全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (12): 1355~1358 1355
收稿 2013-06-24　　修定 2013-08-27
资助 波音(中国)投资有限公司科研项目、国家自然科学基金
(31000144)和陕西省教育厅科研计划项目(12JK0846)。
致谢 尹久盛老师和陈闽老师对该研究精心指导和帮助。
* 通讯作者(E-mail: weiyahui@nwu.edu.cn; Tel: 029-88302199)。
钾离子对长柄扁桃不定芽诱导的影响
郭斌, 陈邦, 吴道长, 车德路, 尉亚辉*, 申烨华, 李聪
西北大学生命科学学院, 西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室, 陕西省生物技术重点实验室, 西安710069
摘要: 研究了钾离子对长柄扁桃不定芽诱导的影响, 结果表明, 在MS基本培养基中添加800~1 200 mg·L-1钾离子有利于长柄
扁桃不定芽的形成和生长, 不定芽的诱导率和数量分别比对照提高了17%和84%, 不定芽的平均高度提高了64%; 高浓度钾
离子(>1 600 mg·L-1)可导致长柄扁桃不定芽严重褐化。生理指标测定结果表明, 适当浓度的钾离子提高了抗氧化酶(SOD和
POD)的活性和不定芽的组织细胞活力; 高剂量的钾离子(>1 600 mg·L-1)显著增加了不定芽中MDA的含量。
关键词: 钾离子; 长柄扁桃; 不定芽
Effects of Potassium Ion on Adventitious Bud Induction of Amygdalus pedunculata
GUO Bin, CHEN Bang, WU Dao-Chang, CHE De-Lu, WEI Ya-Hui*, SHEN Ye-Hua, LI Cong
Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China, Ministry of Education, Shaanxi Provincial Key
Laboratory of Biotechnology, College of Life Sciences, Northwest University, Xi’an 710069, China
Abstract: The effects of potassium ion on adventitious bud induction of Amygdalus pedunculata were studied.
The results showed that the optimal concentration range of potassium ions is 800–1 200 mg·L-1. The
adventitious bud induction frequency and the bud number per explants increased by 17% and 84%, respectively,
compared to those cultured in MS basic medium without additional potassium nutrition. And the height of the
adventitious bud increased by 64%. However, the high concentrations of potassium ions (>1 600 mg·L-1) caused
adventitious buds serious browning. The physiological indexes suggested that appropriate potassium concentra-
tions increased antioxidant enzymes (SOD and POD) activities and adventitious bud viability. High dose of po-
tassium ions (>1 600 mg·L-1) significantly increased the malondialdehyde content in adventitious bud.
Key words: potassium ion; Amygdalus pedunculata pall.; adventitious bud
长柄扁桃(Amygdalus pedunculata Pall.)是蔷
薇科(Rosaceae)桃属扁桃亚属(Subg. Amygdalus)的
落叶灌木, 又名野樱桃、柄扁桃、毛樱桃, 是我国
特有的扁桃亚属野生种(孙占育等2010)。长柄扁
桃有强大的根系, 具有防风固沙的优良特性; 另外,
其果实中含致泻成分郁李仁甙, 对气管炎、高血
压、神经衰弱、肺炎、糖尿病都有一定疗效; 长
柄扁桃种仁中油含量在55%以上, 是一种极具开发
潜力的生物能源植物(李聪等2010)。但是由于人
为破坏, 长柄扁桃的分布面积日趋减少, 已被列为
二级濒危植物(赵一之1992)。为了加速长柄扁桃
的快速繁殖, 孙占育等(2008)、孙占育(2010)已经
建立了长柄扁桃的快速繁殖平台, 为长柄扁桃的
人工繁殖提供了新的途径。
我们在长柄扁桃离体培养过程中发现, 以实
生苗的节为外植体在人工培养基上诱导不定芽的
