全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (1): 67~74 67
收稿 2011-10-14　　修定 2011-11-09
资助 国家林业公益性行业科研专项(201104024)和国家林业局引
进国际先进农业科学技术计划(“948”项目) (2011-4-54)。
* 通讯作者(E-mail: wxf801@sina.com; Tel: 010-62336114)。
甘蓝型油菜BnGOLS1基因启动子的克隆、序列分析及瞬时表达
景寅, 李煦, 汪晓峰*
北京林业大学林木育种国家工程实验室, 林木花卉遗传育种教育部重点实验室, 北京100083
摘要: 以甘蓝型油菜‘德油五号’基因组DNA为模板, 通过反向PCR扩增得到肌醇半乳糖苷合成酶基因(BnGOLS1)启动子片
段, 长度为827 bp。PLACE和PlantCARE启动子预测工具分析表明: 序列中含有TATA-Box、CAAT-Box等基本转录元件, 以
及ABRE、DRE、HSE、w-Box等顺式作用元件。将克隆得到的BnGOLS1启动子取代pBI121中的CaMV35S启动子, 构建
BnGOLS1启动子控制报告基因的GUS表达载体pBI-GS-GUS, 通过农杆菌介导的方法在油菜组织中进行瞬时表达。GUS染
色结果表明BnGOLS1启动子可以驱动GUS基因在油菜组织中的表达。
关键词: 油菜; BnGOLS1基因启动子; 序列分析; 瞬时表达
Cloning, Sequence Analysis and Transient Expression of BnGOLS1 Gene Pro-
moter from Brassica napus
JING Yin, LI Xu, WANG Xiao-Feng*
Key Laboratory of Genetics and Breeding in Forest Trees and Ornamental Plants of Ministry of Education, National Engineering
Laboratory for Tree Breeding, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China
Abstract: The BnGOLS1 promoter fragment (827 bp) was amplified from the genomic DNA of Brassica napus
by inverse polymerase chain reaction. Promoter sequence analysis by PLACE and PlantCARE showed that the
cloned fragment contained several putative cis-elements, such as abscisic acid response element (ABRE), dehy-
dration-responsive element (DRE), heat shock elements (HSE), WRKY transcription factor recognition site w-
Box and so on, as well as TATA-Box and CAAT-Box. A recombinant vector designated as pBI-GS-GUS was
generated through the replacement of CaMV35S promoter in pBI121 by the cloned BnGOLS1 promoter frag-
ment, in which the reporter GUS is under the control of BnGOLS1 promoter. Transient expression of pBI-GS-
GUS in Brassica napus was performed by Agrobacterium tumefaciens mediated method. Histochemical stain-
ing of GUS revealed that the promoter of BnGOLS1 could drive the expression of GUS gene in Brassica napus.
