全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (3): 253~258 253
收稿 2012-12-14　　修定 2013-01-28
资助 国家“973”计划项目(G1999016000)。
* 通讯作者(E-mail: zy021208@163.com; Tel: 0451-82456373)。
转柽柳和星星草双价金属硫蛋白基因烟草对Cd2+和Cu2+的抗性分析
张艳1,2,3,*, 杨传平4
1黑龙江省教育学院, 哈尔滨150080; 2东北林业大学博士后流动站, 哈尔滨150040; 3黑龙江省农业科学院博士后工作站, 哈
尔滨150086; 4东北林业大学林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室, 哈尔滨150040
摘要: 金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于生物中的低分子量、富含半胱氨酸且可结合重金属的蛋白质, 在土壤重金属污染
的治理中发挥重要作用。将从柽柳和星星草cDNA文库中克隆的MT基因构建在同一植物表达载体pRCXM上, 通过农杆菌
介导的叶盘法转化烟草‘龙江911’, 获得了抗卡那霉素的转基因植株。PCR-Southern和Northern blot检测证明双价MT基因已
整合进烟草基因组中并可正常表达。抗性试验证明双价MT基因的转入提高了转基因烟草对Cd2+和Cu2+的抗性, 转基因烟
草分别能在300 µmol·L-1 Cd2+或150 µmol·L-1 Cu2+的胁迫下正常生长。本研究结果对通过基因工程技术培育植物修复新品
种提供了理论基础。
关键词: 金属硫蛋白; 星星草; 柽柳; 烟草
Ectopic Expression of Two Metallothionein Genes Enhances Tolerance to Cd2+
and Cu2+ in Tobacco (Nicotiana tabacum L.)
ZHANG Yan1,2,3,*, YANG Chuan-Ping4
1Heilongjiang College of Education, Harbin 150080, China; 2Station of Postdoctor, Northeast Forestry University, Harbin
150040, China; 3Station of Postdoctor, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086, China; 4Key Laboratory
of Forest Tree Genetic Improvement and Biotechnology, Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin 150040,
China
Abstract: Metallothionein (MT) is a low molecular weight, cysteine-rich, and heavy metal-binding protein. MT
plays important roles in controlling heavy metal pollution of soil. Two MT genes from Tamarix androssowii and
Puccinellia tenuiflora were cloned into the same vector pRCXM. Kanamycin-resistant transgenic tobacco (Nico-
tiana tabacum ‘Longjiang 911’) plants were obtained using Agrobacterium-mediated gene transferring method.
PCR-Southern and Northern blot analysis indicated that two MT genes were indeed integrated into the tobacco
genome and expressed in tobacco. Resistance tests proved that the expression of two MT genes enhanced toler-
ance to Cd2+ and Cu2+ in tobacco. The transgenic plants can live in the medium with 300 µmol·L-1 Cd2+ or 150
µmol·L-1 Cu2+. Our study provides theoretical references for cultivating new varieties of phytoremediation by
genetic engineering technology.
