全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (5): 493~500 493
收稿 2013-01-17　　修定 2013-04-09
资助 国家科技支撑计划(2011BAD12B03)、国家自然科学基金
(31101536)、山东省科技攻关计划(2012GNC011111)和河
南省青年骨干教师计划(2011GGJS-075)。
* 通讯作者(E-mail: lamont@126.com; Tel: 0379-64282345)。
过表达Mdip1基因提高番茄抗低温诱导的氧化胁迫能力
晋文娟1, 张少杰1, 陈双臣1,*, 林晓民1, 贺超兴2
1河南科技大学林学院, 河南洛阳471003; 2中国农业科学院蔬菜花卉研究所, 北京100081
摘要: 采用农杆菌介导法获得了类萌发素蛋白(germin-like protein, Mdip1)超表达的转基因番茄植株, PCR和Southern杂交检
测表明, 外源基因分别以1~3个拷贝整合到番茄基因组中。Real-time PCR检测表明, 在转基因个体中目的基因已经在受体
基因组上完成整合, 且不同株系间的表达有所差异。分析了低温下转Mdip1基因株系和野生型植株中AsA、GSH含量及
H2O2累计的差异。与未转基因植株相比, Mdip1超表达植株在低温胁迫下根干重、冠干重和叶绿素含量显著高于对照, 并
显著提高了氧化还原信号AsA、GSH含量和AsA/DHA、GSH/GSSG以及GalLDH活性, 降低了低温胁迫下叶片H2O2、
MDA的积累, 降低程度与表达量相关。亚细胞定位表明, H2O2的增加主要分布在质外体。表明Mdip1基因通过调控氧化还
原信号在番茄抗氧化胁迫响应中起重要作用。
关键词: 番茄; 氧化还原信号; 类萌发素蛋白; 活性氧; 低温胁迫
Overexpression of Mdip1 Gene Enhanced Tolerance of Transgenic Tomato to
Chilling Mediated Oxidative Stress
JIN Wen-Juan1, ZHANG Shao-Jie1, CHEN Shuang-Chen1,*, LIN Xiao-Min1, HE Chao-Xing2
1Department of Forestry, Henan University of Science & Technology, Luoyang, Henan 471003, China; 2Institute of Vegetables and
Flowers, CAAS, Beijing 100081, China
Abstract: The germin-like protein gene Mdip1 was introduced into tomato line Ailsa Craig via Agrobacterium-
mediated method. Transgenic lines were confirmed for integration into the tomato genome using PCR, Southern
blot hybridization. One to three copies of the transgene were integrated into the tomato nuclear genome. Tran-
scription of Mdip1 in various transgenic lines was determined using real-time PCR. Performance test of resis-
tance analyses to chilling stress with T1 generation transgenic tomato lines showed that the transgenic lines ex-
hibited lighter symptoms of chilling injury and kept higher values of biomass accumulation and chlorophyll
content than those of non-transformed plants. The resistance levels were related to expression levels of the
transgene compared with wild-type plants, and the contents of AsA and AsA/DHA in both normal and low-temperature
conditions were increased, while the H2O2 and MDA content were decreased in the transgenic plants. Mean-
time, the contents of GSH and GSH/GSSG and GalLDH activity were also increased in the overexpression
plants. Based on these results, it can be concluded that Mdip1 may play a pivotal role in increasing tomato tol-
erance against chilling stress by increasing redox level and lowering H2O2 and lipid peroxidation accumulation.