Key words: Brassica napus; BnGOLS1 promoter; sequence analysis; transient expression
种子成熟脱水是正常性种子发育成熟过程中
的一个必经阶段。正常性种子在发育过程中获得
脱水耐性, 可溶性碳水化合物的积累是种子在发
育和成熟过程中形成脱水耐性的原因之一(Lep-
rince等1993; Wang等2003)。其中, 包括棉子糖、
水苏糖和毛蕊花糖在内的棉子糖系列寡糖(raffino-
se family oligosaccharides, RFOs)在种子发育后期
累积, 持续到种子脱水阶段, 并存在于干燥后仍能
保持活力的组织内, 与种子脱水耐性的获得具有
时空一致性(Horbowicz和Obendorf 1994; Brenac等
1997; Peterbauer和Richter 2001)。大量实验结果表
明, 具有较强脱水耐性的种子在发育过程中大量
积累RFOs, 而不耐脱水的种子发育过程中基本不
积累RFOs (Blackman等1992; Peterbauer等2001)。
肌醇半乳糖苷合成酶(galactinol synthase, GOLS)催
化UDP-Gal上的半乳糖基转移到肌醇分子上, 生成
肌醇半乳糖苷, 作为RFOs生物合成过程中半乳糖
基的唯一供体。因此GOLS被认为是RFOs合成中
的关键酶(Peterbauer等2001)。实验室前期工作表
明, GOLS活性与甘蓝型油菜(Brassica napus L.)种
子的脱水耐性密切相关, 同时油菜BnGOLS基因已
被克隆, 其编码的GOLS酶学性质也通过重组酶得
以阐明(Li等2011)。
基因表达的转录调节在植物生长发育以及对
环境信号的应答反应中起着重要的作用, 是植物
植物生理学报68
分子生物学和植物生理学研究的重点(Le等2010)。
经过多年的研究, 人们已经对植物基因表达的调
节因子及其信号传导途径有了一定的认识。在不
同环境下(如正常器官发育过程、生物与非生物胁
迫等)许多转录因子都可以通过与基因启动子区域
内各类顺式作用元件相互作用而起到调节基因表
达的作用(Suzuki等2011)。因此对特定基因启动子
内所含顺式作用元件的分析就成为了确定基因表
达调控情况所不可缺少的步骤。
油菜作为世界上广为种植的油料作物, 其种
子具有很强的脱水耐性。因此, 在前期工作的基
础上, 研究油菜BnGOLS基因启动子对于深入了解
油菜BnGOLS基因表达调控情况, 以及进一步阐明
油菜种子脱水耐性形成的机理都具有十分重要的
意义。
材料与方法
1 实验材料
植物基因组DNA提取所使用的材料为甘蓝型
油菜(Brassica napus L.) ‘德油5号’ (购自成都德农
正成种子公司); 实验所需分子生物学工具酶购自
TaKaRa公司; pGEM-T载体购自Promega公司; 大
肠杆菌(Escherichia coli) TOP10及根癌农杆菌
(Agrobacterium tumefaciens) EHA105, 植物表达载
体pBI121均由本实验室保存。2-吗啉乙磺酸[2-(N-
morpholino) ethanesulfonic acid, MES]、乙酰丁香
酮(acetosyringone, AS)、X-Gluc (5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-glucoside, 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡
萄糖苷)、卡那霉素(kanamycin, Kan)为INALCO公
司产品, 其余试剂均为国产分析纯产品。
2 方法
2.1 反向PCR模板的制备
将油菜种子置于铺有双层湿润滤纸的培养皿
中, 于25 ℃恒温箱中萌发。剪取萌发后5日龄的油
菜幼苗子叶 , 于液氮中研磨成粉末。提取所得
DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳和紫外吸光光度分
析以确定其纯度、浓度及完整性。
使用多种限制性内切酶(EcoRI、HindIII、
PstI、SacI等)分别消化2 μg油菜基因组DNA, 在内
