全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 1期，2009年 1月 3 3
低温下转昆虫抗冻蛋白基因烟草的亚显微结构变化
王艳, 马纪 *, 邱立明, 王晶, 代春英, 张富春
新疆大学生命科学与技术学院, 新疆生物资源基因工程重点实验室, 乌鲁木齐 830046
提要: 分析在 -1 ℃温度中处理 1、2和3 d的转昆虫抗冻蛋白基因MpAFP149烟草和野生型烟草亚细胞显微结构变化的结
果表明, 转基因烟草和野生型烟草的超微结构有差异, 尤其是细胞膜、叶绿体和线粒体的膜。转基因烟草细胞器的膜结构
伤害程度明显低于野生型烟草, 这提示低温条件下转基因烟草中的抗冻蛋白可能有保护细胞膜和细胞器膜结构的作用, 由
此降低了低温的伤害。
关键词: 转抗冻蛋白基因烟草; 低温胁迫; 超微结构
Changes of Ultrastructure of Transgenic Tobacco (Nicotiana tabacum L.) with
Insect Antifreeze Protein Gene under –1 ℃ Condition
WANG Yan, MA Ji*, QIU Li-Ming, WANG Jing, DAI Chun-Ying, ZHANG Fu-Chun
Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, College of Life Science and Technology, Xinjiang
University, Urumqi 830046, China
Abstract: The ultrastructures in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) seedlings containing insect antifreeze
gene were analyzed under –1 ℃ for 0, 1, 2 and 3 d. The results showed that the ultrastructures in transgenic
tobacco seedlings were different from those in wild tobacco plants, especially the membranes of cellular or-
ganelles including cell membranes, chloroplast membranes and mitochondria membranes. The observation of
transmission electron microscope (TEM) showed that the damage degree of transgenic tobacco was lower than
that of wild tobacco, which suggested that the insect antifreeze protein could protect cell membrane and the
membranes of cellular organelles under low temperature, and reduce the damage degree of low temperature.
Key words: transgenic tobacco carrying insect antifreeze protein gene; cold treatment; ultrastructure
收稿 2008-09-16 修定 2008-11-27
资助 国家自然科学基金(3 07 600 56 )和教育部春晖计划项目
(Z20 04 -2 -6 50 40 )。
* 通讯作者(E-mai l: maj iu ci@xju .edu .cn; T el : 09 91 -
8 5 8 3 5 1 7 )。
受寒害的植物常发生萎蔫, 叶组织变色或坏死,
甚至整株死亡(牛力文和赵剑波2002), 一般认为其
原因是由于低温下膜的功能受损或结构破坏, 透性
增大, 细胞内各种水溶性物质包括电解质呈现出不
同程度的外渗, 电导率升高(Wallis等1997; Hara等
2003; Khanna和Daggard 2006)。
我们曾用农杆菌浸染法获得了含有新疆准噶
尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因MpAFP149的转基因烟
草, 它比野生型烟草表现出较好的抗寒表型(王艳等
2008; Wang等 2008), 本文从亚细胞水平上对转基
因植物的抗寒生理机制进行探讨。
材料与方法
野生型和T1代转抗冻蛋白基因MpAFP149烟
草(Nicotiana tabacum L.)种苗生长一致时, 分别随
机选取 3盆进行-1 ℃低温抗寒实验。-1 ℃低温
下, 从处理 0、1、2和 3 d的野生型及转基因烟
草相同部位的叶片取相应材料制备透射电镜样品
