全 文 ：6 3植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (1): 63~68
收稿 2010-09-08 修定 　2010-11-17
资助 国家自然科学基金(31 0 00 1 3 4)和陕西省科技研究发展
(攻关)计划(20 06K1 6-G1 5)。
* 通讯作者(E-mail: zzwang@snnu.edu.cn; Tel: 029-85301260)。
丹参非特异性脂质转移蛋白基因(SmLTP1)的克隆及其表达分析
刘梅, 生华, 化文平, 储君, 王喆之 *
药用资源与天然药物化学教育部重点实验室, 西北濒危药材资源开发国家工程实验室, 陕西师范大学生命科学学院, 西安
710062
摘要: 对丹参 EST序列进行 Blast分析, 获得一个新的非特异性脂质转移蛋白基因, 命名为 SmLTP1 (GenBank注册号为
EF187461)。该基因 cDNA全长 593 bp, 包含一个长为 357 bp的开放读码框, 编码 118个氨基酸。生物信息学结构分析表
明, 该蛋白具有植物 nsLTP的典型结构, 即 4对二硫键, 4个α-螺旋, 1个可结合和容纳脂肪酸分子的类似口袋状的疏水结
构。实时荧光定量PCR分析结果表明, SmLTP1基因在丹参不同组织器官中差异表达, 其表达受病原菌和茉莉酸甲酯的诱
导, 显示SmLTP1基因在植物防御反应中发挥作用。
关键词: 丹参; 非特异性脂质转移蛋白; 基因克隆; 生物信息学分析; 实时荧光定量PCR
Cloning and Expression Analysis of A Non-Specific Lipid Transfer Protein Gene
(SmLTP1) from Salvia miltiorrhiza Bunge
LIU Mei, SHENG Hua, HUA Wen-Ping, CHU Jun, WANG Zhe-Zhi*
Key Laboratory of Ministry of Education for Medicinal Resources and Natural Pharmaceutical Chemistry, National Engineering
Laboratory for Resource Developing of Endangered Chinese Crude Drugs in Northwest of China, College of Life Sciences, Shaanxi
Normal University, Xi’an 710062, China
Abstract: By analyzing EST sequences of Salvia miltiorrhiza, we found a new gene which showed high
homology with plant non-specific lipid transfer proteins and named as SmLTP1 (GenBank accession number:
EF187461). SmLTP1 consists of 593 nucleotides, including a single 357-bp opening reading frame and encod-
ing a 118-amino-acid peptide. Bioinformatics analysis showed that SmLTP1 had the typical structure of the plant
non-specific lipid transfer protein, including 4 pairs of disulfide, 4 α-helices and 1 tunnel-like hydrophobic
cavity which could contain lipid molecules. Quantitative RT-PCR analysis revealed that the gene expressed in
different organs, and could be induced by methyl jasmonate (MeJA) and pathogen. These results showed that
the SmLTP1 might be pathogen-responsive gene in plant defenses and involve in a complex gene regulation
network.