Key words: metallothionein; Puccinellia tenuiflora; Tamarix androssowii; tobacco (Nicotiana tabacum)
金属硫蛋白(metallothionein, MT)是一类低分
子量(6 000~7 000 Da)、富含半胱氨酸、不含组氨
酸和芳香族氨基酸且具有金属结合能力的非酶多
肽。1957年, 动物MT在马肾细胞中首次被发现
(Margoshes和Vallee 1957)。1982年, 植物MT在大
豆根中发现(Casterline和Barnett 1982)。与动物MT
相比, 植物MT发现较晚, 由于其活性巯基含量较
高, 易被氧化破坏, 因此分离、纯化非常困难。一
般认为, 植物MT在转运重金属并解除其毒性、调
节微量必需金属的体内稳态及参与多种胁迫抗性
的形成和活性氧清除等方面起作用(代勋和龚明
2011), 其中研究最多的是MT对重金属的解毒能
力。Thomas等(2003)、Lee等(2004)、Grispen等
(2009)相继证明转入外源MT基因有助于提高植物
对重金属的抗性, 但目前的研究多集中在将单一
MT基因转入不同的植物, 而转双价MT基因的报道
还不多见。柽柳是抗干旱和耐盐碱能力极强的沙
漠植物, 星星草是盐碱化草地上的优势植物, 也具
有较强的耐盐碱能力, 本实验室在研究二者的抗
逆性时, 从cDNA文库分别克隆了柽柳和星星草的
植物生理学报254
MT基因, 本研究将柽柳和星星草双价MT基因导入
烟草, 获得了对Cd2+、Cu2+具有较高耐受力的转基
因植株。
材料与方法
植物表达载体pROKII由张慧教授惠赠; 大肠
杆菌感受态TOP10购自德美生物技术有限责任公
司; 农杆菌EHA105、烟草(Nicotiana tabacum L.) ‘龙
江911’为东北林业大学林木遗传育种实验室提供。
根据柽柳(Tamarix androssowii L.)和星星草
(Puccinellia tenuiflora L.) MT基因cDNA序列, 设计
并合成引物, 以文库质粒为模板, 分别从柽柳和星
星草cDNA文库扩增MT基因。柽柳MT基因引物:
5′引物, 5′-CCTCTAGAGCAAAAATGTCTTCTT-
GTGGAGGAAGT-3′; 3′引物, 5′-ATGGTACCCG-
GGGATCCAGATGCAAATCGATGGCATATGAT-
TAA-3′。星星草MT基因引物: 5′引物, 5′-CCTC-
TAGATGCCGATTCGGCACGAGGGTAATCT-
CA-3′; 3′引物, 5′-ATGGTACCTGCAGCTTAA-
CAGTTGCAAGGGTTGCA-3′。PCR反应条件为:
94 ℃变性30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 30
个循环; 最后72 ℃延伸7 min。将PCR产物进行琼
脂糖凝胶电泳检测。
将柽柳、星星草MT基因分别克隆到载体
pROKII上, 并将重组质粒命名为pRCM和pRXM。
以pRXM为模板, PCR扩增包含P35S启动子和星星
草MT基因约1 089 bp序列。将PCR扩增产物定向
克隆到重组质粒pRCM中, 构建的植物双价表达载
体命名为pRCXM (图1)。
用电击法将植物双价表达载体pRCXM导入
农杆菌EHA105中, 通过农杆菌介导的叶盘法转化
烟草‘龙江911’, 用卡那霉素(Kan)进行筛选, 得到再
生植株。
PCR及PCR-Southern分析时, 以CTAB法提取
的转基因烟草和对照烟草叶片总DNA为模板, 进
行PCR扩增。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离
后转至尼龙膜上, 用DIG探针合成试剂盒(Roche公
司), 分别标记柽柳、星星草MT基因cDNA为探针,
进行杂交。用DIG CDP-StarTM化学发光检测试剂
盒(Roche公司)检测杂交条带。
Northern blot分析时, 用SDS法提取转基因烟
草和对照烟草叶片的总RNA, 取20 µg总RNA在
65 ℃变性5 min, 经1%甲醛变性胶电泳分离后转至
