全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 4 期，2009 年 4 月 333
马槟榔甜蛋白基因(MBL II)的剪切重组和结构分析
顾文亮 1,2, 胡新文 1, 郭建春 2,*
1 海南大学农学院, 海口 570228; 2 中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 海口 571101
提要: 马槟榔甜蛋白(mabinlin II)是我国所特有且唯一的植物甜蛋白, 在体外至今没有得到具有甜味的基因表达产物。本文
采用基因工程手段对基因进行剪切重组, 将重组基因构建成植物表达载体转入拟南芥中, 通过RT-PCR检测导入基因的表
达, 同时采用生物信息学方法对MBL II基因及其重组基因进行分析和甜味检测显示, 转基因拟南芥不具有明显的甜味, 但
RT-PCR的结果显示, MBL II基因及其重组基因可在转基因的拟南芥中表达。根据生物信息学方法分析结果推测, 导入拟
南芥中的重组马槟榔甜蛋白可能是具有甜味的蛋白。
关键词: 马槟榔; 甜蛋白; 重组基因
Reorganization and Structure Analysis of MBL II Gene
GU Wen-Liang1,2, HU Xin-Wen1, GUO Jian-Chun2,*
1College of Agriculture, Hainan University, Haikou 570228, China; 2Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese
Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China
Abstract: Mabinlin II is the unique plant sweet protein from Capparis masaikai which is only found in China
but no sweetness gene expression products in vitro was reported so far. MBL II gene was constructed into
plant expression vector, and the recombinant MBL II was transformed into Arabidopsis. Gene expressions in
transgenic Arabidopsis were detected by RT-PCR method. MBL II gene and the recombinant MBL II genes
were analyzed and predicted by bioinformatics. The transgenic Arabidopsis plants were tested no sweet. But the
RT-PCR results showed that MBL II gene and the restructure MBL II genes were expressed in the transgenic
Arabidopsis. Bioinformatics analysis also showed that the recombinant mabinlin II proteins maybe a sweet
protein.
Key words: Capparis masaikai; sweet protein; recombinant gene
收稿 2008-12-05 修定 2009-01-15
资助 国家自然科学基金(30 7 60 0 2 5)。
* 通讯作者(E-mail: jianchunguoh@163.com; Tel: 0898-
6 6 9 8 7 5 3 5 )。
马槟榔, 又名水槟榔, 主要分布于我国热带和
