用速率。同时暗示若能增加 C4 循环关
键酶 PEPC的活性 ,催化形成更多的 C4 二羧酸 (OAA
或MA) ,则可进一步提高光合能力。本研究中 ,用
OAA 或 MA(30~200μmol/ L) 饲喂原种水稻 (WT) 和
转 PEPC基因水稻 (PC) ,在离体叶绿体、叶切片和完
整叶片不同结构层次上都可看到 OAA 或 MA 对转
PEPC基因水稻 (PC) 光合放氧的促进作用明显大于
对原种水稻 (WT) ,说明若能进一步提高现有高产品
种中的 PEPC活性 ,则可进一步提高光合潜力。
对转基因水稻中 PEPC 的作用 ,目前尚有争议 ,
在不同环境条件下可得出不同的实验结果。在日本
室内中等光强下培养的转 PEPC 基因水稻未见光合
能力的提高[24 ] 。在我国南京高温高光强下培育的
转 PEPC基因水稻有提高光合效率和减轻光抑制/
光氧化的效应[6 ] 。在多逆境 (高温、高光或强紫外
线)的地区 ,与原种水稻 (WT) 相比 ,转 PEPC 基因水
稻 (PC)一般可增产 10 %~30 %[25 ] 。本文的研究表
明 ,外加 C4 光合原初产物可增强转 PEPC 基因水稻
(PC)的 C4 光合特性 ,其生理机制是通过减少光呼
吸、提高净光合能力 ,从而提高光合效率 (图 4) 。
CO2 同化能力的增加 ,需消耗更多的光能 ,即叶片吸
收的光能将更多地进入光化学反应 ,因而使得耗散
多余光能的非光化学系数 ( qN) 降低 ,PS Ⅱ光能转化
效率 ( Fv/ Fm)和光化学猝灭 ( qp) 相应提高。上述生
理过程可能是转 PEPC 基因水稻抗逆增产的生理
基础。
245    作   物   学   报 30 卷  

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