切酶各自合适的反应温度下酶切3 h。酶切产物用
酚/氯仿抽提, 乙醇沉淀后用适量双蒸水溶解。使
用T4 DNA连接酶进行酶切DNA的自环化, 连接体
系中DNA终浓度为3 μg·mL-1, 16 ℃连接过夜。连
接产物用酚/氯仿抽提, 乙醇沉淀后用适量双蒸水
溶解, 作为反向PCR的模板。
2.2 反向PCR引物的设计
根据本实验室之前所得到的甘蓝型油菜Bn-
GOLS1基因ORF序列(GenBank序列号FJ407183),
在其ORF内部设计两对嵌套的反向PCR引物, 分别
命名为SP1/AP1及SP2/AP2。其序列分别为: SP1:
5-AACTGGGTCTGGTTCTCGGGTGGGTAA-3,
AP1: 5-GGATGTGGTGAATCTGAAGCCGTT-
TAT-3; SP2: 5-GTGGACTGGTGGTGACGGTT-
TA-3, AP2: 5-CGTTTATCTCCGCTCTTACT-
GAA-3。引物结合位点相对位置及方向见图1。
2.3 反向PCR
以DNA自连产物为模板, SP1/AP1为引物进
行第一轮PCR。为提高反应特异性, 采用touch-
down PCR方法, 热循环条件为94 ℃预变性5 min;
94 ℃变性30 s, 68 ℃退火1 min (退火温度每循环
降低0.8 ℃), 72 ℃延伸3 min, 10个循环; 94 ℃变性
30 s, 60 ℃退火1 min, 72 ℃延伸3 min, 25个循环;
72 ℃延伸10 min。将第一轮PCR产物稀释10倍后
作为模板, SP2/AP2为引物进行巢式PCR, 热循环
条件为94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s, 68 ℃退
火1 min (退火温度每循环降低0.8 ℃), 72 ℃延伸3
min, 12个循环; 94 ℃变性30 s, 58 ℃退火1 min, 72
℃延伸3 min, 25个循环; 72 ℃延伸10 min。巢式
PCR产物电泳切胶回收, 片段与pGEM-T载体连接,
转化大肠杆菌, 挑取阳性克隆用于摇菌并提取质
图1 反向PCR引物设计示意
Fig.1 Sketch map of primers for inverse-PCR
两对反向的引物SP1/AP1及SP2/AP2嵌套排列, 通过两轮巢式PCR获得结构基因两侧的序列, 从中分析得出启动子序列。
景寅等: 甘蓝型油菜BnGOLS1基因启动子的克隆、序列分析及瞬时表达 69
粒, 待酶切及PCR验证后测序。
2.4 序列分析
截取反向PCR扩增所得序列中SP2与相应酶
切位点之间的序列, 获得其反向互补序列, 即为油
菜基因组中SP2结合位点上游的序列, 包含部分
BnGOLS1结构基因序列、上游5’-UTR区(untrans-
lated region, 非翻译区)以及启动子区域。其中相
应酶切位点与转录起始位点之间的部分即认为是
BnGOLS1基因启动子区, 其序列用于进一步的分
析。使用植物顺式作用元件数据库PlantCARE
(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plant-
care/html/)及PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/
PLACE/)分析启动子区, 获得BnGOLS1基因启动子
中顺式作用元件信息。
2.5 BnGOLS1启动子分析载体的构建
根据反向PCR所得BnGOLS1基因启动子序列
(GenBank序列号HM003640)设计引物如下:
以油菜基因组DNA为模板进行PCR, 扩增Bn-
GOLS1基因启动子部分序列, 退火温度为59 ℃。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳, 切胶回收略小于1
kb片段(理论长度877 bp), 回收产物经BamHI、
HindIII双酶切, 并纯化酶切产物。
取pBI121质粒进行BamHI、HindIII双酶切,
酶切产物在电泳后, 切胶回收约14 kb大片段。使
用T4 DNA连接酶连接上述启动子小片段及pBI121
BamHI、HindIII双酶切大片段, 连接产物转化大肠
杆菌TOP10感受态细胞, 涂布LB+Kan平板, 37 ℃
倒置培养16 h。挑取阳性菌落, 接种于LB+Kan液