亚热带地区, 是我国特有分布的、唯一在果实中
富含甜蛋白的野生植物。在其种子中含有马槟榔
甜蛋白(MBL II), 其甜度约为等质量蔗糖的400倍,
并且其耐酸性好, 热稳定性高, 可望成为一种新型
食品甜味剂(孔建强等 2003)。马槟榔甜蛋白的
cDNA 序列目前已克隆并测序, 研究表明 MBL II
基因的表达过程中存在着复杂的翻译后加工过程
(胡新文等 1998), MBL II 首先翻译成 155 个氨基
酸的前蛋白, 信号肽、N- 端肽、连接肽以及 C-
端肽均在成熟过程中被剪接掉, 最后形成以非共价
键形式相连的仅含A链和B链的成熟蛋白MBL II。
由于马槟榔生长条件比较苛刻, 在我国分布有
限, 致使对这一资源的利用受到限制, 而目前还没
有得到具有甜味的基因表达产物。现代分子技术
手段为MBL II的转基因研究与开发提供了新的思
路, 本文根据已克隆的MBL II的序列设计引物, 利
用重叠区扩增基因拼接法技术对基因进行剪接, 得
到不同的重组基因片段, 连入表达载体形成不同的
表达方式, 为寻找 MBL II 的有效表达方式和探究
其翻译后加工机制建立基础。
建立用生物信息学的方法对MBL II 及其重组
基因的核酸序列及对应的氨基酸序列的理化性质、
结构特征和功能进行预测分析, 将有助于了解相关
基因的生物学性质和同源性等生物进化信息。为
实现利用基因工程将MBL II进行大规模的表达, 并
经翻译后加工成为有甜味的成熟蛋白提供理论依
据。前人对MBL II 的研究多为分子生物学方面的
实验性研究, 而类似的生物信息学研究还未见报道。
材料与方法
马槟榔(Capparis masaikai Lévl.)甜蛋白(MBL II)
植物生理学通讯 第 45 卷 第 4 期，2009 年 4 月334
的基因序列由本实验室克隆并保存。表达载体
pVKH-35S-GUS-pA、大肠杆菌 DH5α、农杆菌
GV3101和野生型的哥伦比亚种拟南芥(Arabidopsis
thaliana L.)均由本实验室保存。Trizol试剂盒购至
上海生工公司, RNA 反转录试剂盒及 pMD18-T
Simple-Vector 购至宝生物公司。
P C R 及重叠区扩增重组基因拼接反应中
的 PCR 引物设计: 引物 M1: 5 AAGGGATC-
CATGGCGAAGCTCATCTTCCT 3; 引物 M2: 5
ATCGGGCTGTCCGCCGAACTGGG 3; 引物 M3:
5 GGCGGACAGCCCGATCAGCCAAGGCACCG 3;
引物 M4: 5 CCGGTCGACTAGGGCCATGTTCT-
GAATGG 3; 引物 M5: 5 CAAGGATCCATTAT-
GCAACTGTGGAGATGTCA 3; 引物 M6: 5 AT-
TGTCGACCTACCATGTTCTGAATGGG 3。
引物 M1 和 M4 扩增 MBL II 基因全长序列编
码区, 所得产物设为片段 MBL (约 480 bp)。引物
对 M1、M2 和引物对 M3、M4 均以片段 MBL 为
模板进行扩增, 将两者所得的扩增片段混合, 加入
引物对 M1、M4 进行第 3 轮扩增, 所得产物设为
片段 AM (约 440 bp, 包含信号肽 +N- 端肽 +A链 +
B链 +C- 端肽)。引物对M5和M6以片段AM为模
板进行扩增, 所得产物设为片段 GM (约 330 bp, 包
含 A 链 +B 链)。以上引物均由大连宝生物公司合
成。扩增片段 MBL、AM 和 GM 均由上海联合基
因有限公司进行序列测定。
经过序列测定正确的片段 MBL、AM 和 GM
导入 pVK H 载体, 通过电击转化法转入农杆菌
GV3101 后, 利用真空抽滤法转入拟南芥。通过
Hyg筛选转基因拟南芥, 经过PCR鉴定确认获得纯
合的 T3 代转基因拟南芥。
将纯合的转MBL、AM、GM 基因和野生型的
拟南芥种子, 消毒后无菌播种在MS 培养基上, 放置
于人工气候箱内, 约 3周后取萌发的小苗做RT-PCR
检测。用Trizol试剂提取拟南芥的总RNA, 测OD值
