全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (2): 129~135 129
收稿 2010-10-12 修定 　2010-11-08
资助 国家自然科学基金(30871389)和辽宁省教育厅重点实验
室项目(LS201009 3)。
* 通讯作者(E-mail: skyliqiuli@163.com; Tel: 0411-84258681)。
植物非生物胁迫诱导启动子顺式作用元件的研究方法
郑晓瑜 1, 郭晋艳 1, 张毅 2, 李秋莉 1,*
1 辽宁师范大学生命科学学院, 辽宁大连 116029; 2 大连市育明高级中学, 辽宁大连 116023
摘要: 非生物胁迫严重影响植物生长发育, 降低作物产量。植物通过各种途径忍受或抵抗非生物胁迫, 主要表现是各种抗
非生物胁迫基因的表达。基因表达受其上游启动子及转录因子的调控, 目前对抗非生物胁迫诱导启动子顺式作用元件及转
录因子的研究成为热点。本文综述了植物非生物胁迫诱导启动子顺式作用元件及转录因子的研究方法, 并展望了顺式作用
元件及转录因子研究的方向及前景。
关键词: 非生物胁迫; 启动子; 顺式作用元件; 转录因子
Research Methods of cis-Acting Elements in Plant Abiotic Stress Inducible Promoters
ZHENG Xiao-Yu1, GUO Jin-Yan1, ZHANG Yi2, LI Qiu-Li1,*
1College of Life Sciences, Liaoning Normal University, Dalian, Liaoning 116029, China; 2Dalian Yuming Senior High School,
Dalian, Liaoning 116023, China
Abstract: Abiotic stress seriously affects plant growth and development, reduces crop yields. Plants endure or
resist abiotic stress via many ways, mainly by expressing abiotic stress-induced genes. Gene expression is
regulated by upstream promoter and transcription factors. Abiotic stress-induced promoter cis-acting element
and transcription factors become one focus of study now. This paper reviews the research methods of plant
abiotic stress inducible promoter cis-acting elements and transcription factors and looks into their prospect.
Key words: abiotic sterss; promoter; cis-acting elements; transcription factors
植物非生物胁迫是指对植物施加有害的环境
因子, 主要有高盐、干旱、低温等。非生物胁迫
会影响植物生长发育, 严重降低作物产量。植物
为了生存, 在遭遇非生物胁迫时, 必须通过形态及
生理生化代谢等方面的调整, 以适应或忍耐环境胁
迫。近年来的研究表明, 许多植物基因的表达都
受逆境胁迫的诱导, 抗逆基因的表达又是依靠其上
游启动子的调控来实现的。启动子是起始基因转
录的一段 DNA 序列, 是基因表达调控的关键点。
启动子中存在着很多顺式元件, 可分为以下4种类
型: (1)核心启动子成分, 如 TATA 框; (2)上游启动
子成分, 如 CAAT 框、GC 框、ATF 结合位点; (3)
远端上游元件: 如增强子、沉默子等; (4)特殊启动
子成分, 该成分为不同的转录因子识别和结合来调
节转录。其中特殊启动子成分在植物非生物胁迫
诱导基因的表达中起主要作用。
目前有关植物调控逆境胁迫的研究重点逐渐
从功能基因转到顺式作用元件的鉴定、功能分析
及转录因子的分离等方面。精确定位关键功能区