体培养基中, 37 ℃过夜培养, 菌液提取质粒, Bam-
HI、HindIII双酶切验证插入片段大小是否正确。
验证正确的质粒命名为pBI-GS-GUS, 质粒构建过
程见图2。通过液氮冻融法将pBI-GS-GUS载体转
化到农杆菌EHA105中。
2.6 农杆菌介导BnGOLS1启动子载体的瞬时表达
在超净台中切取生长于MS培养基上的油菜
无菌实生苗部分叶片及茎段, 将切下的组织浸泡
于OD600≈0.5的农杆菌(转有pBI-GS-GUS)菌液中,
抽气侵染3 min, 取出组织, 用无菌滤纸吸去多余菌
液, 将侵染后的植物组织放回MS培养基中, 于25 ℃
暗培养2 d。GUS染色方法参考Jefferson等(1987)
所报道的方法进行并稍有改动 , 用以分析Bn-
GOLS1启动子瞬时表达情况: 取出暗培养结束的
植物组织, 用0.1 mol·L-1磷酸缓冲液(pH 7.0)冲洗叶
片3~5次, 将表面附着的农杆菌清洗干净, 用滤纸
吸去多余液体, 放入玻璃小瓶中; 加入GUS染液
[0.1 mol·L-1 pH 7.0磷酸缓冲液, 0.5 mg·mL-1 X-Gluc,
0.5 mmol·L-1 K3Fe(CN)6, 0.5 mmol·L
-1 K4Fe(CN)6,
10 mmol·L-1 EDTA, 0.01% TritonX-100, 0.03%
NaN3]至没过叶片, 抽气15 min; 取出小瓶震荡均
匀, 继续抽气30 min; 待植物组织表面不再产生气
泡, 取出小瓶, 置于37 ℃下避光染色过夜; 将染色
后组织置于70%乙醇中, 37 ℃震荡脱色; 更换数次
乙醇至叶绿素脱除干净, 取出组织, 吸干多余液体,
拍照。
图2 BnGOLS1启动子功能分析载体构建
Fig.2 Construction of BnGOLS1 promoter analysis vector
植物生理学报70
实验结果
1 BnGOLS1基因启动子的克隆
所提取油菜基因组DNA经琼脂糖电泳、分光
光度计检测, 结果显示样品基本无降解, OD260/
OD280比值在1.8~1.9之间, OD260/OD230比值在2以
上, 无明显蛋白、多糖及RNA污染, 可用于后续实
验的油菜基因组DNA作为模板。
反向PCR结果如图3。第一次PCR中产生目的
片段较少, 不能在凝胶染色结果中观察到, 产生的
暗条带多为非特异性扩增所致, 因此有必要进行
巢式PCR。第二次PCR产物中, 以HindIII酶切自连
产物为模板得到了特异的亮条带, 大小约为2 kb
(图3泳道4)。
通过与拟南芥(Arabidopsis thaliana)肌醇半乳
糖苷合成酶基因家族成员的启动子相比较, 可以
发现BnGOLS1与AtGOLS1启动子中顺式作用元件
的分布较为一致, 而与其他成员不同(图5)。拟南
芥AtGOLS基因启动子顺式作用元件信息来自Taji
等(2002)的报道。
3 BnGOLS1启动子分析载体的构建
将启动子片段与pBI121载体均进行BamHI、
HindIII双酶切后连接, 构建由BnGOLS1启动子驱
动报告基因GUS表达的启动子分析载体。重组质
粒PCR验证(877 bp)、HindIII单酶切(14 776 bp)以
及HindIII、EcoRI双酶切(11 726 bp+3 050 bp)验证
均显示插入片段大小符合预期(图6), 成功将pBI121
质粒中驱动报告基因表达的CaMV 35S启动子替
换为BnGOLS1启动子, 重组质粒命名为pBI-GS-
GUS。
4 BnGOLS1启动子瞬时表达结果
将验证正确的pBI-GS-GUS重组质粒转入农
杆菌EHA105, 侵染油菜组织。同时以转化切去
CaMV 35S启动子后自连的pBI121的农杆菌为负
对照(CK), 以转有pBI121质粒的农杆菌为正对
照。侵染后的组织经GUS染色, 结果如图7。实验
结果显示, 负对照由于GUS基因上游缺乏启动子序
列, 侵入植物细胞后不能表达, 不能产生GUS活性,
因此不能分解X-Gluc而显无色。正对照中CaMV
35S启动子可驱动GUS基因在植物营养组织细胞
内高水平表达, 因此叶片、茎段切口处显示较深
的蓝色。而转化pBI-GS-GUS的实验组中, 植物组
织可被染成较浅的蓝色, 显示反向PCR克隆得到的
BnGOLS1上游序列可以在一定程度上驱动下游基
因表达, 具有启动子的功能。