Key words: tomato; redox signal; germin-like protein; reactive oxygen species; chilling stress
低温冷害是北方地区冬季日光温室番茄生产
的主要限制因子。在研究植物对低温等环境胁迫
的响应时发现了大量的胁迫响应基因, 其中类萌
发素蛋白(germin-like protein, GLPs)在植物对生物
和非生物胁迫的应答中起着重要的作用。GLPs是
一类与小麦萌发素(germin)序列相似性较高的、
位于胞外基质的可溶性糖蛋白, 绝大多数为稳定
的低聚物(Patnaik和Khurana 2001; Guevara-Olvera
等2012)。类萌发素蛋白几乎存在于所有的被子植
物(包括禾本科植物)、裸子植物和苔藓中(Patnaik
和Khurana 2001)。
GLPs是一种在陆生植物中普遍存在、表达量
很高的基因家族, 推测其功能多种多样, 可能与植
物的抗病反应(Manosalva等2009)、果实发育(El-
Sharkawy等2010)、抗盐反应(Hurkman等1994)、
抑制根的发育(Ham等2012)等诸多生长发育过程
有关。Park等(2004)将辣椒CaGLP1基因瞬时过量
植物生理学报494
表达, 表明CaGLP1过表达可能提高了烟草花叶病
毒的抗性。在拟南芥中过量表达大麦HvGER基因
(Zimmermann等2006)或葡萄VvGLP3基因(Godfrey
等2007)都可以显著提高转基因植株对白粉病的抗
性。Knecht等(2010)在拟南芥中过量表达糖用甜
菜BvGLP-1基因可以使拟南芥提高对轮枝菌(Verti-
cillium longisporum)和立枯丝核菌(Rhizoctonia so-
lani)的抗性, 而对幼苗中内生真菌印度梨形孢没有
影响。Rietz等(2012)对油菜菌核病菌敏感型和部
分抗性甘蓝型油菜品种接种菌核病菌 , 发现不
同的类萌发素基因表达量不同, 其中BnGLP3和
BnGLP12诱导了活性氧的爆发, 在抵御油菜菌核
病菌中起重要作用。Ham等(2012)在拟南芥中过
量表达胞间连丝间同源基因PDGLP1和PDGLP2,
发现类萌发素基因可以通过控制韧皮部介导的物
质分配抑制初生根的生长和发育。
研究表明, GLPs主要以酶(如OXO/SOD/AGP-
Pase等)、受体(如ABP19/20激素受体、Rhicad-
hesins受体)和结构蛋白的形式参与多种生理生化
过程(Patnaik和Khurana 2001)。但目前对GLPs的
功能研究主要集中在麦类作物、水稻和拟南芥上,
且已有研究大多以蛋白鉴定分析、酶的活性鉴定
为主(Chen等2011), 对其在非生物胁迫逆境下的生
理机理知之甚少。本研究采用农杆菌介导法将类
萌发素蛋白基因Mdip1导入番茄, 探讨了Mdip1过
量表达对番茄抵御低温能力的影响, 丰富了番茄
抗低温育种的基因资源。
材料与方法
1 试验材料
番茄受体材料为野生型Ailsa Craig (Lycoper-
sicon esculentum L.), 由美国加州大学番茄遗传中
心惠赠。番茄Mdip1基因和Mdip1表达载体pBI121-
Mdip1由本实验室克隆构建(图1)。Mdip1基因序列
在GenBank 的注册号为AB012138.1。总RNA微提
试剂盒购自AxyGEN生物科技公司, RNA纯化试剂
盒购自Qiagen公司, 反转录试剂盒购自Fermentas公
司, iQ多色实时定量PCR检测系统及iQ SYBR Green
超混合液购自伯乐公司, 引物由上海生工合成。
2 转基因番茄的遗传转化
参照Fillati (1987)农杆菌介导的番茄遗传转化
方法, 用叶盘法将把质粒pBI121-Mdip1导入Ailsa
Craig。将无菌番茄子叶切去叶尖和基端, 切成0.5
cm2的小块 , 正面朝下置于M 1培养基上 (MS+2
mg·L-1 ZT+0.2 mg·L-1 IAA+50 µmol·L-1 AS+15 g·L-1
蔗糖+0.5%琼脂), 28 ℃暗培养2 d。之后将预培养
的外植体浸入用MS液体培养基稀释的根癌农杆菌
悬浮液中10 min, 用无菌滤纸吸去外植体表面多余
菌液, 在M1上共培养2 d。转移至筛选培养基M2上
(MS+2 mg·L-1 ZT+0.2 mg·L-1 IAA+100 mg·mL-1卡
那霉素+500 mg·mL-1羧苄青霉素+20 g·L-1 蔗糖
+0.5%琼脂)筛选分化芽。转化的抗性芽长至1.5~
2.0 cm时, 将芽切下放入M3培养基(MS+2.0 mg·L
-1
IAA+100 mg·mL-1卡那霉素+150 mg·mL-1羧苄青霉
素+20 g·L-1蔗糖+0.5%琼脂)中诱导生根。将生根