Key words: Salvia miltiorrhiza; non-specific lipid transfer proteins; gene clone; bioinformatics analysis; quan-
titative RT-PCR
植物非特异性脂质转移蛋白(non-specific lipid
transfer protein, nsLTP)是一类广泛存在于高等植物
中的碱性小分子脂质结合蛋白, 至今已发现其存在
于 50 多种植物中(Kader 等 1984; Jose-Estanyol 等
2004; Yeats 和Rose 2008), 该类蛋白其分子组成最
重要的特点是含有8个高度保守的半胱氨酸(Kader
1996), 由 4 个二硫键连接构成稳定的三级结构, 这
种结构具有一个疏水性空穴, 可以转运多种类型的
脂质(Kader 等 1984)。根据其一级结构, nsLTP 被
分为 3类, 其中 nsLTPI 和 nsLTPII分子量分别约为
9 和 7 kDa, pI 介于 8.8~10.0 之间, 均为碱性蛋白
(Kader 1997; Boutrot等 2008), 而 nsLTPIII是一类花
粉特异表达蛋白, 其分子量等化学特性与 nsLTPII
相似(Lauga 等 2000)。自 1975 年 Kader 等首次从
马铃薯块茎中分离得到非特异性脂质转移蛋白, 现
已从水稻、豇豆、大麦、玉米、谷子、绿豆
等植物中分离出50多种非特异性脂质转移蛋白或
基因(汪少芸等 2004)。
目前认为nsLTP成员具有不同的生物学功能,
植物生理学报6 4
主要涉及角质单体的合成、表皮蜡质生成等(Pyee
等 1994; Cameron 等 2006)。一些研究表明 nsLTP
参与植物防御机制, 对细菌、真菌甚至病毒具有抗
性(Molina和Garcia-Olmedo 1997; Salcedo等2007),
并且发现其可作为抑制α-淀粉酶而具有抗虫活性
(Skinner 等 1995; Jones 和 Marinac 2000)。另外,
ns LT P 基因还受低温(H incha 等 2 00 1)、干旱
(Trevino和O’Connell 1998)、ABA (Arondel等2000)
等非生物因素的诱导而被大量表达。此外, nsLTP
还可以调节分解代谢脂质储藏的 α- 氧化、体细胞
胚胎形成、植物信号转导, 参与植物有性生殖和花
粉发育等(田爱梅和曹家树 2008)。因此, 系统地分
析 nsLTP 蛋白结构、特性和表达模式等生物学特
征, 明确其在植物抗性形成方面的作用, 对于植物
抗病和胁迫抗逆性研究和利用基因工程改良植物抗
性有重要意义。
中药丹参为唇形科鼠尾草属多年生药用植物
丹参的干燥根及根茎, 具有活血祛瘀、养血安神、
调经止痛、凉血消痈的功效, 在临床上具有多种药
理作用, 是重要的大宗药材之一(冯玲玲和周吉源
2004)。本文从植物丹参中克隆出了非特异性脂质
转移蛋白基因, 命名为SmLTP1, 分析其分子特征及
其在丹参不同组织及甘蓝黑腐病黄单胞菌和茉莉酸
甲酯(methyl jasmonate, MeJA)等抗逆信号诱导下的
表达情况, 为丹参非特异性脂质转移蛋白的研究以
及培育丹参抗逆新品种建立了一定的基础。
材料与方法
1 材料与试剂
丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)种子种于含蛭
石的营养钵中, 放于人工气候箱中培养, 培养条件
为: 温度(25±2) ℃, 湿度 48%, 光照强度 150 μmol·m-2·
s-1, 光周期为光照 16 h/ 黑暗 8 h。
BIOZOL 试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取
试剂盒和反转录试剂盒均购自杭州博日科技有限公
司; SYBR Green I 和 pMD19-T Simple Vector 购自
TaKaRa公司。大肠杆菌DH5α和甘蓝黑腐病黄单
胞菌(Xanthomonas campestris pv. campestris, XC-1)
均由本实验室保存。
2 处理方法
病原菌处理: 挑取对数生长期黑腐病菌 XC-1
用生理盐水稀释至约OD600=0.2, 喷洒于生长旺盛的
八周龄丹参实生苗叶片上。MeJA处理: 5 mmol·L-1
MeJA直接喷洒于生长旺盛的八周龄丹参实生苗叶
片上。于人工气候箱按原条件继续培养, 分别于接
种后 6、12、24、48 h采样, 液氮速冻, 于-80 ℃储
藏备用。