和调控区对研究启动子的调控很重要, 因为不同基
因启动子间有很大的变异性, 启动活性大小也有差
别。研究顺式作用元件及转录因子既可以从分子
水平探讨胁迫诱导基因表达的机制, 又可以为利用
启动子进行作物遗传改良提供新的策略。
研究启动子顺式作用元件及转录因子通常是
先确定启动子的功能区段, 然后分析功能区段中的
功能元件, 最后分离与功能元件相互作用的转录因
子。常采用的方法有: 生物信息学分析与预测、
突变分析法、凝胶阻滞分析法、DNA 足迹分析
法、酵母单杂交法等(图 1)。这几种方法并不是
单独存在的, 而是根据具体研究中的不同需要, 有
选择地交叉使用。本文介绍顺式作用元件及转录
因子的研究方法及其在植物非生物胁迫诱导启动
子顺式作用元件研究中的应用。
1 生物信息学分析与预测
生物信息学分析与预测是目前研究启动子最
常用的方法。获得启动子序列后, 首先通过生物信
息学方法对启动子序列进行初步的预测和分析, 分
植物生理学报130
析序列中含有的可能的相关顺式作用元件。目前
常用的植物启动子预测相关数据库和软件资源有下
面 5 个。(1) EPD (eukaryotic promoter database): 真
核生物启动子数据库, 这是目前惟一一个源自实验
数据的真核生物启动子数据库, 该库现有 1 500 多
个启动子序列数据, 是常用的预测软件测评的手段
之一; (2) TRRD (transcription regulatory regions
database): 转录调控区域数据库, 是在不断积累的
真核生物基因调控区结构与功能特性信息基础上构
建的, 其数据均来源于已发表的科学论文, 包含特
定基因各种结构与功能特性, 包括转录因子的结合
位点, 启动子、增强子、沉默子的位置, 以及基
因表达调控模式等; (3) TRANSFAC (transcriptional
regulation from patterns to profiles): 转录因子数据
库, 这是一个真核顺式作用元件和反式作用因子的
数据库, 数据搜集的对象包括从酵母到人类, 该库
由 SITE、GENE、FACTOR、CLASS、MATR
IX、CELLS、METHOD 和 REFERENCE 等数据
表构成; (4) PLACE (plant cis-acting regulatory DNA
elements): 植物DNA顺式作用调控元件数据库, 只
包括维管植物的信息, 其他与植物顺式作用元件同
源的非植物模体也同时被收录, 并且所收录信息根
据实验最新进展随时得到更新; (5) PlantCARE (plant
cis-acting regulatory elements): 植物顺式作用调控
元件数据库, 该数据库收录了植物顺式作用元件、
增强子和抑制子, 并提供调控元件的位置、一致序
列和在特异启动子序列上的独立位点等信息。各
数据库网址见表 1。
杨英军和周鹏(2005)采用 PCR 技术从番木瓜
(Carica papaya)基因组中克隆了 proteinase omega
基因的部分序列及其5侧翼序列, 用PlantCARE软
件对其进行分析发现, 在翻译起始密码子上游存在
着多个可能的TATA-box和CAAT-box; 利用Berke-
ley Drosophila Genome Project软件进一步对该5上
游远端调控序列分析发现, 其存在多个 G-box、I-
box和AT1模序等光响应元件, 另外还发现许多明
显的逆境应答调控元件 ERE、ABRE、HSE 等。
Zhang等(2008)利用PLACE和PlantCARE软件对已
获得的辽宁碱蓬(Suaeda liaotungensis) BADH基因
启动子序列(1 993 bp)进行分析, 发现该序列具有
启动子的基本组成元件 TATA-box、CAAT-box,
且包含多个胁迫诱导元件, 如 3 个盐诱导元件 GT-
1 模序(GAAAAA), 6 个缺水、抗脱落酸、抗冻、
抗寒元件MYC识别位点(CANNTG), 9个伤害诱导
元件 WUN-motifs (ANATTNCNN), 11 个热激元件
HSE (ATAAATGT)等。
2 突变分析法
突变分析法是鉴定顺式作用元件最可靠的方
法, 多数突变分析包括缺失突变和取代突变, 此方
法能分析各种类型的调控区域中的顺式作用元件。
首先通过缺失突变分析确定功能启动子的调控区边
界, 然后通过一系列的 6~10 bp的取代突变扫描此