讨　　论
序列分析结果表明, BnGOLS1基因启动子中
含有多个顺式作用元件, 其中包含多个与环境信
号响应相关的元件, 它们可作为转录因子可能的
调控位点。
ABRE (abscisic acid response element)与DRE
(dehydration-responsive element)是两个主要的脱水
信号响应元件, 其核心序列分别为ACGT (Shen等
1993)及A/GCCGACNT (Yamaguchi-Shinozaki和
回收上述2 kb特异条带构建克隆, 质粒经PCR
和酶切验证后进行测序, 获得插入片段的序列。
将测序结果中SP2结合位点与相应酶切位点
之间的序列截取出来, 得到其反向互补序列。比
对表明此序列3端可与BnGOLS1 ORF序列5端部
分匹配, 因此确认所得序列为BnGOLS1基因上游
序列, 其中包含BnGOLS1基因启动子区。将此序
列提交GenBank, 序列号为HM003640。
2 BnGOLS1基因启动子序列的分析
将BnGOLS1基因启动子序列分别提交到Plant-
CARE及PLACE数据库进行分析。结合二者分析
结果, 以明确BnGOLS1基因启动子中顺式作用元
件的分布情况。分析结果表明, BnGOLS1基因启
动子中含有TATA-Box、CAAT-Box等基本转录元
件, 以及ABRE (G-Box)、DRE、HSE、MYCR、
w-Box等顺式作用元件(图4)。
图3 反向PCR产物电泳结果
Fig.3 PCR products of inverse-PCR
M: DL2000 DNA Marker; 1, 3, 5, 7: 第一轮PCR结果, 分别以
EcoRI、HindIII、PstI、SacI酶切自连产物为模板; 2, 4, 6, 8: 第二
轮PCR结果, 分别以EcoRI、HindIII、PstI、SacI酶切自连产物为
模板。
景寅等: 甘蓝型油菜BnGOLS1基因启动子的克隆、序列分析及瞬时表达 71
Shinozaki 1994), 二者分别在ABA (abscisic acid, 脱
落酸)依赖与非ABA依赖的基因诱导表达中发挥作
用。近年来, 也有报道DRE/DREB (DER/DRE
binding protein)系统通过与ABRE/AREB (ABRE/
ABRE binding protein)系统共用信号通路中的元件
而参与到对内源ABA响应的慢速基因表达中(Nar-
usaka等2003)。通常情况下, 启动子中仅存在一个
ABRE元件还不足以使基因的表达明显受ABA的
诱导(Shen和Ho 1995; Shen等1996), 但一个DRE元
件就足以使基因的表达受DREB的调控。Taji等
(2002)报道, 拟南芥中AtGOLS1的表达受ABA影响
较小, 其表达方式与转录因子DREB2的表达方式
相似。BnGOLS1的情况与拟南芥相似, 显示其可
能是通过DRE/DREB系统来对干旱信号进行响应
的, 进而促进种子耐脱水性的形成, 但ABA也可能
在一定程度上诱导其表达。
HSE (heat shock elements)通过与HSF的相互
作用来调节基因表达 , 以实现植物对高温的响
应。如在热诱导条件下, 拟南芥AtGOLS1基因的表
达发生大幅度上调(Panikulangara等2004; Nishiza-
图4 BnGOLS1启动子序列及顺式作用元件
Fig.4 cis-acting elements in BnGOLS1 promoter
植物生理学报72
wa等2008)。真核生物HSE元件的功能区序列为其
核心元件5-nGAAn-3 (或其互补序列5-nCTTn-3)
的串联重复(Barros等1992)。BnGOLS1基因启动子
中有多个HSE元件, 主要集中在-75区与-125区。
近年来人们发现, 除了热诱导外, 高光照、氧化剂
处理等均会引起HSF表达量的上调, 进而通过与
HSE的相互作用影响许多基因的表达, 显示HSE/
HSF (heat shock elements/heat shock factor)系统在
植物对高温、强光照及氧化胁迫的响应中均发挥
了重要作用。抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate per-
oxidase, APX)作为一个重要的抗氧化系统成员, 被