3 丹参基因组DNA和总RNA的提取
丹参基因组 DNA 提取用 CTAB 法(郝岗平等
2006)。用 Biozol 试剂提取丹参全株、根、茎、
叶, 以及各处理样品提取的总RNA, 以之为模板, 按
照逆转录试剂盒说明书合成 cDNA 第一链。
4 SmLTP1基因的克隆
依据丹参EST序列, 采用Premier Primer 5.0软
件设计一对特异性引物: 5-CGGGATCCATGGCT-
GCAATGACCAAGGC-3 (BamHI); 5-CCCAA-
GCTTTTCACCTCACCTTAGTGCAGTCAGT-3
(HindIII)。以丹参基因组DNA和 cDNA为模板, 扩
增 SmLTP1 片段。反应程序为: 95 ℃变性 3 min;
95 ℃变性 30 s, 55 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸1 min, 30
个循环; 72 ℃延伸 10 min。PCR 扩增产物经胶回
收与 pMD19-T Simple Vector 连接转化大肠杆菌
DH5α, 送至上海华大测序公司测序。
5 SmLTP1蛋白的生物信息学分析
根据生物信息学软件进行在线分析(ht tp:/ /
www.ncbi.nlm.nih.gov/; http://www.cbs.dtu.dk/;
http://cn.expasy.org/; http://psort.nibb.ac.jp/)。用
DNAStar、ProtParam进行开放阅读框的查找和翻
译, 氨基酸序列的组成成分、理化性质分析; 用在
线工具 PSORT、TMHMM 2.0 Server、ProtScale、
SOPMA、SWISS-MODEL 完成蛋白质亚细胞定
位、跨膜结构域、亲水 / 疏水性、二级结构和三
维结构的分析。
6 SmLTP1基因的表达分析
以丹参根、茎、叶的 cDN A 以及黑腐病菌
XC-1 或 MeJA处理不同时间的样品 cDNA为模板
进行实时荧光定量 PCR 反应。进行实时荧光定量
PCR 检测时, 以丹参持家基因磷酸甘油醛脱氢酶
(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, GAPDH)
基因为内参, 检测 SmLTP1 的表达量, 引物见表 1。
反应条件: 95 ℃变性3 min; 95 ℃变性10 s, 60 ℃退
火 25 s, 40 个循环。每个实验 3 个重复。
刘梅等: 丹参非特异性脂质转移蛋白基因(SmLTP1)的克隆及其表达分析 6 5
实验结果
1 SmLTP1基因的克隆与生物信息学分析
1.1 SmLTP1基因的克隆与序列分析
对丹参 EST序列进行 Blast 分析, 获得一个新
的非特异性脂质转移蛋白基因, 命名为 SmLTP1。
从丹参全株cDNA中克隆到SmLTP1, 该基因cDNA
全长 593 bp, 包含 5非翻译区为 38 bp, 3非翻译区
198 bp和一个 357 bp的开放读码框, 编码 118个氨
基酸, gDNA序列与 cDNA序列对比发现该基因不
含内含子(图 1)。该基因已经登入 GenBank, 登入
号为 EF187461。使用 SignalP 3.0预测显示该基因
5端第1~27位具有典型信号肽特征。去除信号肽,
利用 N C B I 的 B l a s t P 在蛋白保守区数据库
(Conserved Domain Database, CDD)对 SmLTP1 基
因编码的蛋白进行蛋白保守区预测, 结果表明, 该
蛋白具有保守的脂质结合基序(lipid-binding motifs)
DRQ (Botton等2002)以及由8个保守的半胱氨酸残
基组成AAL-LTSS超家族保守结构域(图2), 该结构
域是胰蛋白酶和 α- 淀粉酶抑制剂、种子储藏蛋白
以及 nsLTP蛋白所共有的特征。使用ProtParam在
线软件分析 SmLTP1基因编码蛋白的理化性质, 推
测的蛋白质分子量为 11.84 kDa, 等电点 9.08。
1.2 SmLTP1蛋白氨基酸序列的亲水性 /疏水性、
跨膜结构域及亚细胞定位分析
蛋白质的折叠总是倾向于把疏水残基埋藏在
分子的内部, 蛋白质的亲水性/疏水性预测, 为其三
维结构的预测提供了理论参考。利用 ProtScale 预
测 SmLTP1 蛋白氨基酸序列的亲水性 / 疏水性, 结
果显示该蛋白为疏水性蛋白。这点与LTPs含有保
守的8个疏水氨基酸以及其分子内部含有一个可结
合和容纳脂肪酸分子的类似口袋状的疏水结构相符
(Samuel 等 2002; Carvalho 和 Gomes 2007; Salcedo