的T0代小植株直接移入装有草炭和蛭石的营养钵
中, 遮荫保湿炼苗3~5 d, 在温室自然光照下生长。
3 转基因番茄的PCR、Southern和Real-time检测
转基因植株3~4片真叶时, 用CTAB法提取基
因组DNA, 以pBI121-Mdip1载体的质粒为阳性对
照, 以非转基因植株为阴性对照进行PCR检测。
PCR上游引物35S: 5′-GACGCACAATCCCAC-
TATCC-3′; 下游引物Mdip113: 5′-GCTGATCTCAC-
CTCAACTT-3′。PCR反应体系为25 μL, 包括2 μL
质粒DNA, 2.5 μL 2 mmol·L -1 PCR buffer, 1.8
mmol·L-1 MgCl2, 2 mmol·L
-1 dNTPs混合物, 引物各
2 μL, 0.1 μL Taq聚合酶, 加灭菌水补齐到终体积。PCR
反应条件如下: 94 ℃变性5 min; 然后进行如下循
图1 表达载体pBI121-Mdip1的T-DNA区结构图
Fig.1 Schematic diagram of the T-DNA region of vector
pBI121-Mdip1
Tnos: Nopaline合成酶终止子; Pnos: Nopaline合成酶基因启动
子; CaMV35S: Cau1iflower mosaic virus 35S启动子。
晋文娟等: 过表达Mdip1基因提高番茄抗低温诱导的氧化胁迫能力 495
环: 95 ℃预变性2.5 min; 94 ℃变性1 min, 56 ℃退火1
min, 72 ℃延伸1.5 min, 共35个循环; 最后72 ℃延
伸10 min。扩增片段在1%琼脂糖凝胶电泳检测。
用限制性内切酶HindIII完全酶切20 µg总
DNA, 经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离, 用毛细管转移
法将胶中的DNA片段转移至尼龙膜(HyBond N+)
(Amersham Pharmacia)上, 80 ℃烘干。预杂交、杂
交均用7% SDS磷酸缓冲液。所用探针为NPTII基
因扩增产物, 用32P-dCTP标记探针, 37 ℃保温1 h,
热变性后加入杂交液, 55 ℃杂交16 h。杂交膜用洗
膜液I (1×SSC, 0.1% SDS), 室温洗膜2次, 每次10
min, 洗膜液II (0.5×SSC, 0.1% SDS), 60 ℃洗膜2次,
每次10 min。
取0.2 g T1代转基因植株根尖样品提取RNA和
基因表达分析。总RNA用总RNA微提试剂盒提
取, 以RNA纯化试剂盒进行纯化。用反转录试剂
盒合成cDNA的第一条链, 作为RT-PCR的模板。
实时定量PCR 在iQ多色实时定量PCR检测系统中
进行。25 μL反应体系中包含: iQ SYBR Green超
混合液12.5 µL、cDNA 1 µL、上下游引物各0.2
µmol⋅L-1。PCR反应程序: 95 ℃预变性3 min; 95 ℃
变性10 s, 58 ℃退火45 s, 40个循环。引物序列为:
Mdip1上游引物5′-CCACGGAGATGATTTACG-
TTT-3′和下游引物5′-TTGAACCCAGCAATAA-
CAGC-3′; actin: 5′-TGGTCGGAATGGGACA-
GAAG-3′和5′-CTCAGTCAGGAGAACAGGGT-3′。
荧光数据在每个循环的退火末期采集。番茄中actin
基因的荧光值作为计算的内标, 相对基因表达水
平的计算参照Livak和Schmittgen (2001)的2-ΔΔCT
法, 重复3次。
4 转基因番茄苗期的低温处理
将转基因番茄T1代种子与对照非转基因番茄
(WT)种子播种在消毒的土壤中, 当幼苗长至5~6片
真叶时, 移入光照强度300 μmol·m-2·s-1、光照时间
14 h·d-1的人工气候箱中于25 ℃/15 ℃预处理1 d 后,
在10 ℃/8 ℃下进行低温胁迫(LT), 以25 ℃/15 ℃为
对照(control)。于处理5 d分别选取相同节位的功
能叶片, 每个处理3次重复, 液氮冷冻, –80 ℃低温
冰箱保存。
5 测定项目与测定方法
5.1 生物量和叶绿素含量的测定
分析耐冷性时, 取25 ℃/15 ℃条件下培育的五叶
期番茄, 在温度10 ℃/8 ℃、光照强度300 μmol·m-2·s-1
和光照14 h·d-1的条件下进行低温处理。低温处理
21 d后, 再移入25 ℃/15 ℃下恢复培养7 d, 测定生
物量积累、叶绿素含量变化。
5.2 AsA、GSH、MDA含量测定
AsA和DHA含量的测定依据Law等(1983)的
方法加以改进。取0.3 g样品, 加5 mL 5%三氯乙酸
