全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (12): 1339~1346 1339
收稿 2013-08-01　　修定 2013-09-06
资助 国家自然科学基金(31170281)、陕西省自然科学基金(2011K-16-02-01)、陕西省教育厅自然科学专项基金(11JK0610)和安康学院高层
次人才科研启动基金(AYQDZR200926)。
* 通讯作者(E-mail: zzwang@snnu.edu.cn)。
丹参转录因子基因SmMYC amiRNA表达载体的构建及其对丹参的转化
王浩如1, 王健1,2, 王仕英1, 王喆之1,*
1教育部药用植物资源与天然药物化学重点实验室, 西北濒危药材资源开发国家工程实验室, 陕西师范大学生命科学学院,
西安710119; 2安康学院农学与生命科学学院, 陕西安康, 725000
摘要: 丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)为我国传统中药, 其活性成分的药理作用广泛, 尤其在防治心血管病药物中具有重要
作用。丹参水溶性酚酸类物质合成途径由苯丙烷代谢和酪氨酸代谢共同参与而成。转录因子对植物次生代谢起着十分重
要的调节作用。我们前期测序结果显示, SmMYC是一个丹参bHLH类转录因子, 可能参与丹参酚酸类化合物生物合成的调
控。本研究利用拟南芥miRNA319前体为模板骨架, 通过over-lapping PCR技术构建旨在能对SmMYC进行特异性沉默的ar-
tifical miRNA (amiRNA)植物表达载体, 命名为pCambia1302-amiR-SmMYC, 并通过农杆菌介导的遗传转化方法将其导入丹
参。Real-time PCR结果显示, 所得转化阳性株系中SmMYC的mRNA水平均呈现不同程度的下降, 同时酚酸类代谢途径中相
关酶基因的表达也表现为相应程度的下调; 福林酚法检测结果显示, 转化株系中总酚酸含量均低于同期的野生型丹参。以
上实验结果初步显示丹参SmMYC可能作为一个重要的转录因子参与酚酸类活性物质的代谢调控, 同时为进一步研究
SmMYC在丹参酚酸类化合物生物合成中的调控功能奠定了基础。
关键词: 丹参; bHLH转录因子; amiRNA; 遗传转化
Construction of Artificial microRNA Expression Vector Directing Specific Si-
lencing of the Transcription Factor Gene SmMYC and Subsequent Transfor-
mation into Salvia miltiorrhiza
WANG Hao-Ru1, WANG Jian1,2, WANG Shi-Ying1, WANG Zhe-Zhi1,*
1Key Laboratory of Ministry of Education for Medicinal Resources and Natural Pharmaceutical Chemistry, National Engineering
Laboratory for Resource Developing of Endangered Chinese Crude Drugs in Northwest of China, College of Life Sciences, Shaanxi
Normal University, Xi’an 710119, China; 2College of Agriculture and Life Science, Ankang University, Ankang, Shaanxi 725000, China
Abstract: Salvia miltiorrhiza Bunge is the traditional Chinese medicine, whose active constituents have
extensive pharmacological activities in the clinical treatment, especially play an important role in heart vascular
disease drug. The biosynthesis pathway of phenolic acid, the category of water-soluble active components of
Salvia miltiorrhiza, is composed of both phenylpropanoid pathway and tyrosine metabolic one. Transcription
factors play a very important role in regulation of the plant secondary metabolism. We speculated that SmMYC,
a bHLH transcription factor of Salvia miltiorrhiza, was potentially involved in regulation of the phenolic acid
compounds biosynthesis of Salvia miltiorrhiza. In this study, based on the Arabidopsis thaliana miRNA319
precursor, we constructed an artificial miRNA (amiRNA) plant expression vector using the overlap PCR
technology, designated as pCambia1302-amiR-SmMYC, which was transformed into Salvia miltiorrhiza,
subsequently. Real-time PCR results showed that, in the positive transgenic plants, SmMYC mRNA abundance
presented the significantly lower compared with control. The expression level of the enzyme genes involved in
phenolic acid compounds biosynthesis pathways rendered lower to some different extents compared with
control. Furthermore, the Folin-Ciocalteu assay results showed that the total phenolic acid content in the
positive transgenics were much lower than that of wild type. The results above suggested that the SmMYC
might be an important transcription factor governing phenolic acids metabolism, and lay a firm foundation for
further exploration of SmMYC role in phenolic acid compounds biosynthesis in Salvia miltiorrhiza.