图 1 顺式作用元件及转录因子研究流程图
Fig.1 Research flowchart of cis-acting elements and
transcription factors
表 1 植物启动子预测相关数据库和软件资源
Table 1 Databases and softwares of plant promoter predicting
名称 网址 参考文献
EPD http://www.epd.isb-sib.ch Christoph 等 2004
TRRD http://wwwmgs.bionet.nsc.ru/mgs/gnw/trrd Kolchanov 等 2002
TRANSFAC http://www.gene-regulation.com Matys 等 2003
PLACE http://www.dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE Higo 等 1999
PlantCARE http://www.plantcare.com Stephane 等 1999
郑晓瑜等: 植物非生物胁迫诱导启动子顺式作用元件的研究方法 131
调控区的重要顺式作用元件, 最后对每个元件进行
更为精确的点突变, 以此来确定每个元件的边界和
分析每个元件是否代表某一结合蛋白的结合位点或
多种蛋白的共同作用位点(Carey和Stephen 2001)。
突变分析法包括 5 端缺失法、3 端缺失法、内部
缺失法和点突变法。
2.1 5端缺失法
5 端缺失分析是用于确认启动子功能区段的
一种常用的有效方法。这种方法是通过核酸外切
酶、限制性内切酶酶切或 PCR 扩增, 把已知的启
动子缺失成5端不同长度的片段, 然后将这些缺失
片段与报告基因连接, 构建融合表达载体, 转化受
体后, 通过测定报告基因的瞬时表达或稳定表达来
确定启动子的不同缺失片段的功能(图 2)。
一个 856 bp (-2 200~-1 344 bp)的区域中含有增强
子, 当缺失该区域时, GUS 报告基因的活性明显降
低, 该区域能够提高 TsVP1 基因表达水平。进一
步的 5 端缺失法分析, 确定了一个 130 bp (-667~
-538 bp)的区域为盐胁迫响应的关键序列。
2.2 3端缺失法
3 端缺失法也是用于确认启动子功能区段的
一种有效方法, 该方法的应用没有5端缺失法那样
普遍。同 5端缺失法相类似, 该方法也是通过核酸
外切酶、限制性内切酶酶切或 PCR 扩增, 把已知
的启动子缺失成3端不同长度的片段, 通过驱动报
告基因的表达来确定不同缺失片段的功能(图 3)。
图 2 5端缺失法原理图
Fig.2 Diagram of 5-flanking region deletion
GUS: β-glucuronidase, β- 葡萄糖苷酸酶; NOS: nopaline
syntha se, 烟脂碱合成酶。
Yamaguchi-Shinozaki 和 Shinozaki (1994)分析
拟南芥(Arabidopsis thaliana) rd29A基因启动子, 通
过 5 端缺失分析发现一个 162 bp (-274~-113 bp)
的区域含有脱水响应序列。Nazmul 等(2007)对所
分离的1.6 kb苋属植物Amaranthus tricolor的CMO
基因(AmCMO)上游启动子片段进行5端缺失分析,
发现翻译起始点上游 410 bp 片断中含有盐胁迫响
应元件, 该区段可以作为盐诱导启动子。Zhang 等
(2008)分析盐生植物辽宁碱蓬BADH基因启动子盐
诱导表达功能区段, 通过5端缺失构建植物表达载
体、转化烟草等一系列实验发现, -300~+62 bp 启
动子区段具有启动子活性, 是一个强的盐诱导表达
启动子。Chen 等(2009)分离了大豆(Glycine max)
的 GmDREB3 启动子, 进行 5 端缺失分析发现, 该
启动子-1 058~-644 bp 区段含有低温响应序列。
Sun等(2010)在研究盐芥(Thellungiella halophila)的
TsVP1 基因启动子时, 采用 5 端缺失法分析, 发现
图 3 3端缺失法原理图
Fig.3 Diagram of 3-flanking region deletion
Yin等(2009)分离了西瓜(Citrullus vulgaris)叶