后取调整一致OD值的总RNA用反转录试剂盒反转
录成cDNA, 以拟南芥的Actin基因为对照, 用引物对
M1和M4进行PCR检测导入转基因拟南芥中的MBL
和AM基因的表达, 用引物对M5和M6进行PCR检
测导入转基因拟南芥中的GM 基因的表达。
MBLII 基因及其重组基因的结构分析根据国
际互联网数据库提供的各类生物信息学软件进行在
线分析。氨基酸序列的组成成分分析和理化性质
分析利用 ProtParam和 pI/MV在线工具上进行; 蛋
白质信号肽、二硫键的预测、卷曲螺旋、跨膜
结构域及亲水性 / 疏水性的分析用在线工具
SignalP、COILS、TMHMM 及 ProtScale 完成; 蛋
白质二级及三级结构的预测利用 G O R 算法及
Swiss-Model 在线工具完成。
将纯合的转 MBL、AM 和 GM 基因的拟南芥
种子, 消毒后无菌播种在 MS 培养基上, 放置于人
工气候箱内, 约3周后取萌发的小苗做转基因拟南
芥的甜味检测。参照国际标准设置蔗糖浓度 0 和
2% 作为对照, 根据双盲实验的原则品尝野生型以
及转 MBL、AM 和 GM 的拟南芥小苗。以蔗糖浓
度梯度 0 和 2% 为 0 到 10 的分值, 对所品尝的 4种
拟南芥打分。
结果与讨论
1 马槟榔甜蛋白基因(MBL II)的克隆和重组基因片
段的序列鉴定
PCR 片段 MBL、AM 和 GM 通过凝胶电泳回
收, 分别与pMD18-T Simple-Vector连接, 转化大肠
杆菌 DH5α。经过蓝白斑筛选, 挑取蓝色菌斑筛选
阳性克隆, 提取质粒后进行BamHI和SalI双酶切鉴
定。鉴定后的质粒送往上海联合基因有限公司测
序。所测序列经比对分析, 扩增得到的 MBL、AM
和 GM (图 1)均满足本实验的要求。
2 马槟榔甜蛋白基因(MBL II)和重组基因表达载体
的构建以及对拟南芥的转化
经测序验证后的MBL II基因和重组基因通过
图 1 MBL、AM 和 GM 的 PCR 扩增
Fig.1 PCR amplification of MBL, AM and GM
M: D L2 00 0 分子量标准。
植物生理学通讯 第 45 卷 第 4 期，2009 年 4 月 335
BamHI 和 SalI双酶切, 将片段 MBL、AM 和GM 连
入pVKH-35S-GUS-pA的植物表达载体。鉴定后的
植物表达载体通过电击转化法导入农杆菌GV3101
中, 经过筛选用阳性克隆的菌液进行 PCR 鉴定。
经 PCR鉴定的阳性农杆菌通过真空抽滤法转化拟
南芥, 以 30 mg·L-1 的 Hyg 浓度筛选转基因拟南芥,
直至获得 3 种纯合的转基因拟南芥 MBL、AM 和
GM。MBL、AM 和 GM 经 PCR 鉴定, 证明 MBL II
基因和重组基因成功转入拟南芥中。
3 转马槟榔甜蛋白基因(MBL II)和重组基因拟南芥
的RT-PCR检测
提取纯合的转MBL II 基因和重组基因拟南芥
的总 RNA (图 2), 在分光光度计下测其 OD 值, 总
RNA的OD260/OD280 均在 1.8~2.0之间, 用试剂盒反
转录成 cDNA后进行PCR检测。以Actin基因为内
参基因, 经检测发现在转基因拟南芥中马槟榔甜蛋
白基因MBL和重组基因AM和GM均有表达(图3)。
带电荷比例、酸性 / 碱性氨基酸比例则比较均衡,
但其含量最丰富的氨基酸与三类重组蛋白相同, 同
样也属于不稳定类脂类结合蛋白质家族。
图 2 拟南芥的总 RNA
Fig.2 Total RNAs of Arabidopsis
4 马槟榔甜蛋白基因(MBL II)及其重组基因氨基酸
序列的分析
4.1 氨基酸序列的理化性质分析 用Expasy网络服
务器的 ProtParam和 pI/MV 在线工具对 MBL II 基
因及其重组基因进行在线预测(Gasteiger 等 2005),
结果(表1)显示。MBL的氨基酸残基数和分子量与
重组的AM和GM之间比较均有些差异, 重组的AM
和 GM 在理论等电点、总氨基酸带电荷比例、酸