Key words: Salvia miltiorrhiza Bunge; bHLH transcription factor; amiRNA; transformation
植物生理学报1340
丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)为唇形科鼠尾
草属多年生草本植物, 其根中活性成分能活血调
经、祛瘀生新、清心除烦, 为重要常用中草药(国
家药典委员会2010)。丹参的主要活性成分分为两
类: 一类为水溶性的酚酸类物质, 另一类为脂溶性
的丹参酮类化合物(Li等2009)。水溶性酚酸类化合
物是丹参的主要药用成分之一, 主要包括迷迭香
酸、丹参素、咖啡酸、丹酚酸A、丹酚酸B、紫草
酸等(Liu等2007) 。丹参水溶性酚酸类成分药理意
义重大, 其中丹酚酸B是目前已知的抗氧化作用最
强的天然产物之一, 也是丹参中含量最高、抗氧化
活性最强的化合物, 能显著抑制动物的心、脑、
肝、肾、睾丸的脂质过氧化(李国樟等2010)。
丹参中水溶性成分如丹酚酸B、迷迭香酸等
的生物合成由苯丙烷代谢途径和酪氨酸代谢途径
共同参与而成(Li等2009) 。苯丙烷类代谢途径中
的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羟化酶(C4H)
和4-香豆素辅酶A连接酶(4CL), 酪氨酸代谢途径
中的酪氨酸氨基转移酶(TAT)和羟苯基丙酮酸还
原酶(HPPR)以及迷迭香酸合酶(RAS)共同参与了
迷迭香酸及其衍生酚酸类物质的生物合成过程
(图1)。目前发现, 转录因子可以通过调控植物次
生代谢物合成途径中多个关键酶基因的表达, 从
而有效地激活或抑制整条代谢途径, 影响次生代
谢产物的合成和积累。
迄今为止, 已从众多植物中分离鉴定出能调
控苯丙烷类代谢途径的转录因子。其中bHLH类
转录因子广泛参与植物的生长发育和胁迫应答,
尤其在植物次生代谢方面起着十分重要的调控作
用。在水稻中发现含有173个bHLH转录因子, 拟
南芥含有158个, 使它成为被子植物第二大转录因
子(Xiong等2005)。本实验室在前期丹参转录组测
序中得到1个bHLH基因序列, 我们命名为SmMYC
(EST序列号为Unigene15990_danshen)。氨基酸序
列比对结果显示, SmMYC与其他植物参与苯丙烷
类代谢调控的bHLH类转录因子具有较高的同源
性。因此我们推测SmMYC在丹参苯丙烷类代谢途
径也可能具有重要的调控作用。
随着分子生物学技术的快速发展, RNA干扰
技术(RNA interference, RNAi)已经成为对基因进行
沉默的有效工具。但该技术的缺陷在于同时存在
对其他基因也进行潜在沉默的可能, 即脱靶效应
(off-target effect)。鉴于此, 一种高效、特异的基因
沉默技术应运而生, 即artifical microRNA (amiRNA)
介导的基因沉默。该方法是将针对靶基因设计出
的相应amiRNA及其互补链amiRNA*替换植物中保
守miRNA前体的miRNA-miRNA*结构, 进而在植
物细胞内被加工成能对靶基因进行特异沉默的
amiRNA。amiRNA已经成功地在拟南芥、番茄、水
稻和烟草等多种植物中甚至在单细胞藻类中得到
应用(Molnar等2009), 并被证实不论是通过组成型
启动子还是组织特异性启动子表达, 均能很好地实
现目的基因的沉默(Shi等2010), 具有高效性、高特
异性以及无脱靶效应等优点。本实验利用拟南芥
内源miR319a前体为骨架, 构建了以沉默丹参SmMYC
的amiRNA植物表达载体并对丹参进行了转化, 旨
在得到对该基因进行特异性沉默的转基因株系, 为
进一步探究丹参SmMYC的功能奠定基础。
材料与方法
1 材料
1.1 菌株和质粒
大肠杆菌DH5α和根癌农杆菌EHA105由本实
验室保存。质粒pRS300由中科院遗传所提供。植
物表达载体pCambia1302由本实验室保存。
1.2 植物材料与生长条件
本研究所用丹参种子购自陕西天士力植物药
图1 丹参酚酸类化合物的生物合成途径(摘自Yan等2006)
Fig.1 Proposed phenolic acids biosynthetic pathway of S.