(徐柏森等 2006)。制作超薄切片时, 将第 4片叶的
无叶脉处叶剪成 1 mm×1 mm大小, 放入 2.5%戊
二醛固定液, 用注射器抽气直至叶片下沉为止。于
4 ℃固定过夜后, 用 0.1 mol·L-1磷酸缓冲液(pH 7.2
的PBS)清洗 2~4 h, 再加入2.5%的锇酸固定1~2 h,
至样品发黑为止。吸去锇酸溶液, 用 PBS缓冲液
清洗材料 3~4次, 各 10 min。梯度酒精脱水, 丙酮
过渡, 环氧树脂包埋。包埋块分别在 37、45、60 ℃
固化 24 h。模块修块后用 RMC MT-7超薄切片机
切片, 醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色, 以TEM-H-
600透射电镜观察。
实验结果
透射电镜观察低温-1 ℃连续处理 3 d转基因
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烟草和野生型烟草叶片的细胞器形态学变化, 并比
较二者的超微结构差异的结果显示, 低温胁迫下细
胞内部细胞器形态发生了变化, 尤其是细胞器的膜,
主要包括细胞膜、叶绿体和线粒体(图 1)。-1 ℃
图 1 低温(-1 ℃)对烟草叶片超微结构的影响
Fig.1 Effects of cold treatment (-1 ℃) on ultrastructures of tobacco leaves
a~c、m~o: 野生型烟草、转基因烟草低温处理前; d~f、g~i、j~l: 野生型烟草 - 1 ℃分别处理 1、2 和 3 d; p~r、s~ u、v~x:
转基因烟草 - 1 ℃分别处理 1、2 和 3 d。Ba r: 5 00 nm。
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低温处理前, 转基因烟草和野生型烟草细胞器的膜
系结构光滑完整(图 1-a~c、m~o)。处理 1 d时的
野生型(图 1-d~f)和转基因烟草(图 1-p~r)细胞器的
膜都显示出轻微的伤害。处理至第 2天和第 3天
的转基因和野生型烟草细胞器膜的伤害程度都进一
步加深, 但转基因烟草(图1-s~x)的伤害程度比野生
型烟草轻, 野生型烟草的细胞膜结构完全崩解和破
坏(图 1-g~l)。尤其是第 2天的野生型烟草细胞器
膜结构的破坏程度最严重, 与处理第 3天时的差异
不大。
讨　　论
植物易受低温伤害。Steponkus (1984)报道,
当温度降低至-1 ℃时, 冰晶先在植物体内溶质浓
度最低的质外体空间形成。由于植物质外体空间
的冰压较低使胞质脱水, 细胞膜皱缩。在细胞脱
水、膜皱缩和冻融过程中, 电解质从细胞中释放出
来(Guy 1990), 从而对植物造成严重伤害。抗冻
蛋白(antifreeze protein, AFP)是一种能吸附到体液
的冰表面, 通过抑制冰晶生长并降低冰点(Daley等
2002; Baardsnest等2003)而维持体液非冰冻状态的
高效抗冻活性物质(Swanson和Aquadro 2002)。研
究发现植物仅需比渗透保护物质(如蔗糖等)浓度低
得多的抗冻蛋白就可有效地抵御低温伤害(DeVries
1986; Carpenter和Hansen 1992)。由于细胞质外体
空间是低温下细胞结冰的初始位点, 因而认为转入
植物中的抗冻蛋白基因能表达在质外体空间则是抗
冻蛋白发挥抗冻效应的最佳场所(Meyer等 1999)。
我们前期通过激光扫描共聚焦和胶体金免疫定位研
究发现, 准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因MpAFP149
能够有效定位表达在转基因植物细胞的质外体
(Wang等 2008), 这为异源昆虫抗冻蛋白功能的发
挥提供了有利条件。
低温胁迫时间的长短决定了植物受伤害的程
度(Rajashekar等 1983)。随着胁迫时间的延长, 植
物受冷害的程度可以通过细胞内部细胞器形态的变
化反映出来(Steponkus 1984; Borochov等 1987;
Thomashow 1999)。本文结果也显示了-1 ℃低温
处理前转基因烟草和野生型烟草的细胞膜和细胞器
膜光滑完整, 边缘清晰。-1 ℃低温处理 1 d的细
胞器膜结构基本上保持完整(图 1-d~f、p~r), 这与
周蕴薇(2007)报道低温胁迫下翠南报春叶肉细胞超
微结构的变化情况一致。-1 ℃低温处理第 2和第
3天的野生型烟草的膜结构完全崩解(图 1-g~l), 而
相同处理条件下的转基因烟草膜结构仅受到较轻的
局部崩解(图1-s~x), 表明野生型植株的膜结构在低
温处理过程中遭到了严重的伤害。一般来说, 相对
电导率和丙二醛含量的变化可以在一定程度上反应
低温对植物组织膜结构的损伤情况(Fan等2002; 骆
建霞等 2005), 我们测定相同处理的野生型和转基
因烟草叶片相对电导率和丙二醛含量的结果与低温
下细胞亚显微结构受伤害的结果吻合(Wang等
2008)。
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