全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (5): 468~474468
收稿 2010-12-25　　修定 2011-01-12
资助 国家转基因专项(2009ZX08009-081B)。
﹡ 通讯作者 (E-mai l : hqyang@sj tu .edu .cn ; Te l : 021-
34206005)。
水稻OsYDA基因调控气孔发育的功能分析
郑国栋, 杨洪全﹡
上海交通大学农业与生物学院, 上海200240
摘要: 气孔是植物特化的表皮结构, 在植物蒸腾过程和与外界气体交换过程中起到重要作用。拟南芥YDA (AtYDA)是
MAPK级联信号途径中的一种激酶(MAPKKK4), 它在叶片气孔的发育过程中起着负调控的作用。AtYDA功能缺失导致叶
片气孔显著增加, 而表达组成型激活形式的AtYDA (ΔN-YDA)则会导致表皮产生无气孔表型。本研究克隆了水稻中与
AtYDA同源的2个基因OsYDA1和OsYDA2。在拟南芥中过量表达这2个基因都导致了叶片气孔密度的减少和叶片失水速率
的降低。而表达ΔN-OsYDA1和ΔN-OsYDA2的转基因植株则呈气孔系数下降的表型。这表明OsYDA与AtYDA在调控气孔发
育的功能上具有保守性。
关键词: 水稻; 拟南芥; 气孔; YDA
Characterization of Rice OsYDA Gene in Regulating Stomatal Development
ZHENG Guo-Dong, YANG Hong-Quan﹡
School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China
Abstract: Stomata, the specialized structure in plant epidermis, play an important role in transpiration and gas
exchange between plants and the environment. Arabidopsis YDA (AtYDA), a kinase (MAPKKK4) in MAPK
cascade, negatively regulates stomatal development. The loss-of-function mutation of AtYDA leads to signifi-
cant increase in the production of leaf stomata, whereas the expression of constitutively active form of AtYDA
(ΔN-YDA) results in repressed stomatal formation in leaf epidermis. In this study, we cloned two orthologs of
AtYDA in rice, namely OsYDA1 and OsYDA2. Overexpression of either of these genes in Arabidopsis resulted
in a significant decrease in stomatal density and water-loss rate. Likewise, the transgenic Arabidopsis plants ex-
pressing ΔN-OsYDA1 and ΔN-OsYDA2 displayed a dramatically reduced stomatal index phenotype. Taken to-
gether, these results demonstrate a conserved role for OsYDA and AtYDA in regulating stomatal development.
Key words: rice; Arabidopsis thaliana; stomata; YDA
气孔是植物特化的表皮结构, 在植物蒸腾过
程和与外界气体交换过程中起到重要作用。光合
作用是作物产量形成的基础生理过程, 气孔在其
中起着至关重要的作用(王贺正等2005)。因此有