尼龙膜上进行Northern杂交, 探针标记方法及杂交
程序与上述Southern杂交相同。
检测转基因烟草对Cd2+和Cu2抗性时, 将转基
因烟草和对照烟草的无根幼苗分别移到含Cd2+ (浓
度为0、100、200和300 µmol·L-1)或Cu2+ (浓度为
0、75、150和225 µmol·L-1)的MS生根培养基中,
每个株系每个浓度选30棵植株, 放在(26±1) ℃、40
µmol·m-2·s-1光强、16 h光照/8 h黑暗条件下培养,
20 d后统计组织培养苗的生根情况, 50 d后观察其
生长状况并测量其鲜重和株高。
用SPSS软件进行数据分析。
实验结果
1 PCR扩增柽柳和星星草MT基因
PCR扩增的柽柳MT基因为513 bp, 包括柽柳
MT基因开放读码框(MTcl) 256 bp及3′非翻译区终止
序列(Tcl); PCR扩增的星星草MT基因(MTxx)为289
bp, 包括上游–45~–35 bp处一个金属应答元件
(MRE)序列TGCCGATTCGG (图2)。
2 转基因烟草的PCR和PCR-Southern检测
PCR检测7株转基因烟草及对照烟草, 结果表
明, 用柽柳MT基因特异引物进行扩增可获得256
bp的目的条带, 用星星草MT基因特异引物进行扩
增可获得289 bp的目的条带, 7株转基因烟草均扩
增出与阳性质粒对照大小一致的产物, 而对照烟
草则没有扩增出目的片段(图3)。
为进一步明确扩增产物是否为目的基因片段,
图1 载体pRCXM的构建
Fig.1 Construction of vector pRCXM
张艳等: 转柽柳和星星草双价金属硫蛋白基因烟草对Cd2+和Cu2+的抗性分析 255
分别用柽柳和星星草MT基因标记的探针对7株转
基因烟草进行PCR-Southern杂交。图4显示, 7株转
基因烟草均有杂交带, 证明PCR扩增得到的片段的
确是柽柳和星星草MT基因的扩增产物, 双价MT基
因已整合到烟草基因组中。
3 转基因烟草Northern blot检测
对PCR-Southern杂交中表现为阳性的5株转
基因烟草进行了Northern blot杂交检测。结果表
明, 转基因烟草中的外源基因都有表达, 但表达量
不同(图5)。
4 转基因烟草对Cd2+的抗性分析
非Cd2+胁迫下, 转基因烟草和对照烟草均能正
常生根。当Cd2+浓度为100 µmol·L-1时, 对照烟草
生根率降为80%, 而转基因烟草除T0-9外全部生根;
Cd2+浓度为200 µmol·L-1, 转基因烟草生长情况良
好(图6), 生根率达到60%~90%, 而对照仅为30%;
Cd2+浓度为300 µmol·L-1, 对照烟草不能生根, 转基
因烟草平均生根率为40%, 明显优于对照(表1)。
根据转基因烟草及对照烟草在不同浓度Cd2+胁迫
下的生根情况, 确认双价MT基因的转入提高了转
基因烟草对Cd2+的耐受性。
图7显示, 在含不同Cd2+浓度的MS生根培养基
中培养50 d的转基因烟草及对照烟草的鲜重和株
高, 在非Cd2+胁迫下差异不大, 生长量基本一致。
随着Cd2+浓度的提高, 转基因烟草的鲜重和株高均
高于对照, Cd2+浓度为100 µmol·L-1时, 转基因烟草
的平均鲜重高于对照15%, 平均株高高于对照
9.7%; Cd2+浓度为200 µmol·L-1, 转基因烟草平均鲜
重高于对照169%, 平均株高高于对照71.6%, 其中
生长最好的T 0-6, 其鲜重和株高分别比对照高
图2 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR product
1: 柽柳MT基因; 2: 星星草MT基因; 3: 阴性对照; 4: M: DNA分
子量标准。
图3 转基因烟草的PCR检测
Fig.3 Identification of PCR products of
transgenic tobacco plants
1和2: 对照烟草(阴性对照); 3~16: 转基因烟草T0-1~T0-7; 17和18:
pRCXM质粒(阳性对照); 19: 水(对照); 20: M: DNA分子量标准。
图4 转基因烟草的PCR-Southern杂交检测
Fig.4 PCR-Southern blot analysis of transgenic tobacco plants
