全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (12): 1433~1441 1433
收稿 2013-10-08　　修定 2013-11-21
资助 国家自然科学基金(31201273和31370331)和山东省博士基
金(BS2010SW004)。
* 通讯作者(E-mail: syzhao@sdu.edu.cn, yinghua.huang@ars.
usda.gov; Tel: 0531-88364525, 405-624-4142)。
高粱肉桂酸羟化酶基因SbC4H1降低拟南芥的木质素合成
闫丽1,2, 夏光敏1, 黄应华3,*, 赵双宜1,*
1山东大学生命科学学院, 植物细胞工程与种质创新教育部重点实验室, 济南250100; 2临沂大学生命科学学院, 山东临沂
276000; 3USDA-ARS Plant Science Research Laboratory, Stillwater, OK 74075, USA
摘要: 肉桂酸羟化酶(C4H)是苯丙烷代谢通路的关键酶, 其活性和含量直接影响木质素合成的效率。本文研究通过高粱bmr
突变体的抑制差减杂交筛选、克隆到了一个C4H基因SbC4H1。半定量RT-PCR发现, SbC4H1在多个bmr突变体中上调表
达。将SbC4H1-GFP融合基因转化拟南芥原生质体进行瞬时表达, 发现SbC4H1表达产物蛋白定位于细胞质。SbC4H1在拟
南芥中的异源表达明显降低其茎的木质素含量, 并且下调了拟南芥4CL1、F5H和HCT等木质素合成基因的表达。这些结
果表明, 高粱SbC4H1抑制了拟南芥木质素的合成。
关键词: 高粱; 肉桂酸4-羟化酶; 木质素合成; 生物能源
Cinnamic Acid 4-Hydroxylase of Sorghum [Sorghum bicolor (L.) Moench]
Gene SbC4H1 Restricts Lignin Synthesis in Arabidopsis
YAN Li1,2, XIA Guang-Min1, HUANG Ying-Hua3,*, ZHAO Shuang-Yi1,*
1The Key Laboratory of Plant Cell Engineering and Germplasm Innovation, Ministry of Education, Shandong University, Jinan
250100, China; 2College of Life Sciences, Linyi University, Linyi, Shandong 276000, China; 3USDA-ARS Plant Science Research
Laboratory, Stillwater, OK 74075, USA
Abstract: Cinnamic acid 4-hydroxylase (C4H) is the first hydroxylase enzyme of phenylpropanoid pathway,
and its content and activity affects the lignin synthesis. In this study, we isolated a C4H gene SbC4H1 from the
suppression subtractive hybridization library of brown midrib (bmr) mutants of Sorghum bicolor. Semi-
quantitative RT-PCR (sqRT-PCR) analysis showed that SbC4H1 was up-regulated in most of bmr mutants. The
transient expression assay in Arabidopsis protoplast indicated SbC4H1 was mainly located in the cytoplasm.
Ectopic overexpression of SbC4H1 significantly lowered the content of lignin in Arabidopsis. sqRT-PCR
indicated that several genes in phenylpropanoid pathway such as 4CL1, F5H1 and HCT were down-regulated in
Arabidopsis. These results showed that, SbC4H1 played an inhibitory effect on the synthesis of lignin.