(TCA)提取, 12 000×g离心15 min。取0.2 mL上清
液及用二硫苏糖醇(DTT)处理10 min的混合液, 分
别加0.2 mL水和0.5 mL PBS, 然后依次加入0.4 mL
10% TCA, 0.4 mL 44%正磷酸, 0.4 mL连吡啶(70%
乙醇溶液配制), 0.2 mL 3% FeCl3显色。放入40 ℃
水浴锅中反应40 min, 离心去除杂质, 525 nm处比
色。测定DHA时, 吸取一定量提取液加至2.0 mL
100 mmol·L-1磷酸钾缓冲液(pH 6.8)中 , 加入2
mmol·L-1 DTT后记录265 nm下的吸光值变化。
谷胱甘肽含量依据Rao和Ormrod (1995)的方
法进行测定。取0.3 g鲜样, 加适量5% TCA提取,
20 000×g离心15 min。取上清液用于GSH的测
定。取0.4 mL上清液, 然后加入0.6 mL磷酸缓冲液
稀释, 然后加入40 μL的2-乙烯基吡啶, 在25 ℃下
反应1 h, 用于测定GSSG。MDA含量测定参照赵
世杰等(1994)的方法。
5.3 叶片H2O2含量测定
H2O2的检测参照Willekens等(1997)进行。取0.3
g叶片冰浴研磨均匀, 加入3 mL 1.0 mol·L-1 HClO4,
4 ℃ 6 000×g离心5 min。取2.5 mL上清液逐滴加
入4 mol·L-1 KOH, 直到pH达6~7为止。加入0.05 g
活性炭吸附色素, 剧烈涡旋20 s后, 4 ℃ 12 000×g离
心5 min。取2 mL上清液过膜, 加入4 μL辣根过氧
化物酶(POD)、1 mL H2O2样品和994 mL反应缓冲
液测定吸收峰 412 nm。
5.4 H2O2组织化学染色和亚细胞分析
H2O2的组织化学染色参考Thordal-Christensen
(1997)的方法。取不同处理的叶圆片(直径1.5 cm)
用蒸馏水洗净后将其置于10 mL离心管中, 加入适
量DAB反应液(50 mmol·L-1 Tris-HCl, pH 3.8)。28
℃避光保存8 h后吸去各管染液, 加入80%乙醇并
沸水浴直至叶片完全脱绿后拍照(Leica DM4000;
Leica, Wetzlar, Germany)。H2O2的亚细胞定位参照
Bestwick等(1997)的方法, 在JEM-1200 EX型透射
电镜(Japan, JEOL company)下观察、照相。
植物生理学报496
5.5 半乳糖内酯脱氢酶(GalLDH)活性测定
GalLDH活性测定参照Tabata等(2001)进行。
取2 g叶片, 4 ℃下在5 mL 100 mmol·L-1磷酸钾缓冲
液(pH 7.4)中研磨成匀浆, 双层纱布过滤后在300×g
下离心, 取上清于10 000×g离心收集沉淀, 轻悬浮
于0.5 mL 100mmol·L-1磷酸钾缓冲液(pH 7.4)中作
为酶液。2.4 mL反应体积中含有2 mL 1.05 mg·mL-1
的Cyt c, 200 µL 56 mmol·L-1的L-半乳糖内酯和200
µL酶液。测定前将反应混合液于25 ℃预温育1
min, 反应从加入L-半乳糖内酯后开始计时。1个
酶活力单位定义为每分钟氧化1 nmol L-半乳糖内
酯所需的酶液量, 摩尔系数值为17.3 mmol-1·cm-1。
6 数据处理
应用DPS v 7.05软件进行数据分析, 采用Dun-
can氏法进行差异显著性检验。
实验结果
1 外源基因整合及表达检测结果
1.1 目的基因PCR检测
对得到的抗性植株进行PCR检测, 电泳检测
结果如图2。结果表明: 转基因植株均扩出与阳性
对照同样大小的980 bp的目的片段, 而未转化植株
的基因组DNA未扩增出任何条带。
1.2 转基因植株的Southern杂交和表达分析结果
提取T0代植株PCR检测呈阳性的5个株系的
DNA, 利用NPTII基因的PCR扩增片段作探针, 与酶
切后的转基因番茄基因组DNA杂交分析, 结果显
示外源基因以单拷贝或低拷贝的形式整合入番茄
基因组中, 而未转化植株无杂交带, 表明外源基因
已整合到所转化的番茄基因组中(图3-A)。为了确
证外源基因在番茄基因组中的表达, 提取PCR阳性
T1代植株的RNA, 进行转基因表达水平检测, 表明
Mdip1基因在转基因植株中都有不同程度的表达,
表达水平在各株系间有所差异(图3-B)。
2 低温胁迫下转基因番茄生物量积累和叶绿素含
量的变化
转基因与未转基因番茄在10 ℃/8 ℃低温处理
期间, 两者外观上的差别不明显。处理21 d后, 番
茄移入25 ℃/15 ℃下恢复时, 未转基因植株呈现严
重的冷害症状, 叶片逐渐萎蔫; 而转基因植株在恢
复期间仅出现轻微的冷害症状。低温胁迫后转基