性 /碱性氨基酸比例、疏水性 /亲水性氨基酸比例
等理化性质上差异不大, 它们含量最丰富的氨基酸
均为谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)和亮氨酸(Leu)并
且都属于不稳定类脂类结合蛋白质家族。MBL的
理论等电点跟这两类重组蛋白比较偏低, 总氨基酸
表 1 氨基酸序列的组成成分及理化性质分析
Table 1 Comparison on composition and physical and
chemical characters of amino acid sequence

项目
种类
MBL AM GM
推导氨基酸残基数 / 个 155 141 105
分子量 /kDa 18.1 16.5 12.5
理论等电点 6.71 10.47 11.70
酸性氨基酸比例 /% 12.3 6.3 2.9
碱性氨基酸比例 /% 13.5 14.9 20.0
带负电荷氨基酸比例 /% 12.3 6.38 2.9
带正电荷氨基酸比例 /% 12.3 13.5 17.1
极性氨基酸比例 /% 59.3 56.0 58.2
疏水性氨基酸比例 /% 40.7 43.4 37.2
蛋白质不稳定性指数 /% 69.44 73.69 87.77
脂类结合蛋白质指数 /% 88.13 92.06 73.43
疏水性 GRAVY 值 -0.528 -0.340 -0.752
含量最丰富的氨基酸 /% Glu 13.5 Glu 14.9 Glu 18.1
Arg 11.6 Arg 12.8 Arg 17.1
Leu 11.0 Leu 11.3 Pro 8.6
Ala 7.7 Ala 8.5 Leu 8.6
据相关研究报道, 甜味蛋白质具有很高的等电
点, 通常都是具有疏水性部位的碱性蛋白质。按照
上述氨基酸序列的理化性质分析结果, AM 和 GM
的理论等电点都较高, MBL、AM和GM的疏水性
氨基酸比例也均较高, 可以推断MBL、AM和GM
都初步符合呈现甜味蛋白质的特点。
4.2 信号肽的预测和分析 用Expasy网络服务器的
SignalP 3.0 Sever 在线工具对 MBL II 基因(图 4)及
图 3 MBL、AM 和 GM 的 RT-PCR 检测
Fig.3 Determination of MBL, AM and GM by RT-PCR
M: D L2 00 0 分子量标准。
植物生理学通讯 第 45 卷 第 4 期，2009 年 4 月336
其重组基因(图 5)的氨基酸序列进行预测(Dyrløv
Bendtsen等 2004)。结果表明, MBL多肽链第 22位
的异亮氨酸(Ile)残基具有最高的原始剪切位点分值
0.8, 第 15位的缬氨酸(Val)残基具有最高的信号肽
分值 1.0, 第 22 位的异亮氨酸(Ile)残基同样也具有
最高的综合剪切位点分值0.79 (图4)。AM与MBL
的情况完全类似。GM 多肽链第 18 位的半胱氨酸
(Cys)残基具有最高的原始剪切位点分值0.16, 第12
位的组氨酸(His)残基具有最高的信号肽分值 0.57,
第18位的半胱氨酸(Cys)残基同样也具有最高的综
合剪切位点分值 0.19 (图 5)。MBL 和 AM 二者的
分值都明显的高于平均分值0.5, 而GM的分值明显
的低于平均分值 0.5。因此 MBL 和 AM 二者存在
信号肽酶切位点, 具有一段约25个AA的信号肽, 而
GM 不存在信号肽酶切位点, 不具有信号肽。
根据预测结果表明, MBL和AM二者存在信号
肽酶切位点, 具有信号肽, 可以推断MBL和AM在
细胞质中合成后, 可能会进行蛋白转运; GM 不存
在信号肽酶切位点, 不具有信号肽, 可以推断 GM
在细胞质中合成后, 不进行蛋白转运, 而保留在细
胞质基质中。
4.3 卷曲螺旋的预测和分析 用Expasy网络服务器
的COILS Sever在线工具对MBL II基因(图 6)及其
重组基因(图7)的氨基酸序列的卷曲螺旋进行预测
(Lupas 等 1991)。结果表明, MBL位于多肽链的第