Key words: sorghum (Sorghum bicolor); cinnamic acid 4-hydroxylase; lignin synthesis; bioenergy
随着世界能源危机的加重, 以生物能源为代
表的的新能源研究备受关注, 其中以纤维素为原
料的第二代酒精生产技术研究是其核心, 这不但
可以保证粮食、油料等食品生产的安全, 还可充
分利用盐碱、荒地及边际性土壤。生物质
(biomass)通过物理或化学方法预处理后, 其中的纤
维素可进一步被分解成葡萄糖, 再经过酒精酵母
发酵产生乙醇。但在天然状态下, 细胞壁中的纤
维素由于受到木质素的保护 , 其水解效率仅有
10%~20%左右(梁新红等2004)。木质素性质稳定,
又较耐酸碱, 因此木质素含量较高的生物质, 其预
处理强度也较高, 这不但增加了生产成本又造成
较大的污染。木质素水解产生的多种小分子酚类
物质可抑制其后纤维素酶解过程中的纤维素酶活
性, 因此低木质素含量的生物质就有更高的纤维
素-酒精转化率。最近报道利用转基因技术获得木
质素含量降低的柳枝稷, 在进行酒精发酵试验时
可节约30%左右的酶用量, 预处理强度也大为降
低, 而酒精产量却提高30%以上(Fu等2011)。因此
利用基因工程技术对能源作物进行改良, 有望降
低其木质素含量, 提高纤维素-乙醇转化率, 促进纤
维素乙醇产业真正走向实用化。
高粱是世界第五大粮食作物, 又是重要的饲
植物生理学报1434
料和酿酒原料之一。作为高效的能源作物, 其抗
逆性较强, 生物量大, 耐瘠薄, 尤其是种子中的淀
粉、甜高粱茎秆中的糖及秸秆中的纤维素均可通
过不同的方式用于乙醇生产, 其生物乙醇生产潜
力已经超过玉米、甘蔗等著名能源作物(Goff等
2010)。玉米、高粱的褐/黄中脉突变体(brown
midrib, bmr)是指植株生长到5个伸展叶后, 其叶片
中脉和茎髓部有褐色的色素沉着而命名, 与正常
表型的野生型高粱相比, bmr突变体茎及叶中的木
质素含量明显降低, 其纤维素可降解率大幅提高,
因此bmr突变体是研究木质素合成机理的重要材
料 , 也是优质的牛羊青饲料来源之一 ( Ya n等
2012)。
木质素是较为复杂的酚类聚合物, 在植物细
胞壁中的含量较高。木质素的合成是由苯丙氨酸/
酪氨酸(禾谷类等)裂解开始, 经肉桂酸、香豆酸、
咖啡酸、阿魏酸、芥子酸, 转变为香豆醛、松柏
醛、芥子醛, 进一步氧化为香豆醇、松柏醇、芥
子醇, 成为G、S、H型木质素单体, 这些不同单体
再经聚合就形成各种木质素(Whetten和Sederoff
1995; Boerjan等2003)。肉桂酸4-羟化酶(cinnamic
acid 4-hydroxylase, C4H)是苯丙烷代谢途径的第一
个羟基化酶, 可催化苯丙氨酸裂解得到的反式肉
桂酸, 后者再进一步氧化成对-香豆酸, 对-香豆酸
在不同酶的催化下进一步向木质素途径、花青素
途径及类黄酮途径等分支途径转化(Hahlbrock和
Grisebach 1979)。C4H是一种P450单氧化物酶, 属
于CYP73亚家族(Schomburg等2006)。第一个C4H
是从豌豆中分离的, 目前已从苜蓿、拟南芥等多
种不同植物中识别、分离出C4H (Chen等2007)。
植物系统发生分析结果表明, C4H是木质素合成途
径中最保守的基因家族, 在单子叶和双子叶植物
中没有明显的分化。C 4 H基因在转录水平上
mRNA的丰度和蛋白质水平上的酶活性能有效影
响植物中木质素的合成(Ryan等2002; Millar等
2007)。C4H的表达可被外界的化学物质、UV线、
真菌和伤害所诱导(Bell-Lelong等1997), 其mRNA
积累水平的变化趋势与PAL、4CL的mRNA趋于一
致(Whetten和Sederoff 1992; Osakabe等1996)。诱
导烟草C4H表达的实验中所测定到的C4H活性通
常比PAL的活性低得多, 这表明在植物丙烷代谢途
径中C 4 H可能是比PA L更为有效的限速步骤
(Sewalt等1997)。因为抑制PAL的表达, 只有达到
