全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (6): 797~800　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0040 797
收稿 2014-02-10　　修定 2014-05-04
资助 国家自然科学基金 (31360485)、广西自然科学基金
(2012GXNSFBA053076)和玉林师范学院博士启动基金
(G20130013)。
* 通讯作者(E-mail: wxmin99@163.com; Tel: 0775-2679937)。
过表达ZmSKIP基因提高烟草抗低温胁迫的能力
叶晓霞1, 燕芳2, 龙海桂1, 王小敏1,*
1玉林师范学院生命科学与技术学院, 广西玉林537000; 2重庆大学生命科学学院, 重庆400044
摘要: 以野生型和过表达ZmSKIP基因烟草为试材, 研究了低温胁迫下过表达ZmSKIP对烟草抗氧化能力的影响。测定了不
同低温处理时间下过表达ZmSKIP转基因烟草T3代植株和野生型植株抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶
(CAT)、过氧化物酶(POD)活性和丙二醛(MDA)含量以及相对电导率, 结果表明, 低温下, 相对于野生型植株, 转基因烟草具
有较高的抗氧化酶活性和较低的相对电导率和MDA含量, 说明过表达ZmSKIP提高了转基因植株的耐低温胁迫能力。
关键词: ZmSKIP; 低温胁迫; 抗氧化酶; 电导率
Overexpression of ZmSKIP Enhanced Tolerance to Chilling Stress in Tobacco
(Nicotiana tabacum)
YE Xiao-Xia1, YAN Fang2, LONG Hai-Gui1, WANG Xiao-Min1,*
1College of Life Science and Technology, Yulin Normal University, Yulin, Guangxi 537000, China; 2College of Life Sciences,
Chongqing University, Chongqing 400044, China
Abstract: The wild type (WT) and transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) lines with overexpression of
ZmSKIP were used to investigate the antioxidant ability under chilling stress. The activities of antioxidant en-
zymes including superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) and catalase (CAT), malondialdehyde (MDA)
content and relative electrical conductivity of T3 transgenic tobacco plants overexpressing ZmSKIP and WT to-
bacco plants were examined under chilling stress. Compared to WT plants, transgenic tobacco plants overex-
pressing ZmSKIP displayed higher antioxidant enzyme activity, lower MDA content and relative electrical con-
ductivity under chilling stress. These results indicated that overexpression of ZmSKIP improved the plant
antioxidant ability and the chilling tolerance.
Key words: ZmSKIP; chilling stress; antioxidant enzyme; electrical conductivity
低温胁迫是植物栽培中常常遇到的一种灾害,
它不仅影响植物的生长发育, 限制作物的产量, 甚
至影响植物在地球上的分布(江福英等2002)。在
我国北方大部分地区和南方的早春、晚秋季节,
农作物生产频繁地遭受低温冷害, 导致农作物的
产量和品质的下降。利用现代作物分子育种技术
培育耐低温作物品种首先依赖于对植物适应低温
胁迫的分子调控机理和抗逆基因的发掘。SKIP