66~83位的17个氨基酸残基的分值区间为[0.5~0.6],
位于多肽链的第 22~47位的 25个氨基酸残基的分
值区间为[0.07~0.1], 位于多肽链的第 87~102位的
15个氨基酸残基和位于多肽链的第109~123位的
14 个氨基酸残基的分值区间为[0.02~0.04] (图 6)。
AM位于多肽链的第22~47位的25个氨基酸残基的
分值区间为[0.07~0.1], 位于多肽链的第73~88位的
15个氨基酸残基和位于多肽链的第94~108位的14
个氨基酸残基的分值区间为[0.02~0.04] (图未显
示)。GM位于多肽链第1~18位的 18个氨基酸残基
的分值区间为[0~0.02], 位于多肽链的第 59~78位的
20 个氨基酸残基的分值区间为[0.02~0.04] (图 7)。
可以推测, MBL 蛋白存在 4 个卷曲螺旋结构, AM
蛋白存在 3 个卷曲螺旋结构, GM 蛋白仅有一个不
明显的卷曲螺旋结构。
4.4 跨膜结构域的预测和分析 利用网络服务器
(http://genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)的
图 4 MBL 的信号肽预测
Fig.4 Predicted signal peptide of MBL
图 5 GM 的信号肽预测
Fig.5 Predicted signal peptide of GM
图 6 MBL 的卷曲螺旋预测
Fig.6 Predicted coils of MBL
图 7 GM 的卷曲螺旋预测
Fig.7 Predicted coils of GM
植物生理学通讯 第 45 卷 第 4 期，2009 年 4 月 337
在线工具对 MBL II 基因(图 8)及其重组基因(图 9)
的氨基酸序列的跨膜结构域进行在线预测。结果
显示, MBL和AM有一个由可能膜内侧向膜外侧跨
膜的跨膜区域, 且均位于多肽链第5位的异亮氨酸
(Ile)到第27位的异亮氨酸(Ile), 共计23个氨基酸残
基, 其分值明显高于 1, 具有显著意义。GM 则是
一个完全位于膜外侧的蛋白, 可能不存在跨膜螺
旋。
基上形成 4 个二硫键。AM 有 8 个半胱氨酸残基,
在第 40 位与第 135 位、第 53 与第 127 位、第 78
位与第 89 位和第 79 位与第 91 位的半胱氨酸残基
上形成 4 个二硫键。GM 有 8 个半胱氨酸残基, 在
第 5 位与第 100 位、第 18 位与第 92 位、第 43 位
与第 54 位和第 44 位与第 56 位的半胱氨酸残基上
形成 4 个二硫键。二硫键对蛋白质的折叠具有重
要的作用, 可以推测在足够的还原性条件下MBL、
AM 和 GM 的半胱氨酸残基能够相连形成二硫键,
从而折叠成为有甜味的蛋白。
4.6 氨基酸序列的疏水性 /亲水性预测和分析 依
据氨基酸分值越低亲水性越强, 分值越高疏水性越
强的规律, 用 Expasy网络服务器的 ProtScale Sever
在线工具对 MBL II 基因(图 10)及其重组基因(图
11)的氨基酸序列的疏水性 / 亲水性进行在线预
测。 结果显示, MBL位于多肽链的第 82位的天冬
酰胺(Asn)具有最低分值(-3.511), 亲水性最强; 第
14 位的苯丙氨酸(Phe)具有最高分值(2.789), 疏水性
最强(图 10)。AM 位于多肽链的第 69 位的谷氨酰
胺(Gln)具有最低分值(-2.744), 亲水性最强; 第 14
位的苯丙氨酸(Phe)具有最高分值(2.789), 疏水性最
强(图未显示)。GM 位于多肽链的第 34 位的谷氨
酰胺(Gln)具有最低分值(-2.744), 亲水性最强; 第94
位和第97位的异亮氨酸均具有最高分值(1.000), 疏
水性最强(图 11)。MBL 和 AM 在位于多肽链的前
22个AA均为疏水性氨基酸, 在多肽链的后半部均
有明显的少量疏水性氨基酸分布, 多肽链的其余部
分均为亲水性氨基酸。GM 则只在多肽链的后半
部有明显的少量疏水性氨基酸分布, 多肽链的其余