片 1.8 kb 的 AGPL1 启动子, 利用 3 端缺失法对其
进行分析发现, 位于启动子下游 UTR 区的 323 bp
(+136~+459 bp)的区域为正调控区, 缺失该区域会
导致启动子活性降低。Park 等(2004)在研究大豆
CAM亚型SCaM-4基因启动子时, 通过一系列3端
缺失分析, 发现-858~-728 bp区段为 NaCl 诱导表
达功能区段。
2.3 内部缺失法
内部缺失法是将全长启动子中的某一具有启动
子活性的区段作为研究对象, 缺失其内部某一序列, 产
生一系列不同大小的内部缺失的启动子突变体, 再
通过植物转化研究不同缺失突变体的功能(图 4)。
图 4 内部缺失法原理图
Fig.4 Diagram of internal deletion
植物生理学报132
启动子中发现了一段 36 bp的序列(CAATCGTCA-
TGAATGAAGTCATGTGACGGCTACACA), 该序列
受 MeJA (茉莉酸甲酯)诱导。对该序列中 CGTCA
和TGACG任一元件或两个元件同时进行突变, 打
乱 TGACG 模序(用 TtcCt 取代 TGACG), 突变启动
子片段不受 MeJA 诱导, 表明 TGACG 模序是受
MeJA诱导的顺式作用元件。Brown等(2001)研究
冬大麦低温响应的blt101.1基因启动子发现, -168~
-275 bp 之间 107 bp 区域在低温下驱动的 GUS 活
性较高, 该序列包含一高度保守的序列 CR I, 点突
变和凝胶阻滞分析发现, 在 CR I 内存在一个 10 bp
低温响应元件(AGAAGATGC), 命名为 TCA-like
element。Park 等(2004)为了证明 SCaM-4 启动子
中的 GT-1 元件在应答 NaCl 及病原体胁迫中的作
用, 将GAAAAA突变为CCAAAA, 转化拟南芥并检
测 GUS 活性, 元件突变后, GUS 活性降低了 30%,
表明GAAAAA是响应NaCl及病原体胁迫的顺式作
用元件。
3 凝胶阻滞分析法
凝胶阻滞实验(gel retardation assay, GRA), 又
称电泳迁移率变动实验(electrophoretic mobility shift
assay, EMSA), 是一种体外检测蛋白质与DNA特异
性结合的技术。这一技术最初是用来对纯化的原
核调控蛋白与DNA的互作进行动力学分析的(Fried
和 Crothers 1984), 随后人们发现它可以用于检测
蛋白粗提物中的DNA结合蛋白(Singh等1986)。凝
胶阻滞依据的原理就是在凝胶电泳中, 由于电场的
作用, 小分子DNA片段比其结合了蛋白质的DNA
片段向阳极移动的速度快, 依据电泳迁移率的变化
可以确定蛋白质与核酸分子的结合情况。凝胶阻
滞实验常用于研究启动子功能元件与核蛋白的结合
情况, 从而鉴定新的顺式作用元件或验证已知顺式
作用元件与转录因子的相互作用(图 6)。
Yamaguchi-Shinozaki 和 Shinozaki (1994)发现
在拟南芥脱水诱导的rd29A基因启动子中含有2个
20 bp 的正向重复序列(ACTACCGACATGAGTT-
CCAA), 该序列为脱水响应元件, 通过凝胶阻滞分
析发现该序列中的9个碱基序列(TACCGACAT)为
功能序列, 命名为DRE元件, 核心序列为CCGA, 可
被脱水、高盐和低温所诱导。Dunn 等(1998)对大
麦冷诱导基因blt4.9启动子(1 938 bp)中42 bp序列
(-218~-177 bp)进行凝胶阻滞分析, 在该区域鉴定
Shen等(1996)采用内部缺失法研究发现, 大麦
(Hordeum vulgare) Lea 基因启动子的 ABA诱导活
性需要两个ACGT元件或者一个ACGT元件和一个
CE元件, 且ACGT元件和一个CE元件的旁侧序列
对启动子的活性也有一定的影响。Park 等(2004)
通过内部缺失分析发现, 缺失-1 065~-858 bp区段
不影响大豆 SCaM-4 基因启动子 NaCl诱导表达活
性。Yang 等(2009)在研究裂叶牵牛(Pharbitis nil)
PNZIP 基因启动子时发现, PNZIP 启动子含有 G-
box、box-II、GAAATA、GATACT、AT-1 box
等光应答相关元件, 通过内部缺失分析, 发现 box-
II、GAAATA、GATACT和 AT-1 box 元件在响应