因植株根干重、冠干重和叶绿素含量均显著高于
对照植株, 呈现较强的耐冷能力(表1)。
图2 T0代转基因番茄植株DNA的PCR结果
Fig.2 Detection of Mdip1 gene in T0 transgenic tomato by
PCR
M: DNA分子量标记; Lane 2: 非转基因对照(WT); Lane 3: 质
粒DNA阳性对照; Lanes 4~7: 不同转基因株系。
图3 转基因番茄植株Southern杂交(A)和基因表达分析(B)
Fig.3 Southern blot and real-time analysis of PCR-positive transformed plants with Mdip1
Lane C: 非转基因对照(WT); Lane P: 质粒DNA阳性对照; Lanes T1~T5: 不同T0代转基因株系; M2~M16: 不同T1代转基因株系; NT: 非转
基因株系, 不同小写字母表示不同株系测定值间具有显著性差异(P<0.05)。图4~6和表1同此。
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3 低温胁迫下转基因番茄叶片中AsA、GSH和
MDA含量的变化
由图4可知, 转Mdip1基因植株AsA、AsA+
DHA的含量、AsA/DHA的比值均有所增加, 但对
GSH、GSH+GSSG含量则无明显影响。低温胁迫
下, 转基因植株与对照抗坏血酸含量均明显增加,
转基因植株中AsA含量、AsA/DHA显著高于对照,
且与Mdip1的表达量正相关, 其中M10的AsA含量、
AsA/DHA比未转化植株分别高出58.13%、135.63%。
同样, 低温下转基因植株中GSH、GSH+GSSG含
量和GSH/GSSG较对照也明显增加, GSH含量、
GSH/GSSG分别较未转基因对照提高33.33%和
图4 Mdip1过量表达对低温胁迫下番茄叶片中AsA、GSH和MDA含量的影响
Fig.4 Analysis of AsA, GSH and MDA content in the leaves of T1 transformed plants
表1 Mdip1过量表达对低温胁迫下番茄生物量积累和叶绿素含量的影响
Table 1 Analysis of biomass accumulation and chlorophyll content of T1 transformed plants
株系
根干重/g 冠干重/g
总干重增量/g
叶绿素含量/mg·g-1
胁迫前 胁迫后 胁迫前 胁迫后 胁迫前 胁迫后
WT 0.134a 0.145b 0.61a 0.70b 0.101b 11.84a 7.88b
M2 0.136
a 0.165a 0.63a 0.80a 0.199a 11.87a 12.71a
M10 0.138
a 0.176a 0.65a 0.85a 0.238a 12.88a 11.44a
植物生理学报498
59.20%。同时, 低温处理植株后显著增加了转基因
植株与对照叶片的MDA含量, 但转基因植株中MDA
含量显著低于对照, 其中M10较对照降低54.52%。
4 低温胁迫下转基因番茄叶片中H2O2积累的变化
如图5-A所示, 在正常生长条件下, 转基因植
株与对照H2O2含量无显著差异。在低温胁迫下,
未转化叶片H2O2含量显著提高。而不同转化株系
间H2O2含量与外源基因的表达相关, 过量表达植
株M2、M6、M10叶片中H2O2含量较未转化植株分
别降低了43.8%、49.9%和58.1%。利用DAB组织
化学染色法得到了相同的结果(图5-B), 转基因植
株H2O2积累较对照相比明显降低。进一步用CeCl3
染色法对H2O2的亚细胞定位表明(图5-B), H2O2的
增加主要分布在叶肉细胞细胞壁的背壁和质外体,
而在叶绿体、线粒体、细胞核及液泡等组织内基
本没有或有少量的H2O2产生。
5 低温胁迫下转基因番茄叶片中GaILDH活性的
变化
高等植物主要通过L-半乳糖途径合成AsA
(Wheeler等1998), L-半乳糖内酯脱氢酶(GalLDH)
直接氧化L-半乳糖内酯生成AsA。由图6可知, 不
同转Mdip1基因植株中GaILDH活性均有所增加,
但差异不显著。低温胁迫下, 转基因植株GaILDH
活性显著高于对照, 且与Mdip1的表达量正相关, 其
中M10的GaILDH活性比未转化植株高出59.85%。
讨　　论
近年来的研究发现GLPs在调节植物防御反应
方面具有重要作用。通过瞬时超表达和基因沉默
手段证明, GLPs家族作为复杂的数量性状位点, 对
植物病原真菌、细菌、病毒起到广谱抗性作用
(Manosalva等2009; Guevara-Olvera等2012)。在本