关气孔发育和开度的调控是植物生物学研究的重
要问题之一。
气孔是由2个特化的表皮细胞即保卫细胞组
成的结构, 一般位于植物茎叶等器官的表皮, 植物
通过气孔吸收CO2进行光合作用并有效的防止了
水分的过分蒸发(Hetherington和Woodward 2003;
Pillitteri和Torii 2007)。就气孔分布模式来看, 单子
叶植物如水稻、玉米的气孔成线状与叶脉平行排
列, 双子叶植物如拟南芥的气孔排列没有明显规
律(赵益超等2008)。
在拟南芥中, 一类称为拟分生组织母细胞(mer-
istemoid mother cell, MMC)的表皮原细胞(proto-
dermal cell)经过一次非对称分裂或进入分裂(entry
division)产生一个小的近似三角形的拟分生组织
细胞(meristemoid)和一个称为气孔家系细胞(sto-
matal lineage ground cell, SLGC)的大的子细胞, 这
个过程需要SPCH (SPEECHLESS) (MacAlister等
2007)。拟分生组织细胞具有分裂能力, 在进一步
分化前仍可进行一两轮额外的非对称分裂或扩增
分裂, 同样产生拟分生组织细胞和更多的SLGC,
拟分生组织细胞最终失去分裂能力, 在MUTE的作
用下分化为保卫母细胞(guard mother cell, GMC)
(Pillitteri等2007), GMC通常为椭圆形或圆形。最
后GMC在FAMA、FLP和MYB88的共同作用下进
郑国栋等: 水稻OsYDA基因调控气孔发育的功能分析 469
行一次对称分裂后产生2个高度特化的保卫细胞
(guard cell, GC) (Lai等2005; Ohashi-Ito和Bergmann
2006)。
综上所述, MUTE、SPCH、FAMA等作为转
录因子在气孔的发育中起着重要的正调节作用。
在植物气孔发育过程中也同样存在负调控机制,
如丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein
kinase, MAPK)级联反应途径, 该反应途径在整个
真核生物界是非常保守的, MAPKs在植物中调控
了抗病反应、抗非生物胁迫、激素的信号传导和生
长发育等许多生理过程(Colcombet和Hirt 2008)。
YDA是首先被发现在气孔发育模式形成中发挥作
用的MAPKKK (MAP kinase kinase kinase), 位于
MAPK途径的上游, 是气孔发育中重要的负调控因
子。在拟南芥yda突变体中, 因YDA功能缺失会产
生过多的气孔; 组成型表达YDA植株的气孔数量减
少甚至没有气孔产生, 因为缺失N端的YDA (ΔN-
YDA)具有组成型激酶活性, 在转基因拟南芥植株
中的表达可以完全阻断气孔的产生(Bergmann等
2004)。本研究克隆了水稻的2个与AtYDA同源的
基因, OsYDA1和OsYDA2。通过在拟南芥中过量表
达这2个基因来研究了它们的功能, 结果表明过量
表达OsYDA1和OsYDA2的转基因拟南芥子叶和叶
片的气孔密度减少, 这说明在单子叶植物水稻和
双子叶植物拟南芥的YDA在调控气孔发育的功能
上具有保守性。
材料与方法
1 实验材料
水稻采用粳稻品种‘日本晴’ (Oryza sativa ssp.
japonica cv. Nipponbare)。拟南芥(Arabidopsis
thaliana L.)采用Col-0生态型。
2 水稻基因OsYDA的克隆及转基因质粒构建
将拟南芥AtYDA的氨基酸序列在水稻基因
组数据库(TIGR)中进行比对, 发现Os04g47240和
Os02g44642所编码的蛋白与AtYDA的一致性(iden-
tity)都在60%以上。我们将Os04g47240命名为Os-
YDA1, Os02g44642命名为OsYDA2。根据这2个基
因的序列分别设计了扩增全长cDNA的引物, Os-
YDA1的上下游引物为OsYDA1PstI5 (5 AAACTG-
CAGATGCCACCATGGTGGTGGGGGAAGTCTT
3)和 OsYDA1SpeI3 (5 AAAACTAGTTGGTTAC-
CATGCCTGAGTCCAAG 3), OsYDA2的上下游引
物为OsYDA2PstI5 (5 AGCCTGCAGATGCCAC-