(ski-interacting protein)基因最早以癌症基因v-Ski
为诱饵通过酵母双杂交分离出来(Dahl等1998)。
所有的SKIP同源蛋白都具有一个绝对保守的
SNW/SKIP结构域的S-N-W-K-N氨基酸序列, 该序
列很可能对于维持SKIP基因作为共剪切因子的转
录和剪切功能是必需的(Folk等2004)。SKIP作为
剪切因子参与了pre-mRNA的剪切、转录延伸及
成熟mRNA运输等整个过程(Hou等2009), 在ABA
信号途径中参与了植物响应非生物胁迫过程(Lim
等2010)。我们已克隆了玉米中SKIP同源基因
ZmSKIP, 发现过表达ZmSKIP基因能够提高转基因
烟草的抗旱、抗盐能力(Wang等2013)。然而, 目
前尚未见到有关SKIP基因提高抗寒能力的报道。
本文对转SKIP基因植株进行低温胁迫处理, 研究
过表达ZmSKIP烟草在低温胁迫下抗氧化酶活性的
变化以及细胞膜的稳定性。
材料与方法
1 植物材料的培养与低温处理
烟草(Nicotiana tabacum L. cv. ‘Wisconsin 38’)
由实验室保存, 过表达ZmSKIP转基因烟草T3代植
植物生理学报798
株由前期实验获得(Wang等2013)。所有植株种植
于普通温室, 生长条件为: 温度(25±2) ℃, 光周期16
h光/8 h暗, 光照强度250 µmol·m-2·s-1, 湿度80%。
将野生型和转基因烟草种子灭菌后分别接
种在MS和含卡那霉素100 mg·L-1的MS培养基上,
培养20 d后, 将植株移栽到装有土壤的塑料袋中培
养20 d, 挑选生长一致的植株, 分成2组, 分别置人工
气候箱25和4 ℃培养, 在处理0、24、48、72 h时取
样。
2 方法
2.1 酶液的提取
酶液提取参照丁海东等(2011)的方法, 精确称
取2 g植物叶片, 置于预冷的研钵中, 加入4% PVPP
和1.8 mL的抽提缓冲液[含50 mmol·L-1磷酸缓冲液
(pH 7.6)、0.1 mmol·L-1 EDTA、0.5 % (W/V) Triton
X-100], 冰上研磨成匀浆, 全部转入5 mL干净的离
心管中, 于4 ℃、13 000×g离心10 min, 将上清液转
移至干净的2 mL离心管, 保存于冰上备用。
2.2 抗氧化酶活性的测定
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)
活性测定参照Beyer和Fridovich (1987)的方法, 用
氮蓝四唑(NBT)显色反应后计算其活性, 以抑制
NBT光还原50%作为1个酶活性单位[U·mg-1 (FW)];
过氧化氢酶(catalase, CAT)活性测定参照Corbisier
等(1987)和Chen等(2012)方法, 采用紫外分光光度
法, 以25 ℃下100 s内在反应体系中分解50%的
H2O2的酶量为1个酶单位[U·mg
-1 (FW)]; 过氧化物
酶(peroxidase, POD)活性测定参照Polle等(1994)的
方法, 采用愈创木酚显色反应, 以每分钟OD470变化
0.01为1个酶活性单位[U·mg-1 (FW)]。
2.3 丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量测定
MDA含量测定参照Hara等(2003)和Lokhande
等(2011)方法, 采用硫代巴比妥酸(TBA)显色反应,
在紫外分光光度计于波长532和600 nm下测定。
2.4 相对电导率测定
相对电导率参照王玉等(2014)的方法, 准确称
取2 g烟草叶片, 切成均匀大小, 放在盛有20 mL双
蒸水的烧杯中, 在真空干燥器中抽气浸泡0.5 h以抽
去植物叶片中的气泡, 迅速用滤纸吸干表面水分,
放入装有30 mL双蒸水的大试管中, 振荡30 min, 用
电导仪测定溶液的电导率(L1); 再将试管放在沸水
中 , 加热煮沸 , 彻底破坏材料的膜结构后冷却
10~15 min至室温, 再测定溶液中的电导率(L2)。按
以下公式计算细胞膜渗透率: Le=(L1–空白)/(L2–空
白)×100%。
3 数据统计
所有实验均有3个平行设计, 运用DPS 7.05数
据分析统计软件和Excel对试验数据进行处理。
实验结果
1 转ZmSKIP基因提高了烟草植株耐低温胁迫的
能力
从图1可以看出, 在25 ℃生长条件下, 野生型和
转基因烟草植株生长并没有太大的差异; 在低温中
处理72 h后, 两者都受到了不同的伤害, 但转基因烟
草植株叶片萎蔫程度要小于野生型, 说明在烟草中
过表达ZmSKIP能提高植株对低温胁迫的抗性。
2 过表达ZmSKIP基因提高了烟草植株叶中抗氧
化酶活性
由图2-A可知, 转基因烟草植株叶片中CAT活
图1 常温和低温条件下野生型及转基因植株的表型