相当的程度, 才能表现出对木质素合成的抑制, 这
也许是植物有多个PAL所致, 因为它们的功能在相
当程度上可能是冗余的。而抑制C4H的表达则可
极显著地抑制木质素的合成(Sewalt等1997)。酵母
菌体内蛋白质互作实验表明, 苯丙烷代谢途径中
的C4H与PAL、4CL可以互作, 其酶活性可相互调
控(Koopmann等1999)。因此, C4H对木质素合成
代谢的调控和应用研究还需更深入的探索。
本研究从高粱中克隆了SbC4H1, 分析了该基
因在高粱bmr突变体中的表达, 确定了基因表达产
物的亚细胞分布, 分析了SbC4H1拟南芥过表达系
的木质素含量及分布, 检测了木质素合成途径主
要基因的转录活性, 为进一步研究SbC4H1 调控木
质素生物合成的机理及应用提供了依据。
材料与方法
1 植物材料
高粱[Sorghum bicolor (L.) Moench]选用已经完
成测序的高粱BTx623以及该基因型经EMS (ethyl
methane sulfonate)诱变得到的13个bmr突变体
(bmr、bmr6、bmr12、bmr29、bmr30、bmr31、
bmr32、bmr33、bmr34、bmr35、bmr36、bmr45和
bmr49)。高粱种植于山东大学生命科学学院温室
及试验田中, 自然光照, 常规管理。
拟南芥(Arabidopsis thaliana, Columbia)种植
于MS培养基或人工育苗基质中, 22~23 ℃, 每天光
照时间为16 h。
2 SbC4H1基因的克隆及过表达载体的构建
根据高粱BTx623和其13个bmr突变体叶片
mRNA混合池抑制性差减文库(SSH)的芯片分析结
果 (Yan等2012) , 本研究选择了其中一个C4H
(SbC4H1)片段, 通过搜索高粱基因组得到该基因
完整编码区核酸和蛋白质序列信息 , 对NCBI
(National Center for Biotechnology Information)、
PBD (RCSB Protein Data Bank)和Phytozome数据
库搜索获得同源基因序列, 利用MEGA v4.1进行进
化树分析。
根据SbC4H1序列设计正反义引物, 2个引物5
端都添加了XbaI酶切位点(下划线部分)和保护碱
闫丽等: 高粱肉桂酸羟化酶基因SbC4H1降低拟南芥的木质素合成 1435
基(SbC4H1-F, 5 ATCTAGACCTCCAGCATGGA-
CCTCGTG 3; SbC4H1-R, 5 ATCTAGAGCGTG-
CGCATTGATCTAGGC 3), 利用该引物进行RT-
PCR, 高保真扩增得到SbC4H1全长cDNA。具体
PCR条件如下: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s,
55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸2 min, 共35循环; 72 ℃终
延伸 10 min。PCR产物连接pMD18-T载体测序, 测
序正确后用XbaI酶切后回收片段连接入经同样酶
切的pSTART载体, 获得含目的基因的植物表达载
体pSTC4H1 (图1), 用BamHI酶切验证插入方向(该
基因5端及pSTART多克隆位点均有一BamHI位点,
正向插入片段为919 bp, 反向插入片段为607 bp)。
图1 植物表达载体pSTC4H1的构建
Fig.1 The construction of plant expression vector pSTC4H1
3 SbC4H1在高粱BTx623与bmr突变体中的表达
分析
高粱BTx623及13种bmr突变体温室生长至7
叶期后, 收集叶片经液氮速冻, 研磨后用TRIzol法
提取RNA, 以反转录的cDNA为模板, 高粱Actin基
因为对照, 半定量RT-PCR检测SbC4H1在bmr突变
体中的表达。SbC4H1及Actin引物序列分别为:
SbActin-qF, 5 AGATGGTGTCAGCCACACTG 3;