CATGGTGGGGGAAGTCTT 3)和OsYDA2SpeI3
(5 GCTACTAGTGGACCATGGTTGCACCCA-
AGGTG 3), 其中下划线表示相应的限制性内切酶
位点, 下同。用上述引物以‘日本晴’14 d幼苗的基
因组DNA为模板, 通过聚合酶KOD plus (TOYO-
BO)进行PCR扩增, 获得了OsYDA1和OsYDA2的全
长cDNA。将此片断用限制性内切酶PstI和SpeI双
酶切后插入带编码萤火虫荧光素酶(firefly lu-
ciferase, 简称LUC)标签的超表达载体pHB-35-
S::LUC上(Liu等2008), 获得了重组表达载体pHB-
35S::OsYDA1-LUC和pHB-35S::OsYDA2-LUC。用
扩增ΔN-OsYDA1片段的引物OsYDA1XhoI5 (5
GCCTCGAGATGTTACCATGCTTGAGTCCA-
AGGTGT 3)、OsYDA1PacI3 (5 ATTAAT-
TAAAAGTTACCATGCCTGAGTCCAAG 3)和扩
增ΔN-OsYDA2片段的引物OsYDA2XhoI5 (5
C G C T C G A G AT G C C A C C AT G G T G G G G -
GAAGTCTT 3)、 OsYDA2PacI3 (5 GTTAAT-
TAATGACCATGGTTGCACCCAAGGTGT 3), 以
‘日本晴’基因组DNA为模板通过PCR扩增后得到
目的片段, 用XhoI/PacI双酶切后连入含有雌激素
(β-estradiol)诱导启动子XVE与编码黄色荧光蛋白
(YFP)基因的植物表达载体XVE::YFP上(Kang等
2009), 获得了重组表达载体XVE::ΔN-OsYDA1-
YFP和XVE::ΔN-OsYDA2-YFP。用于质粒转化和
扩增的大肠杆菌菌株为DH5α, 用于拟南芥转化的
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株为
GV3101。
3 植株转化及转基因植株检测
3.1 植株转化
利用浸花法(Clough和Bent 1998)将含有pHB-
35S::OsYDA1-LUC、pHB-35S::OsYDA2-LUC、
XVE::ΔN-OsYDA1-YFP和XVE::ΔN-OsYDA2-YFP载
体的GV3101菌液分别转化拟南芥Col-0生态型。
分别利用除草剂和潮霉素对35S::OsYDA1-LUC、
35S::OsYDA2-LUC、XVE::ΔN-OsYDA1-YFP和
XVE::ΔN-OsYDA2-YFP转基因植株进行筛选。获
得的单拷贝插入的纯合T3代材料用于表型分析。
植物生理学报470
野生型及转基因植株均在全日照下培养(光照强度
约为160 μmol·m-2·s-1, 温度约为24 ℃)。
3.2 LUC活性的测定
分别取全日照条件下栽种后10 d的幼苗新鲜
叶片, 称重约0.2 g后速冻, 再将叶片磨碎后用 Lu-
ciferase Assay System (E1500, Promega)定量测定
LUC活性(Liu等2008)。
3.3 拟南芥子叶气孔系数测定
微分干涉显微技术(differential interference
contrast microscope, DIC)用来进行气孔系数定性
和定量分析。光照培养10 d, 此时第2对莲座叶在
叶尖开始变黄后开始取样。子叶放进95%酒精中
脱色, 脱色完全后梯度酒精复水(90%, 75%, 50%,
15%), 吸去酒精加入透明液(甘油:水合氯醛:水=
1:8:1)透明过夜。制片时用透明液作为介质, 使用
Leica DM2500 显微镜观察叶片远轴面。气孔系数
(SI)=气孔数/(气孔数+垫基细胞数)×100% (气孔和
垫基细胞计数来源于Leica DM2500拍摄的照片)。
3.4 失水实验
做失水实验时, 用剪刀从叶柄处取下正常生长
3周拟南芥的第1、2对真叶, 用分析天平称重(精确到
0.1 mg), 并每隔30 min进行一次称重。失水率=(叶
片初始重量–处理后的叶片重量)/叶片初始重量×
100%。
实验结果
1 OsYDA与AtYDA同源性分析
用拟南芥AtYDA的氨基酸序列与水稻基因组
数据库(TIGR)进行比对(图1), 发现OsYDA1和OsY-
DA2所编码的蛋白与AtYDA的一致性分别为71%