A: 柽柳MT基因标记的探针杂交结果; B: 星星草MT基因标记
的探针杂交结果。1: 水(对照); 2: pRCXM质粒(阳性对照); 3: 对照
烟草(阴性对照); 4~10: 转基因烟草株系T0-1~T0-7。
图5 转基因烟草的Northern blot杂交检测
Fig.5 Northern blot analysis of transgenic tobacco plants
A: 柽柳MT基因标记的探针杂交结果; B: 星星草MT基因标记
的探针杂交结果。1: 非转基因烟草; 2~6: 转基因烟草T0-1~T0-5。
植物生理学报256
266%和115.1%; Cd2+浓度为300 µmol·L-1, 转基因烟
草平均鲜重高于对照133%, 平均株高高于对照
109.5%。结果表明, 随着Cd2+浓度的提高, 转基因
烟草由于双价MT基因的超量表达, 不同程度地提
高了它们的耐Cd2+性。
5 转基因烟草对Cu2+的抗性分析
在非Cu2+胁迫下, 转基因烟草和对照烟草生根
率均达到100%; 在Cu2+浓度为75 µmol·L-1时, 转基
因烟草平均生根率为94%, 而对照烟草仅为70%;
Cu2+浓度为150 µmol·L-1, 转基因烟草生长较好(图
8), 生根率为30%~60%, 而对照烟草则不能生根;
Cu2+浓度为225 µmol·L-1, 转基因烟草平均生根率
降到7% (表2)。可见, 双价MT基因的转入提高了
转基因烟草对Cu2+的耐受性, 同时表明Cu2+对烟草
表1 Cd2+胁迫下T0代转基因烟草的生根率
Table 1 Root proliferation rate of T0 generation transgenic
tobacco plants under Cd2+ stress
%

株系 个体数/株
Cd2+浓度/µmol·L-1
0 100 200 300
对照 30 100 80 30 0
T0-1 30 100 100 60 50
T0-2 30 100 100 60 20
T0-3 30 100 100 80 50
T0-4 30 100 100 90 50
T0-5 30 100 100 70 30
T0-6 30 100 100 80 60
T0-7 30 100 100 60 40
T0-8 30 100 100 70 20
T0-9 30 100 90 60 30
的生根抑制作用较强。
对在含不同浓度Cu2+的生根培养基中培养50
d的转基因烟草及对照烟草进行鲜重和株高分析,
结果表明, 在非Cu2+胁迫下, 转基因烟草与对照烟
草的生长量基本一致; 3种Cu2+浓度(75、150和225
µmol·L-1)胁迫下, 转基因烟草的平均鲜重分别高于
对照17%、333%和129%, 平均株高分别高于对照
9.8%、182%和111.9%; 其中生长最好的T0-1在150
图6 T0代转基因烟草在Cd
2+浓度为200 µmol·L-1
MS中的生长情况
Fig.6 Growth assay of T0 generation transgenic tobacco plants
on MS medium with 200 µmol·L-1 Cd2+
1: 对照烟草; 2: 转柽柳MT基因烟草; 3: 转柽柳和星星草双价
MT基因烟草。
图8 T0代转基因烟草在Cu
2+浓度为150 µmol·L-1
MS中的生长情况
Fig.8 Growth assay of T0 generation transgenic tobacco plants
on MS medium with 150 µmol·L-1 Cu2+
1: 转柽柳和星星草双价MT基因烟草; 2: 转柽柳MT基因烟草;
3: 对照烟草。
图7 Cd2+胁迫下T0代转基因烟草与对照烟草的鲜重和株高
Fig.7 Fresh weight and height of T0 generation transgenic
tobacco plants and non-transgenic tobacco
plant under Cd2+ stress
同一测定项目数值标有不同小写字母表示在α=0.05水平上差
异显著。