PNZIP 基因特异表达中均起到一定作用, 其中 G-
box 起到关键作用。
2.4 点突变法
点突变分析是研究启动子的特定核苷酸序列
常用的方法, 启动子中重要的元件被确定后, 要确
定启动子活性的关键性核苷酸碱基, 就要采用几个
碱基的部分取代甚至是单个碱基的点突变法, 一般
是利用转座子插入突变或限制性酶切除去某一特定
启动子元件, 并把该突变启动子转化植物或通过凝
胶阻滞分析来确定特定序列的功能(图 5)。TATA
框、CAT 框、CAAT 框的结构及功能即是应用此
方法研究确定的(夏江东等 2006)。
Rouster 等(1997)在大麦脂氧化酶基因(Lox1)
图 5 点突变原理图(小写碱基为突变碱基)
Fig.5 Diagram of site-directed mutagenesis
郑晓瑜等: 植物非生物胁迫诱导启动子顺式作用元件的研究方法 133
DRE-like元件是棉花LEA蛋白D113基因启动子中
响应低温、干旱、高盐的顺式作用元件。Chen
等(2009)用凝胶阻滞法研究大豆受低温诱导表达的
GmDREB3蛋白与DRE顺式作用元件的相互作用,
发现 GmDR EB 3 蛋白能与 D RE 顺式作用元件
(CCGAC)特异结合。
4 DNase I足迹分析法
DNase I 足迹分析法(DNase I footprinting)也
是研究顺式作用元件与蛋白质结合的一种方法, 该
方法能确定与蛋白质结合的 DNA 的长度及序列。
其基本原理是用DNase I部分消化已进行单链末端
标记的待测双链DNA, 在变性聚丙烯酰胺凝胶上形
成以相差一个核苷酸为梯度的DNA条带; 当DNA
片段与其特异性结合的蛋白结合后, 结合蛋白的区
域受到蛋白的保护, 免受 DNase I 的攻击, 因此形
成切割梯中的空白区域。再结合DNA化学测序法,
就可知该结区的碱基序列(图 7)。
图 6 凝胶阻滞实验原理图
Fig.6 Diagram of electrophoretic mobility shift assay
引自 h t t p : / / w w w . c n v i a g e n e . c o m / E M S A _ s u b j e c t /
faq_emsa_methods.htm。
出一个六聚核苷酸序列: CCGAAA, 可作为低迁移
率结合蛋白复合体结合位点, CCGAAA模序突变会
降低该基因对低温响应的水平。Bastola 等(1998)
从苜蓿(Medicago sativa)根中分离得到受NaCl诱导
的PMsPRP2基因启动子, 经凝胶阻滞分析发现, 该
启动子存在 G-rich 序列: GNGGTG 或 GTGGNG。
Park等(2004)通过凝胶阻滞分析鉴定出SCaM-4启
动子-858~-728 bp区域中6 bp保守序列GAAAAA
(GT-1 cis-element)为 NaCl 和病原体诱导的顺式作
用元件。
除了鉴定新的顺式作用元件外, 凝胶阻滞实验
在验证非生物胁迫启动子顺式作用元件与转录因子
的相互作用方面也有广泛的应用。魏刚等(2005)
通过凝胶阻滞实验分析拟南芥受干旱胁迫表达的蛋
白 QRAP2 (glutamine-rich AP2), 结果显示 QRAP2
蛋白能够与 DRE 顺式元件特异结合, 但不能与
mDRE和GCC等非相关元件结合。Huang等(2007)
从棉花中分离出了 DREB1/CBF-like 蛋白(GhDR
EB1L), 并采用凝胶阻滞实验对其进行分析, 发现
GhDREB1L能够与DRE元件(核心序列, ACCGAC)
和 DRE-like 元件(核心序列, GCCGAC)特异结合,
DNase I 足迹法由Galas和 Schmitz 于 1978年
首次运用于 DNA 序列特异性结合蛋白的研究中。
Boter等(2004)利用足迹分析, 发现LAP启动子T/G-
box的邻近位置存在GAGTA元件的重复模序, 通过
删除该元件的突变实验显示, 启动子JA (茉莉酸)诱
导活性丧失, 表明这一重复元件对于启动子JA响应
是必须的。Rawat等(2005)在研究编码茄子(Solanum
melongena)半胱氨酸蛋白酶基因SmCP的表达时发
现, 该基因是受昼夜节律调控的, 利用 DNase I 足
图 7 DNase I足迹实验原理图
Fig.7 Diagram of DNase I footprinting