研究中 , 利用农杆菌介导转化番茄叶盘得到了
图5 Mdip1过量表达对低温胁迫下番茄叶片中H2O2含量的影响
Fig.5 H2O2 content and accumulation analysis of T1 transformed plants
图6 Mdip1过量表达对低温胁迫下番茄叶片中GaILDH 活
性的影响
Fig.6 GaILDH activity analysis of T1 transformed plants
Mdip1过量表达的植株。转基因T1株系在低温胁
迫下, 抗性均比对照有明显提高, 所得到的稳定表
达的T1株系对于番茄耐低温育种有着实际的应用
价值。
晋文娟等: 过表达Mdip1基因提高番茄抗低温诱导的氧化胁迫能力 499
氧化还原反应是生物体生长发育过程中能量
转化分配的基本代谢过程, 有关氧化还原信号在
植物生长发育、生理代谢、基因表达和抗逆中的
作用日益受到人们的广泛关注(Jiang等2012; Dietz
2008)。抗坏血酸和谷胱甘肽是具有氧化还原活性
的分子, 通常植物体以氧化还原状态的改变来响
应生物或非生物胁迫。在遭遇逆境胁迫时, 植株
可通过调节以GSH-AsA为核心的活性氧清除系统,
减轻伤害(Noctor 2006; Dietz 2008)。氧化还原状
态(AsA/DHA比率)、AsA的含量及其合成与代谢
相关酶类活性的变化涉及植物对一系列逆境胁迫
的响应。在番茄根中, Shalata等(2001)发现, 盐胁
迫使盐敏感品种的AsA含量降低, DHA的含量明
显升高, AsA /DHA比率降低; 然而盐耐受品种与之
刚好相反, 表明番茄较高的抗盐性, 至少部分地来
自于AsA含量、AsA/DHA比率和某些相关酶活性
的提高。Burkey等(2003)发现, 在臭氧胁迫条件下,
食荚菜豆叶中总AsA的含量耐受品种比敏感品种
高, 且能维持相对较高的AsA库; 此外, 质外体总AsA
含量耐受品种远远高于敏感品种, 其AsA/(AsA+
DHA)比率也相对较高, 表明植物臭氧忍耐性与质
外体AsA的含量和氧化还原状态密切相关。本研
究中, 在低温胁迫下, 转基因植株与野生型植株相
比, Mdip1过量表达植株AsA含量、AsA/DHA均高
于野生型植株, 且膜脂过氧化产物MDA含量和
H2O2累计均显著低于野生型植株。同时, 转基因
植株GSH含量无显著变化, 但低温下GSH含量则
明显高于对照。进一步通过亚细胞检测表明, 未
转化植株H2O2在质外体中大量累积。Aria和Ramin
(2009)和李超汉等(2009)研究表明, 施用外源AsA
可降低逆境下植株中MDA的积累。本研究中转基
因植株中MDA含量的降低可能与Mdip1基因的超
量表达增加内源AsA含量有密切关系。同时, 未转
化植株中AsA合成下降, 导致质外体AsA氧化还原
状态过氧化, 而AsA是质外体唯一的redox缓冲体
系, 并且质外体的抗氧化能力很弱(Pignocchi等
2003), 从而使H2O2过度累积, 因此, Mdip1可能通
过H2O2信号途径调节植物的防卫反应。
我们发现, 与对照相比, 低温下转化植株叶片
中维持了较高GalLDH活性(图6), 从而叶片能持续
合成AsA, 这可能是逆境下转基因植株积累AsA的
主要原因 , 表明低温下AsA的合成至少部分受
GalLDH活性的调节。An等(2004)研究表明, 刺梨
不同器官中AsA的积累量与GalLDH基因表达水平
具高度的协同性, 即在AsA积累量更高的器官中
GalLDH基因的表达也更强, 这与本研究结果是一
致的。以上结果说明, 表明番茄Mdip1基因通过调控
redox信号而对植物抗氧化胁迫起到了积极作用。
对T1代H2O2和MDA含量检测结果表明, 各转
基因株系间抗冷性有所差异。已有研究表明抗性
的强弱与基因表达水平间存在相关性(Duan等
2012; Yarra等2012)。但也有研究结果表明抗性的
强弱与基因表达水平间的相关性存在争议(Park等
2005)。本研究对T1代植株转基因表达和抗冷性分
析表明, Mdip1基因的表达水平较高的株系M6、
M10抗性较强, 而基因表达较弱的M2膜脂过氧化产
物MDA和活性氧累计较多, 表明各株系的抗性能
力与外源基因的表达量相关。进一步分析表明,
外源基因的表达水平与外源基因的插入拷贝数无
直接关系, 这与前人结果相一致(Moravčíková等
2004)。
参考文献
李超汉, 张琳, 史庆华, 李青竹, 郭晓青, 李霞, 于贤昌(2011). GM-
Pase超表达对番茄植株抗坏血酸含量及耐冷性相关生理指标
的影响. 园艺学报, 38: 692~700
赵世杰, 许长成, 邹琦(1994). 植物组织中丙二醛测定方法的改进.