部分均为亲水性氨基酸。另外 MBL、AM 和 GM
的亲水性氨基酸明显多于疏水性氨基酸, 可认为它
图 8 MBL 的跨膜结构预测
Fig.8 Predicted transmembrane of MBL
图 9 GM 的跨膜结构预测
Fig.9 Predicted transmembrane of GM
根据预测结果表明, MBL和AM可能存在跨膜
区域, GM 可能不存在跨膜区域。结合前述的信号
肽预测, 可以推断MBL和AM在细胞质中合成前体
蛋白, 有信号肽引导的MBL和AM进入其他亚细胞
器, 经修饰加工成为成熟的蛋白质; 而 GM 无信号
肽引导其进入其他亚细胞器, 而是留在细胞质中, 经
修饰加工成为成熟蛋白质。
4.5 二硫键的预测和分析 利用网络服务器 Predict-
Protein对马槟榔甜蛋白(mabinlin II)及其重组基因的
氨基酸序列的二硫键进行在线预测( C e r on i 等
2006)。结果显示, MBL 有 8 个半胱氨酸残基, 在
第 40 位与第 105 位、第 53 位与第 141 位、第 92
位与第 103 位和第 93 位与第 149 位的半胱氨酸残
图 10 MBL 的疏水性 / 亲水性预测
Fig.10 Predicted hydrophobicity/hydrophilicity of MBL
植物生理学通讯 第 45 卷 第 4 期，2009 年 4 月338
们均为亲水性蛋白。
4.7 结构功能域的预测和分析 利用Expasy网络服
务器的 ScanProsite在线工具分析MBL II基因及其
重组基因的氨基酸序列的结构功能域。结果表明,
MBL和AM均在多肽链第19~22位的4个氨基酸残
基存在N位 -糖基化位点和在多肽链第25~28位的
4 个氨基酸残基存在酪蛋白激酶二磷酸化位点, 通
常糖基化位点和磷酸化位点与蛋白质翻译后修饰过
程有关, 但这两个位点都是属于出现几率为高概率
的位点, 不具有显著意义。另外 AM 在多肽链第
36~112 位的 77 个氨基酸残基和 GM 在第 1~77 位
的77个氨基酸残基存在谷氨酰胺富集区, 该位点不
具有保守性, 应该不具有显著意义。可以推测,
MBL II 基因及其重组基因的氨基酸序列可能不存
在特殊的结构功能域。
5 蛋白质的结构预测与分析
5.1 二级结构的预测和分析 利用GOR算法对MBL II
基因(图12)及其重组基因(图13)的氨基酸序列的二
级结构进行在线预测。结果显示, MBL 由 40.00%
的 α- 螺旋、12.26% 的 β- 折叠和 47.74% 的无规则
卷曲组成, MBL的α-螺旋和β-折叠在C-端均有分
布, 而 N- 端则为 β- 折叠。α- 螺旋是 MBL 整体结
构的的最大元件, α- 螺旋和 β- 折叠分散于整个蛋
白质中, MBL结构中的N位-糖基化位点(多肽链第
19~22位)分布于无规则卷曲中, 酪蛋白激酶二磷酸
化位点(多肽链第 25~28 位)则分布于 β- 折叠区域
中。AM 由 39.72% 的 α- 螺旋、12.06% 的 β- 折
叠和 48.23% 的无规则卷曲组成, GM 由 20.95% 的
α- 螺旋、26.67% 的 β- 折叠和 52.38% 的无规则卷
曲组成。在 MBL、AM 和 GM 这三者中, α- 螺旋
图 11 GM 的疏水性 / 亲水性预测
Fig.11 Predicted hydrophobicity/hydrophilicity of GM
和β-折叠都是分散于整个蛋白质中, 无明显的规律,
但是相比较而言, MBL的二级结构与AM类似, GM
的二级结构则较为独特。
5.2 三级结构的预测和分析 利用 PDB 在线搜索
MBL II 的同源模板, 结果表明 MBL II 的氨基酸序
列与编号为 2DS2 的甜蛋白 mabinlin II、编号为
1SM7的重组油菜籽2S清蛋白和编号为1PNB的甘
蓝型油菜的种子储存蛋白的氨基酸序列相似。通
过BLAST比对结果显示, MBL II与甜蛋白mabinlin II