引自 http://www.doc88.com/p-79559361893.html。
植物生理学报134
迹分析实验和凝胶阻滞实验找到了和昼夜节律相关
的顺式作用元件EEs (AAAATATCT)。目前DNase I
足迹法在启动子顺式作用元件研究中的应用较少,
在植物非生物胁迫启动子顺式作用元件的研究中尚
未见报道。
5 酵母单杂交体系
酵母单杂交体系(yeast one-hybrid system)是由
Li 和 Herskowitz (1993)从酵母双杂交技术发展来
的。该方法根据 DNA 结合蛋白(即转录因子)与
DNA顺式作用元件结合调控报告基因表达的原理
来克隆编码目的转录因子的基因、鉴别已知转录
因子的DNA结合位点, 是一种利用酵母细胞来进行
的体内遗传分析系统。其原理是: 转录因子通常由
一个DNA结合结构域(DNA-binding domain, BD)和
一个转录激活结构域(activation domain, AD)组成。
理论上, 任何一个AD都可以与任何一个BD结合并
激活转录, 而且只要二者能够通过一定方式在空间
上足够靠近, 就可激活转录。在酵母单杂交系统
中, 用特异的 DNA 序列(顺式作用元件, cis)取代
GAL4 (一种典型的转录因子)的DNA结合位点, 只
要文库蛋白编码基因表达的蛋白能与目标序列(cis)
相互作用, 就可通过转录激活结构域激活RNA聚合
酶, 启动下游报告基因的表达。其基本操作过程
为: 将已知顺式作用元件构建到最小启动子(minimal
promoter, Pmin)的上游, 把报告基因连接到Pmin下
游。将编码待测转录因子的 cDNA 与 AD 融合表
达载体导入酵母细胞, 该基因产物如果能够与顺式
作用元件相结合, 就能激活Pmin启动子, 使报告基
因得到表达, 从而筛选出与已知顺式作用元件相互
作用的转录因子的编码基因(图 8)。
的转录因子DREBlA和DREB2A, DREBlA受低温诱
导表达, DREB2A受干旱诱导表达。Lu等(2002)从
水稻(Oryza sativa)悬浮细胞cDNA文库中分离到3个
新的MYB 基因, 分别命名为OsMYBS1、OsMYBS2
和OsMYBS3。酵母单杂交实验表明, OsMYBS1和
OsMYBS2可以在体内与TATCCA元件结合, 转录
激活含 TATCCA 元件的启动子的表达。Shen 等
(2003)利用酵母单杂交实验, 在干旱诱导的小麦中
发现一个能与DRE元件结合的转录因子(TaDREB1),
该转录因子基因在不同的小麦品系中可被低温、
干旱和高盐所诱导。Boter 等(2004)采用酵母单杂
交技术, 分离得到2个含有HTL的碱性亮氨酸拉链
结构的转录因子: JAMYC2和JAMYC10, 它们可以
特异地与LAP基因启动子的-317~-78 bp区域中的
T/G-box (AACGTG)结合。Tran等(2004)利用酵母
单杂交技术分离了拟南芥 3 个 NAC 家族的蛋白:
ANAC019、ANAC055和ANAC072, 它们在体内和
体外均能与包含CATGTG模序的63 bp启动子特异
结合, 且均受干旱、高盐以及脱落酸的诱导。
6 结语
植物非生物胁迫诱导启动子顺式作用元件及
转录因子的研究是目前研究的热点, 受到广泛关注,
本文介绍了该研究领域的经典方法, 其中凝胶阻滞
分析法和酵母单杂交法应用比较广泛, 凝胶阻滞分
析法主要用于鉴定新的顺式作用元件, 酵母单杂交
法主要用于鉴定与已知顺式作用元件相互作用的转
录因子。随着生物技术的发展, 越来越多的新技术
已应用于 DNA- 蛋白质相互作用的研究中, 如: 染
色质免疫共沉淀、核酸适体技术、荧光技术、扫
描探针显微镜技术、等离子共振技术、质谱技术
和分子模拟等。随着这些新技术的发展和应用, 将
会鉴定出更多的顺式作用元件及转录因子, 为抗逆
基因表达调控的研究奠定基础。
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cDNA文库中得到了与脱水响应元件DRE特异结合
图 8 酵母单杂交体系原理图
Fig.8 Diagram of yeast one-hybrid system
AD: 转录激活域; cis: 顺式作用元件; X: 待测转录因子; Pmin:
最小启动子。
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