植物生理学通讯, 30: 207~210
An HM, Chen LG, Fan WG (2004). cDNA fragment cloning of L-ga-
lactono-1,4-lactone dehydrogenase and its expressionin different
organs of R. roxburghii Tratt. Agr Sci China, 3: 807~811
Aria D, Ramin SJ (2009). Impact of exogenous ascorbic acid on anti-
oxidant activity and some physiological traits of common bean
subjected to salinity stress. Not Bot Horti Agrobo, 37: 165~172
Bestwick CS, Brown IR, Bennett MHR, Mansfield JW (1997). Lo-
calization of hydrogen peroxide accumulation during the hyper-
sensitive reaction of lettuce cells to Pseudomonas syringae pv
phaseolicola. Plant Cell, 9: 209~221
Burkey KO, Eason G, Fiscus EL (2003). Factors that afect leaf ex-
tracellular ascorbic acid content and redox status. Physiol Plant,
117: 51~55
Chen XP, Wang ML, Holbrook C, Culbreath A, Liang XQ, Bren-
neman T, Guo BZ (2011). Identification and characterization of
a multigene family encoding germin-like proteins in cultivated
peanut (Arachis hypogaea L.). Plant Mol Biol Rep, 29: 389~403
Dietz KJ (2008). Redox signal integration: from stimulus to networks
and genes. Physiol Plantarum, 133: 459~468
Duan M, Feng HL, Wang LY, Li D, Meng QW (2012). Overexpres-
sion of thylakoidal ascorbate peroxidase shows enhanced resis-
tance to chilling stress in tomato. J Plant Physiol, 169: 867~877
植物生理学报500
El-Sharkawy I, Mila I, Bouzayen M, Jayasankar S (2010). Regulation
of two germin-like protein genes during plum fruit development.
J Exp Bot, 61: 1761~1770
Fillati JJ, Kiser J, Rose R, Luca C (1987). Efficient transfer of a gly-
phosate tolerance gene into tomato using a binary Aprobacterium
tumefaciens vector. Biotechnology, 5: 726~730
Godfrey D, Able AJ, Dry IB (2007). Induction of a grapevine germin-
like protein (VvGLP3) gene is closely linked to the site of Ery-
siphe necator infection: A possible role in defense? Mol Plant
Microbe In, 20: 1112~1125
Guevara-Olvera L, Ruiz-Nito ML, Rangel-Cano RM, Torres-Pacheco
I, Rivera-Bustamante RF, Muñoz-Sánchez CI, González-Chavira
MM, Cruz-Hernandez A, Guevara-González RG (2012). Expres-
sion of a germin-like protein gene (CchGLP) from a geminivi-
rus-resistant pepper (Capsicum chinense Jacq.) enhances toler-
ance to geminivirus infection in transgenic tobacco. Physiol Mol
Plant Pathol, 78: 45~50
Ham BK, Li G, Kang BH, Zeng F, Lucas WJ (2012). Overexpression
of Arabidopsis plasmodesmata germin-like proteins disrupts root
growth and development. Plant Cell, 24: 3630~3648
Hurkman WJ, Lane BG, Tanaka CK (1994). Nucleotide sequence of a
transcript encoding a germin-like protein that is present in salt-
stressed barley (Hordeum vulgare L.) roots. Plant Physiol, 104:
803~804
Jiang YP, Cheng F, Zhou YH, Xia XJ, Mao WH, Shi K, Chen Z, Yu
JQ (2012). Cellular glutathione redox homeostasis plays an
important role in the brassinosteroid-induced increase in CO2 as-
similation in Cucumis sativus. New Phytol, 194: 932~943
Knecht K, Seyffarth M, Desel C, Thurau T, Sherameti I, Lou BG,
Oelmuller R, Cai DG (2010). Expression of BvGLP-1 encoding
a germin-like protein from sugar beet in Arabidopsis thaliana
leads to resistance against phytopathogenic fungi. Mol Plant Mi-
crobe In, 23: 446~457
Law MY, Charles SA, Halliwell B (1983). Glutathione and ascorbic-
acid in spinach (Spinacia oleracea) chloroplasts-the effect of
hydrogen-peroxide and of Paraquat. Biochem J, 210: 899~903
Livak KJ, Schmittgen TD (2001). Analysis of relative gene expres-
sion data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method.