的A链的氨基酸序列相似性达到62%, 其序列比对
长度为 72个氨基酸残基; 与甜蛋白mabinlin II的B
链的氨基酸序列相似性达到 100%, 其序列比对长
度为 32个氨基酸残基; 与重组油菜籽 2S清蛋白的
A链的氨基酸序列相似性达到37%, 其序列比对长
度为117个氨基酸残基; 与甘蓝型油菜的种子储存
蛋白的B链的氨基酸序列相似性达到38%, 其序列
比对长度为 61个氨基酸残基。根据两者的序列等
同部分超过30%, 且序列比对长度大于80个氨基酸
残基, 则它们具有相似的三维结构的基本原理。因
此本次选用编号为 1SM7 的重组油菜籽 2S清蛋白
A链的氨基酸序列在 Swiss-Model Sever 对 MBL II
的氨基酸序列进行蛋白质三维结构同源性建模
(Arnold等 2006), 显示保守序列起止位置为多肽链
图 12 MBL 的二级结构预测
Fig.12 Predicted secondary structure of MBL
图 13 GM 的二级结构预测
Fig.13 Predicted secondary structure of GM
植物生理学通讯 第 45 卷 第 4 期，2009 年 4 月 339
第 36~67 位残基、第 82~105 位残基、第 131~151
位残基(E 值: 2.6E-7)。在 PDB 找到所对应的三维
结构, 结果如图 14 所示。对 AM 和 GM 的进行同
源建模分析表明, 这2种重组蛋白结构与MBL类似,
均包含上述的结构特征。
MBL II 及其重组蛋白的基本结构特征与甜味蛋白
类似。我们认为在对 MBL II 的转基因表达中, 若
尝试原核的表达方式, 可参考人工胰岛素的表达模
式, 先分别表达马槟榔甜蛋白的 A 链和 B 链, 然后
考虑在一定的条件下, 让A链和B链自由折叠成为
成熟的甜蛋白; 若选择植物的表达系统, 则可以选
择构建双价表达载体的方式。另外, 在酵母中(郑
斌和詹希美2005)也可以尝试以“信号肽+A链+蛋
白酶切位点 +B 链 ” 的重组基因表达形式。
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图 14 基于同源性建模的马槟榔甜蛋白(MBL II)的三维结构
Fig.14 The predicted three-dimensional structure model of
MBL based on homology
马槟榔甜蛋白及其重组蛋白的同源建模结果
显示, MBL、AM和GM均呈现一种V型结构。根
据对甜蛋白甜味机理的分子机制的研究, 甜味蛋白
通过与甜味受体 T1R2-T1R3 的相互作用而产生甜
味。甜蛋白与甜蛋白受体 T1R2-T1R3 之间的确切
作用机制目前仍未阐明。在人类中小分子量甜味
剂和甜蛋白的受体是一样的, 均为 T1R2-T1R3。
目前通过对原子和分子大小、主要化学键和极性
等因素的计算分析初步确定了甜蛋白与受体中参与
相互作用的氨基酸残基。图 15 即是一种 mabinlin
与T1R2-T1R3结合的结构模型, mabinlin甜蛋白以
一种 V 型的结构嵌入到甜蛋白的受体中。
6 转马槟榔甜蛋白基因(MBL II)和重组基因拟南芥
的甜味检测
以双盲实验为原则分别对野生型, 转 MBL、
AM和GM的拟南芥小苗进行10人次以上的品尝后
打分统计。结果显示, 4 种拟南芥的分值均在 2~3
分之间, 且野生型与转基因拟南芥的甜味分值不存
在显著差异。这说明在转MBL II 基因及其重组基
因的拟南芥中没有得到具甜味活性的表达。
在对 MBL II 的转基因研究中, 大多数都是以
本文所述的 3种基因方式表达。根据对前述MBL II
基因及其重组基因的生物信息学分析, 可以认为
图 15 Mabinlin 与 T1R2-T1R3 结合结构示意图
Fig.15 Diagrammatic representation of the binding between
mabinlin and T1R2-T1R3
图中浅色区域为 mabinlin。