形成, 芽的玻璃化和褐化程度比较高, 对不定芽的
诱导和生长产生严重影响。为此, 我们对野生长
柄扁桃中矿质元素含量进行了测定(原子吸收光谱
法), 发现钾离子含量比一般植物中的含量高很多,
达到1 542.79 mg·kg-1。本文主要研究钾离子对长柄
扁桃不定芽诱导(包括不定芽的数量、状态等)的影
响, 为提高长柄扁桃的离体繁殖效率提供依据。
材料与方法
1 植物材料与培养
长柄扁桃(Amygdalus pedunculata Pall.)种子
采自陕西神木毛乌素沙漠, 去掉外壳, 挑选完好的
种仁, 用70%酒精浸泡45 s, 再用0.1%的氯化汞灭
菌5 min, 无菌水清洗5~6次, 然后接种到无激素的
MS固体培养基中培养。
植物生理学报1356
一周后种子萌发, 待幼苗长至3个节后, 取其节
部, 接种到以MS培养基为基础培养基及添加不同
浓度钾离子(以氯化钾的形式添加)的不定芽诱导培
养基上, 培养基中含有2 mg·L-1 6-BA和0.2 mg·L-1
NAA以及4%蔗糖、0.2%聚乙烯吡咯烷酮, pH 5.8。
每瓶接种3~5个节, 每个处理5瓶, 重复3次, 对照组
不添加钾离子。在温度25~28 ℃、光照强度25~30
μmol·m-2·s-1和光照时间16 h·d-1条件下培养35 d。
2 测定方法
2.1 细胞活力的测定
参考Steponkus和Lanphear (1967)方法。取培
养不同时间的长柄扁桃不定芽200 mg (鲜重), 放于
10 mL试管中, 加入0.4% TTC液2.5 mL, pH 7.0的磷
酸缓冲液2.5 mL, 混匀, 用针筒抽真空, 然后于25
℃处理13~16 h。去上清液, 加入5 mL水, 如此方法
洗涤3次, 再用剪刀将材料剪碎, 加入95%乙醇5
mL, 60 ℃水浴保温30 min。再置于室温下至组织
完全无色。于485 nm处测其吸光度, 不定芽组织
的细胞活力以OD485值表示。
2.2 SOD、POD和CAT活性测定
取生长不同阶段的不定芽, 放于预冷的研钵
中, 加入10 mL预冷的提取液, 提取液中含0.5 mol·L-1
的Tris-HCl缓冲液(pH 6.8)。研磨后的提取液在
15 000×g下冷冻离心20 min。上清液用来测定酶
活性。所有操作均在4 ℃条件下进行。SOD活性
测定按照Giannopolitis和Ries等(1977)的方法; POD
活性按照Hammerschmidt等(1982)的方法测定。
CAT活性按照Arrigoni等(1992)的方法测定。
2.3 MDA (丙二醛)含量测定
按李合生(2000)的方法测定。
3 统计方法
所有的试验采取随机取样进行, 每个水平至
少重复3次。SPSS 13.0软件在P<0.05水平上对数
据进行单因素方差和邓肯多重范围检验。
结果与讨论
1 钾离子浓度对长柄扁桃不定芽诱导的影响
从表1和图1可知, 钾对长柄扁桃不定芽的诱
导有显著影响。当添加钾离子的剂量在400~1 200
mg·L-1时, 不定芽的诱导频率和每个外植体上不定
芽的数量逐渐增高, 最高分别达到84%和4.6个; 不
定芽的平均高度达到2.3 cm, 和对照相对比有显著
提高, 但褐化的芽比例没有显著变化。当添加钾
离子的剂量大于1 200 mg·L-1时, 芽诱导频率和数
量都显著减低, 且褐化芽比例也显著增多。
对不同处理的不定芽的细胞活力进行测定,
结果表明添加钾离子的剂量显著影响不定芽的活
力。当添加钾离子的剂量为1 200 mg·L-1时, 不定
芽的细胞活力最高, 比对照提高了69%。随着添加
的钾离子剂量继续增高, 芽的细胞活力显著降低,
褐化程度也增大(图1-C、 D)。
从表1可知, 钾对长柄扁桃不定芽的分化有一
定影响。董丽芬等(2006)等在培养油松胚时也发
现在MS基本培养基中添加适量钾离子可提高不定
芽的诱导效率, 这和我们实验结果相类似(表1)。
钾参与植物细胞糖、脂肪和蛋白质的合成过程,
也调节细胞的分化和细胞内外的水分平衡。但是
过高的浓度会大大增加培养基的渗透压, 抑制细
胞的生长。本研究结果表明, 对长柄扁桃不定芽
诱导时, 在MS基本培养中再添加800~1 200 mg·L-1
的钾离子有利于长柄扁桃不定芽的形成和生长,
当太高的钾离子浓度(>1 600 mg·L-1)会引起不定芽
活力降低、组织褐化。
表1 钾离子浓度对长柄扁桃不定芽诱导的影响
Table 1 Effect of potassium ion on adventitious bud induction of A. pedunculata
K+浓度/mg·L-1 芽诱导率/% 平均芽数/个 芽平均高度/cm 细胞活力(OD485值) 褐化频率/%
0 72b 2.5c 1.4b 0.335c 13c
400 75ab 2.8c 1.6b 0.353c 12c
800 84a 3.6b 1.5b 0.466b 13c
1 200 83a 4.6a 2.3a 0.565a 15c
1 600 76ab 2.2c 1.6b 0.356c 27b
2 000 56c 1.3d 0.7c 0.224d 35a
　　同列数字旁不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。
郭斌等: 钾离子对长柄扁桃丛生芽诱导的影响 1357
2 钾离子浓度对长柄扁桃不定芽抗氧化酶活性和
MDA含量的影响
从表2可看出, 未添加钾离子的对照, 随着培