Methods, 25: 402~408
Manosalva PM, Davidson RM, Liu B, Zhu XY, Hulbert SH, Leung
H, Leach JE (2009). A germin-like protein gene family functions
as a complex quantitative trait locus conferring broad-spectrum
disease resistance in rice. Plant Physiol, 149: 286~296
Moravčíková J, Matušíková I, Libantová J, Bauer M, Mlynárová L
(2004). Expression of a cucumber class III chitinase and Nicoti-
ana plumbaginifolia class I glucanase genes in transgenic potato
plants. Plant Cell Tiss Org, 79: 161~168
Noctor G (2006). Metabolic signalling in defence and stress: the
central roles of soluble redox couples. Plant Cell Environ, 29:
409~425
Park CJ, An JM, Shin YC, Kim KJ, Lee BJ, Paek KH (2004). Molecu-
lar characterization of pepper germin-like protein as the novel
PR-16 family of pathogenesis-related proteins isolated during
the resistance response to viral and bacterial infection. Planta,
219: 797~806
Park SM, Lee JS, Jegal S, Jeon BY, Jung M, Park YS, Han SL, Shin
YS, Her NH, Lee JH, et al (2005). Transgenic watermelon
rootstock resistant to CGMMV (cucumber green mottle mosaic
virus) infection. Plant Cell Rep, 24: 350~356
Patnaik D, Khurana P (2001). Germins and germin like proteins: an
overview. Indian J Exp Biol, 39: 191~200
Pignocchi C, Fletcher JE, Barnes J, Barnes JD, Foyer CH (2003).
The function of ascorbate oxidase (AO) in tobacco (Nicotiana
tabacum L.). Plant Physiol, 132: 1631~1641
Rao MV, Ormrod DP (1995). Impact of UVB and O3 on the oxygen-
free radical scavenging system in Arabidopsis thaliana geno-
types differing in flavonoid biosynthesis. Photoch Photobio Sci,
62: 719~726
Rietz S, Bernsdorff FE, Cai D (2012). Members of the germin-like
protein family in Brassica napus are candidates for the initiation
of an oxidative burst that impedes pathogenesis of Sclerotinia
sclerotiorum. J Exp Bot, 63: 5507~5519
Shalata A, Mitova V, Volokita M, Guy M, Tal M (2001). Response of
the cultivated tomato and its wild salt-tolerant relative Lycoper-
sicon pennellh to salt-dependent oxidativestress: The root anti-
oxidative system. Physiol Plant, 112: 487~494
Tabata K, Oba K, Suzuki K, Esaka M (2001). Generation and proper-
ties of ascorbic acid-deficient transgenic tobacco cells expressing
antisense RNA for L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase. Plant
J, 27: 139~148
Thordal-Christensen H, Zhang Z, Wei Y, Collinge DB (1997). Sub-
cellular localization of H2O2 in plants: H2O2 accumulation in
papillae and hypersensitive response during the barley-powdery
mildew interaction. Plant J, 11: 1187~1194
Wheeler GL, Jones MA, Smirnoff N (1998). The biosynthetic path-
way of vitamin C in higher plants. Nature, 393: 365~369
Willekens H, Chamnongpol S, Davey M, Schraudner M, Langebartels
C, Van Montagu M, Inzé D, Van Camp W (1997). Catalase is a
sink for H2O2 and is indispensable for stress defence in C3 plants.
EMBO J, 16: 4806~4816
Yarra R, He SJ, Abbagani S, Ma B, Bulle M, Zhang WK (2012).
Overexpression of a wheat Na+/H+ antiporter gene (TaNHX2)
enhances tolerance to salt stress in transgenic tomato plants (So-
lanum lycopersicum L.). Plant Cell Tiss Org, 111: 49~57
Zimmermann G, Baumlein H, Mock H, Himmelbach A, Schweizer P
(2006). The multigene family encoding germin-like proteins of
barley. Regulation and function in basal host resistance. Plant
Physiol, 142: 181~192