SbActin-qR, 5 CGAGCTTCTCCTTCATGTCC 3;
SbC4H1-qF, 5 GACTGTCGCAGAGCTTCGAG 3;
SbC4H1-qR, 5 ATCACCTTCTTGCGTTCCTG 3。
PCR条件如下: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s,
55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共30~35个循环; 72 ℃
终延伸10 min。
4 SbC4H1蛋白的亚细胞定位
以5端加XbaI酶切位点及保护碱基的引物
(C4H-XbaI-cF1, 5 GCTCTAGAATGGACCT-
CGTGCTC CTGGAG 3 ; C4H-XbaI-cR1, 5
GCTCTAGAGGCCTCGAGGGGCTTGCAGA 3)扩
增SbC4H1基因完整编码区(已去除终止密码), PCR
条件与上述SbC4H1的克隆相同。PCR产物经XbaI
酶切, 回收SbC4H1片段并连入到瞬时表达载体
p326GFP的XbaI位点, 经BamHI酶切验证插入方向
后, 获得35S启动的SbC4H1-GFP融合蛋白亚细胞
定位载体。在PEG介导下转化拟南芥原生质体, 短
暂培养后, 经共聚焦显微镜(LSM700, Carl Zeiss
AG, Oberkochen, Germany)检测(Sakamoto等2003),
绿色荧光信号即显示SbC4H1-GFP融合蛋白的亚
细胞定位即SbC4H1的亚细胞定位。
5 SbC4H1基因对拟南芥的遗传转化
所构建的SbC4H1双元表达载体用浸花法转
化拟南芥(Clough和Bent 1998), T1代转基因拟南芥
在50 mg·L-1卡那霉素的MS培养基平板上筛选阳
性植株, 进一步筛选转基因T2代的单拷贝插入株系
(分离比为3:1), T3代性状不分离的纯系用于功能
验证。
6 SbC4H1转基因拟南芥纯系木质素含量测定
选取生长6周的转基因拟南芥, 距基部莲座叶1
cm左右的茎段进行冷冻横切片, Wiesner法染色, 定
性观察木质素的含量及分布情况(Pomar等2002)。
溴乙酰法测定茎中木质素含量(Yan等2012),
具体方法为: 每10株生长6周的转基因拟南芥茎为
一组, 取距基部莲座叶3 cm长的茎, 液氮速冻后研
磨成极细的粉末, 40目过筛, 真空冻干。取10 mg
冻干粉, 分别用2 mL的无水乙醇、95%乙醇和纯净
水洗涤, 去除可溶性物质。风干后以1:3体积比加
入溴乙酰和醋酸(共2 mL), 70 ℃恒温水浴加塞保
温30 min, 随后依次加入0.9 mL 2 mol·L-1 NaOH、
3 mL 醋酸和0.1 mL 7.5 mol·L-1羟胺盐酸终止反
应。离心取上清液, 加水稀释25倍后测定280 nm
吸光度, 实验重复3次。
7 SbC4H1转基因拟南芥木质素合成相关基因的表
达分析
提取SbC4H1转基因拟南芥2个纯系及对照生
长6周茎叶总RNA, 经逆转录成cDNA后, 通过半定
量RT-PCR分析转基因拟南芥中与木质素合成相关
的苯丙烷途径基因的表达情况, 具体引物见表1,
PCR条件见上文第3节 。
植物生理学报1436
高粱C4H-Like1等的同源性次之, 与火炬松、杉
木、小立碗藓及江南卷柏C4H等的同源性较远; 与
蓖麻、菜豆、毛果杨及高粱C4H-Like2等同源性更
远(图3)。
2 SbC4H1基因产物的亚细胞定位
p326GFP-SbC4H1载体经PEG法转化拟南芥
原生质体, 瞬时表达结果如图4所示, 在35S启动子
的驱动下, SbC4H1-GFP产物的绿色荧光在拟南芥
原生质体中的细胞质和细胞核中均有分布, 与对
照35S::GFP中出现的荧光信号相似, 这些结果表
明SbC4H1的产物定位于细胞质和细胞核。
3 SbC4H1在转基因拟南芥中的过表达
用浸花法将SbC4H1基因转化野生型拟南芥
(Col-0), 经过卡那霉素筛选及PCR验证, 获得纯合的
转基因阳性T3代株系。RT-PCR检测表明, 已经整合
到拟南芥基因组的外源SbC4H1可以正常表达(图5),