等 2007)。
跨膜结构域的预测和分析, 有助于正确认识和
理解蛋白质的结构、种类、功能和定位。利用
TMHMM 2.0 Server程序对SmLTP1蛋白的跨膜结
构域进行分析, 结果显示该蛋白无跨膜区域。
LTPs 的细胞内定位也较复杂, 免疫定位研究
表明LTPs存在于细胞壁上, 并发现LTPs可能是一
种分泌型蛋白, LTPs在内质网中形成后全部进入内
质网腔, 并经高尔基体分泌到细胞外, 从而推论
LTPs是一种胞外蛋白(Sossountzor等1991; Sterk等
1991; Kader 1997)。利用PSORT程序对丹参LTP1
蛋白进行定位的结果显示, 该蛋白显示出定位于细
胞外的预测值远大于其他, 这与之前的文献报道一
致(Sossountzor 等 1991; Kader 1996, 1997)。因此,
从信号肽、跨膜结构域和亚细胞定位的预测结果
来看, 本文克隆的 SmLTP1基因编码的是一种分泌
蛋白。
表 1 实时荧光定量 PCR 检测 SmLTP1 基因表达所用引物
Table 1 Primers used for the analysis of the expression level of SmLTP1 by quantitative RT-PCR
基因 扩增产物长度 /bp 引物名称 序列
SmLTP1 170 SmLTP1S 5-TACTTGTCACCGTGCCTCCCATA-3
SmLTP1A 5-GCCTTGCTGAGGTTGATGTTGC-3
GAPDH 183 GAPDHS 5-ACCCTCACGGGGAAGACCATC-3
GAPDHA 5-ACCACGGAGACGGAGGACAAG-3
图 1 SmLTP1 基因 PCR 扩增结果
Fig.1 PCR amplification of SmLTP1 gene
0: Marker DL2000; 1: SmLTP1 基因的 DNA 扩增产物; 2:
SmLTP1 基因的 cDNA 扩增产物; 3: 不加模板的阴性对照。
植物生理学报6 6
1.3 SmLTP1蛋白高级结构的预测
蛋白质的生物功能取决于它的高级结构, 蛋白
质高级结构的预测对于理解其功能有一定的意义。
利用SOPMA程序对SmLTP1蛋白的二级结构进行
预测, 结果显示该蛋白的二级结构由 47.46% 的不
规则卷曲、6.78% 的延伸链、41.53% 的 α- 螺旋
和 4.24% 的 β- 转角构成, 不规则卷曲和 α- 螺旋是
该蛋白二级结构的主要成分。
用 SWISS-MODEL对 SmLTP1蛋白的三级结
构进行预测, 结果表明, SmLTP1 基因编码的蛋白
具有非特异脂质转移蛋白的典型结构, 即4对二硫
键, 4 个 α- 螺旋, 1 个可结合和容纳脂肪酸分子的
类似口袋状的疏水结构(hydrophobic cavity) (图3)。
这符合 I类 nsLTPs蛋白的保守结构特征(Samuel等
2002; Carvalho 和 Gomes 2007; Salcedo 等 2007)。
2 SmLTP1基因的表达分析
以丹参 GAPDH 基因为内参, 进行 SmLTP1 基
因的荧光定量分析, 结果显示, 该基因在丹参的茎
中表达最丰富, 其次是叶中, 根中几乎不表达(图
4)。在 XC-1 菌侵染处理后, SmLTP1 基因表达量
明显上调, 在 48 h 内该基因的表达持续增长(图 5-
A)。在 MeJA 诱导后 SmLTP1 基因表达量也上调,
在检测时间段内, 接种 48 h 后表达量达到最大, 表
达量为对照的近 8 倍(图 5-B)。
图 2 SmLTP1 基因核酸序列及其编码蛋白序列和序列特征
Fig.2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of SmLTP1 gene and its sequence character
A: SmLTP1 基因核酸序列及其编码的蛋白序列。方框内分别为起始和终止密码子; * 表示终止密码子; 划线处为信号肽; 灰色椭
圆阴影表示脂质结合区域; 灰色方框阴影为 8 个半胱氨酸。B: SmLTP1 基因保守结构域。蛋白序列上的数字表示组成 SmLTP1 蛋
白的氨基酸序号; 三角表示组成疏水穴的 20 个氨基酸。
图 3 SmLTP1 蛋白三维结构预测
Fig.3 3-D deduced structure of SmLTP1 protein
刘梅等: 丹参非特异性脂质转移蛋白基因(SmLTP1)的克隆及其表达分析 6 7