图1 OsYDA1、OsYDA2与AtYDA的氨基酸序列同源性比较
Fig.1 Amino acid sequence alignment among OsYDA1, OsYDA2 and AtYDA
图中线框内的序列为构建XVE::ΔN-OsYDA-YFP时缺失的N端序列。
郑国栋等: 水稻OsYDA基因调控气孔发育的功能分析 471
和67%。其中OsYDA1和OsYDA2之间的一致性为
8 2 %。这表明O s Y D A 1和O s Y D A 2与拟南芥
AtYDA之间存在较高同源性。
2 OsYDA1、OsYDA2、ΔN-OsYDA1和ΔN-OsYDA2
过量表达载体的构建与拟南芥转基因植株的鉴定
AtYDA是气孔发育途径的负调控因子, 位于
MAPK级联途径的上游, AtYDA组成型表达会导
致气孔减少(Bergmann等2004)。为了研究OsYDA1
和OsYDA2是否具有与AtYDA类似的功能, 我们构
建了由35S启动子驱动的、分别与荧光素酶编码
基因(LUC)连接的融合基因35S::OsYDA1-LUC和
35S::OsYDA2-LUC, 并通过根癌农杆菌分别转化了
拟南芥野生型Col-0。经筛选分别获得了3个独立
的纯合单拷贝插入的株系(35S::OsYDA1-LUC-3、
11、12和35S::OsYDA2-LUC-3、5、6) (图2-A和
B)。用上述转基因纯合株系T3代小苗叶片进行
LUC活性测定, 发现转基因植株样品中具有显著
的LUC活性, 而在野生型中没有检测到LUC活性
(图2-C和D), 说明OsYDA1-LUC和OsYDA2-LUC
融合蛋白在转基因植株中过量表达。初步的表型
观察发现这些35S::OsYDA1-LUC转基因植株呈现
不同程度的分枝数量增加和植株矮化的表型(图
2-A和B)。进一步对转基因植株的分枝数量进行了
统计分析, 发现35S::OsYDA1-LUC和35S::OsYDA2-
LUC各转基因株系植株的莲座叶分枝数和茎生叶
分枝数都明显多于野生型Col-0 (图2-E和F)。
YDA的N端负调控YDA的活性, 去除N端会使
AtYDA被组成型激活(Lukowitz等2004; Kovtun等
图2 35S::OsYDA1-LUC和35S::OsYDA2-LUC转基因植株的鉴定与表型分析
Fig.2 Identification and phenotypic analyses of 35S::OsYDA1-LUC and 35S::OsYDA2-LUC transgenic plants
A、B: 分别为生长20 d的35S::OsYDA1-LUC和35S::OsYDA2-LUC转基因植株, 比例尺为3 cm; C、D: 2种转基因植株生长10 d幼苗叶
片LUC的检测, 数据为平均数±标准差(n=12); E、F: 2种转基因成熟植株的莲座叶分枝和茎生叶分枝统计, 数据为平均数±标准差(n=20); G:
XVE::ΔN-OsYDA1-YFP转基因植株经雌激素(20 µmol·L-1 β-estradiol)诱导10 d后YFP观察, 其中a、b分别是转基因植株在黄色荧光(YFP)和
白光通道(BF)下的观察, c、d是经相同诱导处理后Col-0的观察结果, 比例尺为20 µm。
植物生理学报472
2000)。我们构建了受雌激素诱导的诱导型启动子
XVE驱动的缺失N端的OsYDA (ΔN-OsYDA) (图1)
与YFP基因的融合基因(XVE::ΔN-OsYDA-YFP), 并
通过根癌农杆菌转化拟南芥野生型Col-0。经筛
选分别获得了3个独立的纯合单拷贝插入的株系
(XVE::ΔN-OsYDA1-YFP-1、2、7和XVE::ΔN-
OsYDA2-YFP-1、4、7)。将转基因纯合株系的幼
苗经过20 µmol·L-1雌激素(β-estradiol)诱导处理后,
通过激光共聚焦显微镜可观察到其叶片表皮细胞
的YFP荧光[图2-G (a)], 同一株系幼苗用20 µmol·L-1
DMSO进行处理则观察不到YFP荧光(结果未显
示), 而野生型Col-0的幼苗无论是经雌激素处理[图
2-G (c)]还是DMSO处理都都观察不到YFP荧光, 表
明ΔN-OsYDA1-YFP以及ΔN-OsYDA2-YFP融合蛋
白在转基因幼苗中能被雌激素诱导表达。
3 OsYDA1、OsYDA2、ΔN-OsYDA1和ΔN-