且SbC4H1在SbC4H1-OE2中的表达水平略高于
SbC4H1-OE1; GUS由于插入的SbC4H1含有终止子
而不能表达, 无扩增产物; 不含目的基因的空载体
转基因后代则可以检测到GUS基因的表达。野生
型对照(WT)均不能检测到上述两个基因的表达。
4 SbC4H1过表达拟南芥茎中的木质素含量
6周龄转基因拟南芥的茎经Wiesner染色 ,
SbC4H1转基因纯系中维管束和束间纤维的染色明
显浅于野生型, 说明SbC4H1转基因纯系中的木质
素含量已经降低(图6)。
6周龄转基因拟南芥的茎木质素含量结果(图7)
显示, 2个拟南芥SbC4H1过表达株系的木质素含量
与野生型拟南芥相比明显降低, 经统计检验差异
达到显著水平, 更加证实茎切片木质素的染色结
果的真实性。
5 拟南芥转基因植株木质素合成Marker基因的表达
与木质素合成相关的苯基丙烷合成途径基因
表达结果(图8)显示, 4CL1、F5H1和HCT等基因的
表达在SbC4H1过表达拟南芥中受到不同程度的
抑制。
表1 木质素合成相关基因的所用引物序列
Table 1 Sequences of primers used for
lignin synthesis related genes
引物名 　　　　序列
AtPAL1-F 5 acagagcttttgaccggaga 3
AtPAL1-R 5 cacttcacagacaatcatttg 3
AtC4H-F 5 gcaagctgaattgtccacct 3
AtC4H-R 5 cacatccttgaagctgagca 3
At4CL1-F 5 ctccggtgtctggatcaact 3
At4CL1-R 5 gaaatctggtgctgctcctc 3
AtHCT-F 5 cattcactctttcccgcttc 3
AtHCT-R 5 gttcccatcctccttggatt 3
AtC3H1-F 5 cacgcttgagctcttcacac 3
AtC3H1-R 5 gttagcaacgcatcaacgaa 3
AtCCoAOMT1-F 5 catcatcgaccaatggagaa 3
AtCCoAOMT1-R 5 tcgatcaaacgcttgtggta 3
AtCCR1-F 5 tctttcacacggcttctcct 3
AtCCR1-R 5 aaagactggcgttgatcgtc 3
AtF5H1-F 5 ctttaggagccgtgagacca 3
AtF5H1-R 5 agagtgggccttaacggagt 3
AtCOMT-F 5 cgtcgcagacaactttgatg 3
AtCOMT-R 5 tgatctcccacatgtcatcg 3
AtCAD6-F 5 cgagtctctcaaacgcagtg 3
AtCAD6-R 5 gttaggtggagtcggtcaca 3
AtActin-F 5 actaccgcagaacgggaaat 3
AtActin-R 5 catctgttggaaggtgctga 3

图2 SbC4H1基因的结构
Fig.2 Structure analysis of SbC4H1
实验结果
1 SbC4H1基因的克隆及同源性分析
通过高粱BTx623和bmr突变体SSH和基因芯
片分析, 从差异表达基因中筛选出高粱的一个C4H
片段, 该基因编码一个细胞色素P450 CYP2亚家族
蛋白(PLNO2394), 对应高粱的Sb02g010910, 命名
为SbC4H1。SbC4H1基因组序列长4 374 bp, 有3个
外显子和2个内含子(图2)。cDNA序列2 094 bp,
ORF为1 506 bp, 编码一个502氨基酸残基蛋白质,
分子量57.1 kDa, 等电点8.85。其氨基酸序列的进
化树分析表明, SbC4H1与多个物种中的C4H具有
较高的相似性, 特别是与禾本科的柳枝稷、粳稻
等同源性最高, 与棉花、杨树、大白菜、苜蓿及
闫丽等: 高粱肉桂酸羟化酶基因SbC4H1降低拟南芥的木质素合成 1437
图3 SbC4H1基因进化分析