图 5 XC-1 菌(A)和 MeJA (B)诱导下 SmLTP1 基因的表达
Fig.5 Expression levels of SmLTP1 induced
by XC-1 (A) and MeJA (B)
水结构使其具有可结合和容纳脂肪酸分子的功能, 4
对二硫键使得该蛋白相对热、化学变性、酶的消
化均很稳定(Samuel 等 2002; Carvalho 和 Gomes
2007; Salcedo 等 2007)。另外, SmLTP1 蛋白 N 端
具有典型信号肽特征, 表明其被合成后可能被运送
或分泌到植物的特定部位执行特殊功能, 参与细胞
的分泌代谢途径(Carvalho 和 Gomes 2007)。
LTP 基因家族各成员有着各自不同的组织特
异性, 从而在不同器官形成功能性的LTP蛋白。近
年来, 对一些植物 LTP 基因表达的研究表明, LTP
基因存在于不同器官的不同细胞内, 如菜豆中发现
的一种 L TP 基因仅在根中专一性表达( Choi 等
1996)。本实验中 SmLTP1 在丹参的茎中表达最丰
富, 其次是叶中, 而根中几乎不表达, 这种在不同器
官中表达量的差异, 预示着其在不同器官中起到的
作用也不尽相同。此外, SmLTP1 仅在茎和叶中表
达可能表示该基因编码的蛋白与丹参抗虫活性相
关。在黑腐病菌XC-1侵染处理后 SmLTP1基因表
达量呈现增长趋势, 在 MeJA 诱导后 SmLTP1 基因
表达量明显上调, 表明 SmLTP1基因可能在植物抵
抗和适应胁迫环境中有着重要的作用。
nsLTPs蛋白基因作为一种能使植物适应生物
与非生物胁迫环境的基因, 对其的研究是十分必要
的。在后续的实验中, 我们可能将其原核表达并
提取该蛋白进行体外实验, 通过在丹参植物体内过
表达和敲除该基因对其功能做更进一步的研究。
参考文献
冯玲玲, 周吉源(2004). 丹参的研究现状与应用前景. 中国野生植
物资源, 23 (2): 4~7
郝岗平, 边高鹏, 张媛英(2006). 泰山白花丹参干叶片高质量 DNA
的提取. 中草药, 37 (6): 855~857
田爱梅, 曹家树(2008). 植物脂质转移蛋白. 细胞生物学杂志, 30:
483~488
汪少芸, 叶秀云, 饶平凡(2004). 植物非特异脂转移蛋白的研究.
生物学通报, 39 (9): 11~13
Arondel V, Vergnolle C, Cantrel C, Kader J-C (2000). Lipid transfer
proteins are encoded by a small multigene family in Arabidopsis
thaliana . Plant Sci, 157 (1): 1~12
Botton A, Begheldo M, Rasori A, Bonghi C, Tonutti P (2002).
Differential expression of two lipid transfer protein genes in
reproductive organs of peach (Prunus persica L. Batsch).
Plant Sci, 163: 993~1000
Boutrot F, Chantret N, Gautier M-F (2008). Genome-wide analysis
of the rice and Arabidopsis non-specific lipid transfer protein
图 4 SmLTP1 基因在丹参不同器官中的表达
Fig.4 Expression levels of SmLTP1 in different
organs of S. miltiorrhiza
讨　　论
本研究从丹参中克隆了非特异性脂质转移蛋
白基因SmLTP1, 其编码的蛋白在结构上具有nsLTPs
的共同特征和典型结构, 其中1个类似口袋状的疏
植物生理学报6 8
(nsLtp) gene families and identification of wheat nsLtp genes
by EST data mining. BMC Genomics, 9: 86
Cameron KD, Teece MA, Smart LB (2006). Increased accumula-
tion of cuticular wax and expression of lipid transfer protein
in response to periodic drying events in leaves of tree tobacco.