养时间的延长SOD和POD活性出现了规律性的变
化: 在培养的开始阶段酶活性逐渐增高, 直到培养
21 d达到最高, 以后逐渐降低。但是, CAT活性在
整个过程中变化不显著。在培养基中添加钾离子
可显著提高SOD和POD活性。当添加的钾离子的
剂量达到2 000 mg·L-1时, CAT活性也显著提高, 此
时也伴随着不定芽中MDA含量的增加(表3), 不定
芽褐化严重, 部分死亡(图1-D)。
SOD、POD和CAT是维持胞内氧化还原环境
稳定的重要生物酶。SOD是生物体内普遍存在的
一种酶, 处于保护酶系中的核心地位。近几年, 在
图1 钾离子对长柄扁桃不定芽诱导的影响
Fig.1 Effect of potassium ion on adventitious bud induction of A. pedunculata
A: MS培养基; B: MS培养基添加1 200 mg·L-1钾离子; C: MS培养基添加1 600 mg·L-1钾离子; D: MS培养基添加2 000 mg·L-1钾离子。
表2 钾离子浓度对长柄扁桃不定芽诱导过程中抗氧化酶活力的影响
Table 2 Effect of potassium ion on antioxidant enzymes activities during the adventitious bud induction of A. pedunculata
培养时间/d
SOD活性/U·g-1 POD活性/U·g-1 CAT活性/U·g-1
对照 K+ 1 200 K+ 2 000 对照 K+ 1 200 K+ 2 000 对照 K+ 1 200 K+ 2 000
0 57.4f 57.4f 57.4f 587.3g 587.3g 587.3g 212.4d 212.4d 212.4d
7 83.6f 135.8e 166.3e 925.9f 1 029.7f 1 534.8e 196.7d 214.2d 254.4cd
14 147.3e 262.9d 304.7bc 1 443.6e 1 632.4e 2 273.4d 205.3d 225.6d 283.2c
21 179.2e 302.4bc 325.2b 1 392.7e 1 616.5e 3 106.7c 210.6d 200.8d 342.5b
28 156.1e 292.2bc 353.6ab 1 305.2e 1 523.2e 4 005.2b 203.9d 221.5d 371.3ab
35 143.2e 286.3d 376.8a 1 216.3e 1 374.3e 4 791.7a 217.8d 218.6d 384.2a
　　同一测定项目数字旁不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。K+浓度单位为mg·L-1。
植物组织培养中研究表明较高的SOD活性有利于
组织的分化(Li等2009)。这一点在辣椒(黄丽华等
2009)、大蒜(马琳等2011)、喜树(陈博等2012)和
新疆雪莲(Guo等2013)等植物的离体分化中已有报
道。在我们的研究中也发现: 在培养基中添加适
量的钾离子(1 200 mg·L-1)时, 不定芽的诱导频率和
数量显著增加的同时, SOD和POD活性也在增高。
POD在活性氧的代谢中也起作用: 一方面它
植物生理学报1358
是H2O2的清除剂; 另一方面它还是细胞中O2¯·和
H2O2的重要来源, 生成的H2O2用于细胞壁的木质
化或蛋白质的交联。人们早已发现, POD对细胞
壁的形成是必不可少的, POD参与细胞壁中木质
素、木栓层的生物合成和富含羟脯氨酸的糖蛋白
中异二酪氨酸(isodityrosine)的产生。Cordewener
等(1991)和Jackson等(2001)的研究表明, 一些POD
在萝卜的培养细胞中能诱导体胚形成, 添加这些
POD能使被抑制的细胞恢复发育潜能。因此, 适
量添加的钾离子诱导SOD和POD活性的增加可能
是促进长柄扁桃不定芽形成的原因之一。但是,
当添加的钾离子浓度过高时, 则伴随着细胞活力
的下降(表1), MDA含量的升高(表3), 表明细胞受
到了氧化损伤(Hernandez等2001)。此时, 较高的
SOD、POD和CAT活性(表2)是为了消除高钾胁迫
下植物形成的过多的活性氧, 降低活性氧对细胞
造成的伤害。因此, 只有适量增加钾离子的剂量
(在MS培养机上再添加1 200 mg·L-1)才有利于长柄
扁桃芽的再生。
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表3 钾离子浓度对长柄扁桃不定芽诱导过程中
MDA含量的影响
Table 3 Effect of potassium ion on MDA content during the
adventitious bud induction of A. pedunculata
培养时间/d
MDA含量/mg·g-1
对照 K+ 1 200 mg·L-1 K+ 2 000 mg·L-1
0 1.23e 1.23e 1.23e
7 1.24e 1.21e 1.84d
14 1.15e 1.26e 2.47c
21 1.31e 1.38e 3.35bc
28 1.22e 1.34e 3.96b
35 1.35e 1.53de 5.28a
　　数字旁不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。