Fig.3 Phylogenetic analysis of SbC4H1
植物生理学报1438
图4 SbC4H1的亚细胞定位
Fig.4 Subcellular localization of the SbC4H1
A、B、C: SbC4H1-GFP融合蛋白表达, 荧光信号在细胞质和细胞核中; D、E、F: GFP对照载体的表达, 荧光信号在细胞质和核中均
有分布。A、D: 激发光下绿色荧光信号; B、E: 自然光下拟南芥原生质体; C、F: 荧光信号和自然光下信号组合; 标尺 10 μm。
图5 拟南芥SbC4H1转基因植株的RT-PCR分析
Fig.5 RT-PCR analysis of SbC4H1 in transgenic Arabidopsis
WT: 野生型拟南芥Col-0; VC: 转入空载体对照的拟南芥;
OE-1和OE-2: 拟南芥转基因过表达植株T3代株系。
图6 SbC4H1过表达拟南芥茎横切Wiesner染色
Fig.6 Lignin content as shown by Wiesner’s staining of a stem
section of transgenic Arabidopsis over-expression of SbC4H1
左: 野生型拟南芥; 右: SbC4H1过表达拟南芥; 标尺100 μm。
图8 SbC4H1拟南芥过表达植株中木质素
合成相关Marker基因的表达
Fig.8 RT-PCR analysis of lignin biosynthesis marker genes in
transgenic Arabidopsis over-expression of SbC4H1
图7 SbC4H1过表达拟南芥中木质素含量
Fig.7 Lignin contents of transgenic Arabidopsis
over-expression of SbC4H1
*表示差异达显著水平(P<0.05)。
闫丽等: 高粱肉桂酸羟化酶基因SbC4H1降低拟南芥的木质素合成 1439
讨　　论
与PAL不同, C4H的数量和酶活性均不及PAL,
虽然它们的产物均是苯基丙烷途径起始的关键
酶。很多植物的C4H由一个或两个, 少数由一个小
的基因家族(Anterola和Lewis 2002)构成, 大多数植
物的PAL是多拷贝且其产物活性较强。因为诱导
C4H表达的酶活性通常比PAL的酶活性低得多 ,
C4H可能是控制木质素等次生代谢合成的主要限
速酶之一(Sewalt等1997), 而抑制PAL的活性只有
达到一定程度, 才能降低木质素等次生代谢产物
的积累。Lauer等在2001年首次报道高粱C4H
(Sb02g010910) cDNA序列, Xu等提出高粱基因组
中共有3个C4H序列(Xu等2009), 但至今对这三个
基因的功能研究尚无报道, 对其注释也均为假想
蛋白, 因此研究高粱C4H的功能, 确证其在植物木
质素等次生代谢途径中的作用有重要的意义。
双子叶植物的C4H可分为两类(class I和class
II), 二者序列相似性约60%, 但功能可能不尽相
同。在多数物种中(例如拟南芥等) C4H仅有一类
(Costa等2003), 而在苜蓿、玉米、橙子、豌豆、长
春花、杂交杨等中为一个小的基因家族, 在美洲
山杨中有两类共4个C4H, 毛果杨中有3个。从多种
植物C4H的进化树可以看出, 拟南芥等所在的第一
类C4H可能比较古老, 因为在该类群中有原始的苔
藓类、裸子植物, 它们应是陆生被子植物的祖先,
值得重视的是禾本科植物的柳枝稷、粳稻和高粱
有2个C4H均属于第一类, 但结构均有一定的分化,
彼此属于不同的亚类, 高粱的第3个C4H则属于第
二类型。由此可见, 在进化过程中C4H在结构和功
能等方面已经开始有一定的分歧。拟南芥的C4H
定位在内质网(Ro等2001, 2002), 有些第二类C4H
因其N端含有一个非典型的丝氨酸/苏氨酸富集序
列, 而不能定位于内质网上(Ehlting等2006); 例如
在葡萄果肉中表达的C4H主要在质体和细胞核中
(Chen等2006)。高粱SbC4H1-GFP在拟南芥原生质