Fig.1 Phenotypes of WT and transgenic tobacco plants at room temperature (25 ℃) or low temperature (4 ℃)
叶晓霞等: 过表达ZmSKIP基因提高烟草抗低温胁迫的能力 799
性显著高于野生型植株, 而两者的SOD和POD活
性差异不明显。低温处理对野生型的CAT活性影
响不明显, 但显著提高了转基因植株的CAT活性。
低温处理48 h内, 低温可诱导提高野生型的SOD和
POD活性, 随着处理时间的延长, 酶活性水平有回
落, 转基因植株叶片中的SOD和POD活性水平显
著高于野生型。说明过表达ZmSKIP基因提高了转
基因烟草在低温胁迫下的抗氧化酶活性。
3 转ZmSKIP基因提高了烟草植株叶片在低温下
细胞膜结构的稳定性
从图3-A可以看出, 随着低温处理时间的延
长, 叶片MDA含量也随着升高, 在处理24和72 h时,
野生型植株的MDA含量显著高于转基因植株, 尽
管在处理48 h时转基因烟草的MDA含量与野生型
植株的MDA含量差别不明显, 但从图3-B可以看
出, 在低温处理后, 叶片相对电导率都有明显上升,
在处理24和48 h, 野生型植株相对电导率显著高于
转基因植株。这表明在低温胁迫下, 过表达ZmSKIP
烟草提高了细胞膜的稳定性和抗氧化能力。
讨　　论
SKIP在植物生长发育和抵抗非生物胁迫伤害
中起着很重要的调节作用: Hou等(2009)最早报道在
水稻中过表达OsSKIPa能提高转基因植株的耐干旱
和高盐胁迫能力; Lim等(2010)也报道在拟南芥中过
表达AtSKIP明显地提高了转基因植株的耐旱和高
盐的能力; 2013年, 我们从玉米中分离得到ZmSKIP,
并证明该基因具有提高转基因烟草的耐旱和高盐
的能力(Wang等2013)。在本文中, 我们进一步证明
ZmSKIP具有提高转基因烟草的耐低温能力。
图2 低温处理对野生型和转基因植株叶中
抗氧化酶活性的影响
Fig.2 Effects of chilling treatment on activities of antioxidant
enzymes in leaves of WT and transgenic plants
*: P<0.05; **: P<0.01。
图3 低温对野生型和转基因植株MDA含量
和相对电导率的影响
Fig.3 Effects of chilling treatment on MDA content and rela-
tive electrical conductivity in WT and transgenic plants
**: P<0.01。
植物生理学报800
植物在正常的代谢过程中, 当叶绿体、线粒
体和质膜上的电子传递至分子氧时会产生活跃的
活性氧(reactive oxygen species, ROS), 如: 氢氧根
负离子(OH-)、自由羟基(·OH)、过氧化氢(H2O2)、
超氧物阴离子自由基(O2.
–)、单线态氧(1O2)等(Apel
和Hirt 2004; Gill和Tuteja 2010)。植物细胞内活性
氧存在双重功能, 活性氧能作为信号分子对很多
生理过程诸如细胞生长、周期性调控、程序性死
亡以及非生物胁迫做出应答, 同时体内活性氧的
增加能导致细胞的毒害(Mittler 2002)。植物体内
有着一个活性氧调节的基因网络, 活性氧的产生
与活性氧清除体系是一种动态平衡的状态, 产生
的活性氧能及时被植物体内抗氧化酶去除, 这些
抗氧化酶主要有SOD、CAT、POD、抗坏血酸过
氧化物酶(APX)、谷胱甘肽还原酶(GR)、脱氢抗
坏血酸还原酶(DHAR)和谷胱甘肽过氧化物酶
(GPX)等(Mittler 2002)。因此, 活性氧清除系统为
维持细胞内一个较低水平的平衡提供了保证。在
非生物胁迫条件下, 植物的抗氧化酶活性越高, 清
除活性氧的能力越强, 植物抵抗非生物胁迫的能
力就越强(Choi等2004; Mittler 2002), 通过基因工
程操作的研究也表明过表达抗氧化酶基因有明显
提高转基因植株耐非生物胁迫的能力(丁海东等
2011; 王玉等2014)。Hou等(2009)发现, 过表达Os-
SKIPa提高转基因植株的耐干旱和高盐胁迫能力
可能是通过提高转基因植株在胁迫下的SOD活性
和抗性转录因子(如CBF2、PP2C和RD22)的表达
水平。我们之前的研究也表明, ZmSKIP提高转基
因烟草的耐旱和耐高盐的能力与该基因有提高转
基因植株在胁迫下叶片的CAT和SOD活性以及上
调CAT、APX和PR5基因的表达有关。在本研究
中, 我们发现转ZmSKIP显著地提高了低温胁迫下
转基因植株叶片抗氧化酶CAT、SOD和POD的活
性, 进而减轻低温胁迫处理引发的膜脂过氧化的
损伤程度, 增加细胞膜结构的稳定。
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