OsYDA2在拟南芥中的过量表达导致气孔系数的
降低
通过对在光照条件下生长10 d的幼苗子叶下
表皮气孔的显微观察, 发现35S::OsYDA1-LUC和
35S::OsYDA2-LUC转基因植株幼苗子叶的成熟气
孔比例较Col-0明显降低(图3-A); 经雌激素诱导的
XVE::ΔN-OsYDA1-YFP的转基因植株幼苗子叶的
成熟气孔明显少于Col-0 (图3-B)。进一步通过气
孔系数(SI)的统计分析, 证明了这些转基因植株的
子叶SI明显低于Col-0 (图3-C~F)。
4 OsYDA在拟南芥中的过量表达导致植株离体叶
片失水率的降低
气孔在植物蒸腾过程和与外界气体交换过程
中起重要作用, 气孔系数的减少可能会减慢植物
图3 35S::OsYDA-LUC和XVE::ΔN-OsYDA-YFP转基因植株气孔表型分析
Fig.3 Stomatal phenotypes of 35S::OsYDA-LUC and XVE::ΔN-OsYDA-YFP transgenic plants
A: 全日照条件下35S::OsYDA-LUC转基因植株正常生长10 d幼苗子叶气孔观察; B: 全日照条件下XVE::ΔN-OsYDA-YFP转基因植株经
雌激素(20 µmol·L-1 β-estradiol)诱导后10 d幼苗子叶气孔观察; C~F:分别为转基因植株气孔系数SI的统计, 数据为平均数±标准差(n=12)。
比例尺为20 µm。
郑国栋等: 水稻OsYDA基因调控气孔发育的功能分析 473
的蒸腾过程。我们分析了35S::OsYDA1-LUC株系
离体叶片的失水情况, 结果表明相对于Col-0失水
率, 35S::OsYDA1-LUC转基因植株的失水率显著降
低(图4), 这一结果与气孔系数的统计结果一致, 表
明过量表达OsYDA能增强转基因植株叶片的保水
能力。
讨　　论
禾本科植物与双子叶植物的气孔发育存在明
显差异。在单、双子叶植物气孔发育通路的关键
因子FAMA、MUTE和SPCH中, 只有FAMA的功能
相对比较保守, 而MUTE和SPCH在功能方面则存
在一些差异(Liu等2009)。水稻中OsFAMA功能缺
失后, 叶片不会出现成熟的保卫细胞, 并且其气孔
的线性分布和气孔形态与野生型出现很大的不同,
气孔的形态也不是野生型的哑铃型而是长盒型
(Liu等2009)。这意味着水稻的OsFAMA是其气孔
发育分化所必需的, 并且AtFAMA的启动子驱动的
OsFAMA能部分恢复fama突变体的表型。这些都
表明, FAMA促进分化形成GC的功能在单、双子
叶植物中都是保守的。前人研究发现(Liu等2009),
OsMUTE和OsSPCH (OsSPCH1和OsSPCH2)表达
的时空性与AtMUTE和AtSPCH都有着明显的差
异。在表型回复实验中, AtMUTE的启动子驱动的
OsMUTE可部分回复拟南芥mute突变体的表型, 而
AtSPCH的启动子驱动的OsSPCH不能回复spch的
表型。功能分析发现OsSPCH在水稻气孔发育的
早期发挥的功能与AtSPCH不完全一样。在拟南芥
中过量表达AtSPCH能导致大量的异位不对称分
裂, 而在拟南芥中过量表达OsSPCH2具有该作用,
OsSPCH1却没有这个功能。本研究表明, 水稻中
存在2个与AtYDA同源的基因OsYDA1和OsYDA2,
它们在气孔发育方面存在着与AtYDA相类似的功
能, 即负调节气孔的发育。这说明YDA的功能在
单、双子叶植物中具有保守性。过量表达OsYDA1
和OsYDA2会导致拟南芥的分枝数量的增加, 有关
OsYDA在水稻中的作用机制分析正在进行之中。
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图4 35S::OsYDA1-LUC转基因植株离体叶片的失水率分析
Fig.4 Water-loss rate of explant leaves of 35S::OsYDA1-LUC
transgenic plants
叶片从植株上取下开始计时, 每隔30 min将叶片称重, 同种基
因型的植物以5~8片叶片为一组进行称量, 一共称量3组, 以这3组数
据求平均值和标准差。本图为3次重复实验其中一次实验的数据。
植物生理学报474
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