体中瞬时表达时, 其产物定位于细胞质和细胞核
中, 是否与细胞质中的内质网共定位还需进一步
精细的研究。这说明在不同物种及不同器官, C4H
在亚细胞中的定位不同, 其表现的功能也可能有
所分化。
在异源物种中表达C4H可产生不同的结果,
正义过表达C4H可能导致该酶活性的上调, 但并不
一定必然导致木质素合成的增加, 有时可能会导
致其它次生代谢产物的积累 , 例如在朝鲜当归
(Angelica gigas)中过表达C4H会导致其转基因毛
状根中积累过量的紫花前胡醇当归酯decursinol
angelate (Park等2012)。在番茄中正义表达C4H
(CYP73A24)时, 转基因番茄虽呈现出4种不同的表
型, 但其木质素含量全部降低, S/G的比值下降, 芦
丁和柚皮素含量有所上调(Millar等2007)。苜蓿的
C4H在烟草中正义和反义表达, 转基因植株中C4H
活性出现了上升和降低两种情况, 其中一株苜蓿
C4H正义过表达株, 其C4H酶活性可增加2倍, 但是
木质素的含量却没有发生变化, 另一株正义表达
植株的C4H酶活性虽有所下降, 但木质素含量却反
而增加; 其它2株正义和2株反义表达株均表现对
该酶活性的抑制, 木质素含量也普遍降低(Sewalt
等1997)。部分正义过表达菜豆C4H (CYP73A15)
及反义表达该基因的转基因烟草后代均表现对木
质素合成的抑制(Blee等2001)。这些结果也表明
过表达C4H并不一定能提高木质素的合成, 也可能
会提高花青素/类黄酮或者其它次生代谢产物的积
累, 控制各个次生代谢分支的关键步骤位于该基
因下游。与此相反, 抑制该基因的表达往往会产
生预期的结果, 即降低木质素的合成; C4H部分正
义序列的表达也可表现为对木质素合成的抑制,
这可能是该基因的部分正义抑制作用(partially
sense suppression)所致, 但详细机理并不明确。
在拟南芥过表达SbC4H1时, 转基因拟南芥6
周龄时茎的木质素含量也降低, 部分木质素合成
相关基因表达也受到一定的抑制。但高粱SbC4H1
的组成型表达并未影响拟南芥本身C4H的表达(图5
和图8), 因此这似乎并不是发生了正义抑制的结
果, 或者由转基因导致的RNAi结果。当过表达苯
丙烷途径中的某种酶, 使木质素含量降低的现象
也有报道, 当过表达苯丙烷途径有关的细胞色素
P450时, 可降低木质素的含量(Ehlting等2006);
C3H过表达的拟南芥中, 木质素含量仅有正常的
60% (Abdulrazzak等2006)。虽然在多个bmr突变体
中SbC4H1都呈现出上调表达的趋势, 但我们并不
认为这就是高粱bmr突变体木质素含量的下降的
直接结果, 因为其它基因表达的变化也同样影响
植物生理学报1440
这些突变体木质素的合成, 例如SbbHLH1 (Yan等
2012, 2013)、SbCYP及Sblim等(未发表资料)。因
此在转基因拟南芥中, 高粱SbC4H1的上调表达反
而抑制木质素合成可能通过其它机理实现, 例如
控制与苯丙烷代谢相关的不同分支代谢的分流及
抑制其下游基因的活性(例如4CL、CCR、F5H及
HCT等)。PAL和C4H可能对下游基因有不同的前
馈影响(feed-forward effect), 因为抑制C4H的表达,
可使S单体含量急剧下降, G单体轻微下降, 从而导
致S/G比值明显降低; 而抑制PAL的表达, 可使木质
素含量降低, 但S/G比值升高(Sewalt等1997)。
由于木质素合成途径的复杂性 , 高粱中的
C4H又有多个家族成员, 不同C4H在不同生长发育
阶段的表达可能存在差异, C4H 除了主要调控木
质素单体合成以外, 还参与了其它植物次生代谢
途径的中间环节。因此当其中一个C4H的表达发
生改变时, 也可能由于其产物与多个其它基因的
共同作用, 影响了木质素合成途径与其它密切相
关的次生代谢的分流和控制, 最终影响木质素合
成的速率, 对于具体调控机理还需进一步研究。
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