Plant Physiol, 140 (1): 176~183
Carvalho AO, Gomes VM (2007). Role of plant lipid transfer
proteins in plant cell physiology—a concise review. Peptides,
28: 1144~1153
Choi D-W, Song J-Y, Oh M-H, Lee J-S, Moon J, Suh S-W, Kim S-
G (1996). Isolation of a root-specific cDNA encoding a ns-
LTP-like protein from the roots of bean (Phaseolus vul-
garis L.) seedlings. Plant Mol Biol, 30 (5): 1059~1066
Hincha DK, Neukamm B, Sror HA, Sieg F, Weckwarth W, Ruckels
M, Lullien-Pellerin V, Schroder W, Schmitt JM (2001). Cab-
bage cryoprotectin is a member of the nonspecific plant
lipid transfer protein gene family. Plant Physiol, 125 (2):
835~846
Jones BL, Marinac LA (2000). Purification and partial character-
ization of a second cysteine proteinase inhibitor from
ungerminated barley (Hordeum vulgare L.). J Agr Food
Chem, 48 (2): 257~264
Jose-Estanyol M, Gomis-Ruth FX, Puigdomenech P (2004). The
eight-cysteine motif, a versatile structure in plant proteins.
Plant Physiol Biochem, 42: 355~365
Kader JC (1975). Proteins and the intracellular exchange of lipids.
I. Stimulation of phospholipid exchange between mitochon-
dria and microssomal fractions by proteins isolated from
potato tuber. Biochim Biophys Acta, 380 (1): 31~44
Kader JC (1996). Lipid-transfer proteins in plants. Annu Rev Plant
Physiol Plant Mol Biol, 47 (1): 627~654
Kader JC (1997). Lipid-transfer proteins: a puzzling family of
plant proteins. Trends Plant Sci, 2: 66~70
Kader JC, Ju lienne M, Vergnolle C (1984). Purification and
characterization of a spinach-leaf protein capable of trans-
ferring phospholipids from liposomes to mitochondria or
chloroplasts. Eur J Biochem, 139: 411~416
Lauga B, Charbonnel-Campaa L, Combes D (2000). Characteriza-
tion of MZm3-3 , a Zea mays tapetum-specific transcript.
Plant Sci, 157: 65~75
Molina A, Garcia-Olmedo F (1997). Enhanced tolerance to bac-
terial pathogens caused by the transgenic expression of bar-
ley lipid transfer protein LTP2. Plant J, 12 (3): 669~675
Pyee J, Yu H, Kolattukudy PE (1994). Identification of a lipid
transfer protein as the major protein in the surface wax of
broccoli (Brassica oleracea) leaves. Arch Biochem Biophys,
311 (2): 460~468
Salcedo G, Sanchez-Monge R, Barber D, Diaz-Perales A (2007).
Plant non-specific lipid transfer proteins: an interface be-
tween plant defence and human allergy. Biochim Biophys
Acta, 1771: 781~791
Samuel D, Liu Y-J, Cheng C-S, Lyu P-C (2002). Solution structure
of plant nonspecific lipid transfer protein-2 from rice (Oryza
sativa). J Biol Chem, 277: 35267~35273
Skinner HB, McGee TP, McMaster CR, Fry MR, Bell RM,
Bankaitis VA (1995). The Saccharomyces cerevisiae
phosphatidylinositol-transfer protein effects a ligand-depen-
dent inhibition of choline-phosphate cytidylyltransferase
activity. Proc Natl Acad Sci USA, 92 (1): 112~116
Sossountzor L, Ruiz-Avila L, Vignols F, Jolliot A, Arondel V,
Tchang F, Grosbois M, Guerbette F, Miginiac E, Delseny M
et al (1991). Spatial and temporal expression of a maize
lipid transfer protein gene. Plant Cell, 3 (9): 923~933
Sterk P, Booij H, Schellekens GA, Van Kammen A, De Vries SC
(1991). Cell-specific expression of the carrot EP2 lipid trans-
fer protein gene. Plant Cell, 3 (9): 907~921
Trevino MB, O’Connell MA (1998). Three drought-responsive
members of the nonspecific lipid-transfer protein gene
family in Lycopersicon pennellii show different develop-
mental patterns of expression. Plant Physiol, 116 (4):
1461~1468
Yeats TH, Rose JKC (2008). The biochemistry and biology of
extracellular plant lipid-transfer proteins (LTPs). Protein
Sci, 17: 191~198