认为在植物抵抗氧化胁迫中发挥着重要作用(Storo-
zhenko等1998)。实验表明, 拟南芥APX基因的启
动子中存在着丰富的HSE元件, 其表达也受到高
图6 pBI-GS-GUS重组质粒验证
Fig.6 Verification of recombinant pBI-GS-GUS
A: 酶切验证。M1: DL15000 DNA Marker; 1: HindIII单酶切
pBI-GS-GUS; 2: HindIII、EcoRI双酶切pBI-GS-GUS。B: PCR扩增
验证。M2: DL2000 DNA Marker; 3: 以pBI-GS-GUS模板扩增插入
的BnGOLS1启动子片段。
图7 BnGOLS1启动子瞬时表达分析
Fig.7 Transient expression assay of BnGOLS1 promoter
图5 BnGOLS1、AtGOLS1、AtGOLS2及AtGOLS3启动子中顺式作用元件排布
Fig.5 Arrangement of cis-acting elements in the promoters of BnGOLS1, AtGOLS1, AtGOLS2 and AtGOLS3
景寅等: 甘蓝型油菜BnGOLS1基因启动子的克隆、序列分析及瞬时表达 73
温、强光照及氧化剂处理的诱导(Panchuk等2002;
Nishizawa等2006)。已有众多证据表明, 高温、强
光照、氧化剂处理以及水分亏缺均会使植物组织
内活性氧水平的增高。而氧化胁迫也会诱导GOLS
基因的表达(Nishizawa等2008; Ishibashi等2011)。
因此猜测BnGOLS1通过HSE/HSF系统的调控参与
到体内活性氧的清除, 降低脱水对植物组织的氧
化损伤, 提高种子对脱水的忍耐力。
w-Box是近年来发现的一类顺式作用元件, 与
其相结合的是WRKY蛋白转录因子家族。这一类
转录因子因其N端含有由WRKYGQK组成的高度
保守的氨基酸序列而得名(Rushton等2010)。以往
所发现的WRKY调控靶基因多是与植物抗病和抗
逆相关的基因。近年来, 许多植物物质代谢和发
育相关基因的表达也发现受到WRKY转录因子的
调控。Wang等(2009)发现复苏植物牛耳草(Boea
hygrometrica)的肌醇半乳糖苷合成酶基因启动子
区域也存在WRKY转录因子调控的靶序列(w-Box,
核心序列为5-TGAC-3或其互补序列5-GTCA-3),
显示WRKY信号通路在GOLS基因表达的调控过
程中起着重要的作用。从克隆得到的油菜Bn-
GOLS1基因启动子的分析结果来看, 其TATA-Box
上游序列中存在着多个w-Box, 作为可能的WRKY
转录因子识别的靶序列。因此WRKY信号转导通
路可能也参与了油菜GOLS基因在种子脱水耐性
获得过程中的差异表达。
除了上述元件以外, BnGOLS1基因启动子区
域中还存在与冷诱导表达相关的MYCR (CA-
CATG), 与胚乳定位表达相关的Skn-1 (GTCAT或
其反向互补序列ATGAC)等一系列顺式作用元
件。以上对BnGOLS1启动子中多种元件的分析结
果表明, BnGOLS1基因可能受多种环境信号的调
控作用, 其启动子活性在本研究中已通过瞬时表
达得以初步证明。为进一步研究BnGOLS1基因启
动子功能, 还需将构建的pBI-GS-GUS植物表达载
体转入拟南芥或油菜中, 获得稳定表达的转基因
植株, 从而深入探究BnGOLS1基因的表达调控情
况、组织定位, 以及其在种子脱水耐性获得过程
中的生物学功能, 相关研究工作正在进行中。
综合以上分析结果, 结合RFOs的生物学功能,
我们认为BnGOLS1可能通过多种途径参与油菜种
子强脱水耐性的形成。一方面 , B n G O L S 1在
ABRE、DRE等元件的作用下受脱水信号的诱导,
直接对种子脱水形成的水分亏缺作出响应; 另一
方面, 在HSE等元件的作用下, 对于种子发育过程
中生成的活性氧信号以及脱水引起的氧化胁迫做
出响应。BnGOLS1基因表达水平上调导致细胞内
肌醇半乳糖苷合成酶活性升高, 合成大量RFOs维
持膜脂等生物大分子的结构, 保持细胞结构和功
能的稳定, 抵抗脱水对细胞造成的伤害, 使种子获
得对脱水的耐性。
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