张艳等: 转柽柳和星星草双价金属硫蛋白基因烟草对Cd2+和Cu2+的抗性分析 257
µmol·L-1 Cu2+胁迫下, 鲜重高于对照411%, 株高高
于对照266% (图9)。可见, 随着Cu2+浓度的提高,
对照烟草的生长明显减弱, 而转基因烟草的鲜重
和株高明显高于对照, 说明转基因烟草由于双价
MT基因的超量表达不同程度地提高了它们的耐
Cu2+性。
讨　　论
目前 , 已在水稻、玉米、小麦、大豆、花
生、棉花、番茄、腊梅等几十种植物中发现并克
隆了MT基因。研究表明, MT基因的表达具有可诱
导性, 它受重金属离子、胁迫、损伤、热激、激
素等多种因素的影响 , 并且诱导发生在转录水
平。MT基因的上游存在多种转录调节元件, 如
MRE、糖皮质激素效应元件(GRE)等, 这些调控元
件协调作用是MT基因高效表达和受多因素诱导的
基础(张艳和杨传平2006)。在豌豆、番茄和花旗
松等(Evans等1990; Whitelaw等1997; Chatthai等
2004)植物的MT基因上游均发现了上述调控元件,
本实验室克隆的星星草MT基因5非翻译区–45~
–35 bp处也包含一个MRE。
我国受重金属污染的耕地面积已达2 000万公
顷, 占全国总耕地面积的1/6。植物修复技术是整
治土壤重金属污染的重要手段之一, 尤其是MT超
强的金属结合特性已成为研究热点。重金属中Cu
是植物生长发育必需的微量元素, Cd是植物的非
必需元素, 也是生物毒性最强的重金属之一, Cd和
过量Cu都会对植物造成毒害, 研究表明将MT基因
转入植物会不同程度地提高转基因植物对Cd和Cu
的耐受性。张晓钰等(2000)发现, 转小鼠MTs突变
体αα烟草可在含300 μmol·L-1 Cd2+的培养基中正常
生长。Thomas等(2003)获得的转酵母MTs基因
CUP1的烟草幼苗叶片累积了高于对照2~3倍的Cu,
可在Cu含量较高的沙地上生长。张海燕等(2006)
将大蒜AsMT2b基因转到拟南芥中过表达, 结果显
示拟南芥抗Cd性明显提高, 积累量增加。我们在
前期的工作中, 将柽柳MT基因转入烟草, 在Cd2+抗
性试验中发现转基因烟草能在Cd 2+浓度为200
µmol·L-1条件下生长(张艳等2007), 而本研究获得
的转柽柳和星星草双价M T基因烟草能在3 0 0
µmol·L-1 Cd2+浓度下正常生长, 说明双价MT基因比
单价MT基因更能提高转基因烟草对Cd2+的耐受力,
但并不成倍数增长关系。在Cu2+胁迫试验中, 转双
价MT基因烟草能在150 µmol·L-1 Cu2+浓度下正常
图9 Cu2+胁迫下T0代转基因烟草的鲜重和株高
Fig.9 Fresh weight and height of T0 generation transgenic
tobacco plants and non-transgenic tobacco
plant under Cu2+ stress
同一测定项目数值标有不同小写字母表示在α=0.05水平上差
异显著。
表2 Cu2+胁迫下T0代转基因烟草的生根率
Table 2 Root proliferation rate of T0 generation transgenic
tobacco plants under Cu2+ stress
%

株系 个体数/株
Cu2+浓度/µmol·L-1
0 75 150 225
对照 30 100 70 0 0
T0-1 30 100 100 60 20
T0-2 30 100 90 40 0
T0-3 30 100 80 30 0
T0-4 30 100 100 50 20
T0-5 30 100 100 40 0
T0-6 30 100 90 30 0
T0-7 30 100 100 40 10
T0-8 30 100 100 40 10
T0-9 30 100 90 30 0
植物生理学报258
生长, 而对照烟草只能在75 µmol·L-1 Cu2+浓度下生
长, 说明双价MT基因的转入提高了植物对Cu2+的
抗性, 同时发现Cu2+对烟草生长的抑制作用更强。
本研究结果对通过基因工程技术培育植物修复新
品种提供了理论基础。
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