Miltiorrhiza (cited from Yan et al 2006)
王浩如等: 丹参转录因子基因SmMYC amiRNA表达载体的构建及其对丹参的转化 1341
业商洛有限责任公司商州丹参药源基地。
丹参种子用流水冲洗后用75%乙醇表面灭菌
20 s, 用0.1%升汞溶液表面灭菌10 min, 无菌水冲
洗7~8次, 种子置于MS基本培养基上萌发。无菌
苗的培养条件: 温度(25±2) ℃; 光周期16 h/ 8 h
(昼 /夜 ) , 光照强度15~20 μmol ·m -2· s -1, 湿度
60%~80%。
2 方法
2.1 人工microRNA的分子设计及克隆
利用在线软件WMD (http://wmd2.weigel-
world.org)设计靶向丹参SmMYC基因的amiRNA、
amiRNA*以及用于over-lapping PCR的引物I、II、
III、IV (表1)。通用引物A (5′-CTGCAAGGCGAT-
TAAGTTGGGTAAC-3′)和B (5′-GCGGATAA-
CAATTTCACACAGGAAACAG-3′)分别与pRS300
质粒中MIR319a外围序列配对。
以质粒pRS300为模板, 在第一轮的PCR中首
先扩增出amiRNAs前体的5′臂(片段a)、中心环(片
段b)和3′臂(片段c), 然后以这3个片段的DNA 混合
物为模板 , 以A和B为引物扩增覆盖整个前体d
(Schwab等2006)。利用2%琼脂糖凝胶电泳回收纯
化片段d, 连接至克隆载体PMD-18T中, 转化感受
态DH5α, 挑取阳性克隆, 菌落PCR和酶切验证鉴
定, 并测序确定。
表1 重叠PCR引物
Table 1 List of over-lapping PCR primers
amiRNA /amiRNA* 引物序列(5′→3′)
I GATTATGCTCAATCAGACTGCGATCTCTCTTTTGTATTCC
II TCATTGATTCTCTTTGATTATGCTCAATCAGACTGCGATC
III GATCACAGTCTGATTCAGCATATTCACAGGTCGTGATATG
IV AGGAATATATATGTAGATCACAGTCTGATTCAGCATATTC
图2 amiRNA植物表达载体构建示意图
Fig.2 Construction scheme of amiRNA plant expression vector
2.2 引入酶切位点
设计两端分别带有BglII和BstEII酶切位点的
上、下游引物(5′-CATGGTNACCGATCGCAGTC-
TGATTGAGCATAA-3′和5′-CATAGATCTGATCA-
CAGTCTGATTCAGCATAT-3′), 以2.1得到的测序
正确的质粒为模板扩增amiRNA/amiRNA*茎环
结构。
2.3 植物表达载体构建
对测序验证正确的包含amiRNA的质粒和
pCambia1302载体分别进行BglII和BstEII双酶切。
回收相应大小目的片段, 用T4 DNA连接酶4 ℃连
接过夜。转化感受态DH5α, 挑选阳性克隆, 提取
质粒DNA经菌落PCR和酶切验证鉴定后测序验
证。构建示意图见图2所示。
2.4 丹参转基因植株的获得
利用液氮冻融法(Höfgen和Willmitzer 1988)将
植物表达载体pCambia1302-amiR-SmMYC转入根
癌农杆菌EHA105感受态细胞中, 按照Yan和Wang
(2007)建立的农杆菌介导的丹参外源基因转化方
法浸染丹参叶片。经过200 mg·L-1头孢霉素和4
mg·L-1潮霉素B筛选后得到转化株系。
2.5 转基因丹参株系DNA水平的检测
转化丹参植株DNA的提取采用杭州博日植物
DNA提取试剂盒进行。根据表达载体上的CaM-
V35S启动子序列和amiRNA序列设计PCR检测引
物, 对抗性苗进行PCR检测, PCR上、下游引物分
别为5′-CATAGATCTGATCACAGTCTGATTCAG-
CATAT-3′、5′-ACCTAACAGAACTCGCCG-
TAAAG-3′。
2.6 转基因株系中amiRNA、SmMYC以及酚酸合
成途径中酶基因表达水平的Real-time PCR检测
Trizol法提取丹参阳性转化株系叶片总RNA。
植物生理学报1342
首先用DNase去除总RNA中基因组DNA, 然后采
用PrimeScriptTM RT reagent Kit (TaKaRa)进行
cDNA反转录以及One Step PrimeScript miRNA
cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)进行amiRNA的polyA
加尾及其反转录反应。amiRNA实时荧光定量
PCR所用的下游引物为试剂盒通用引物Uni-miR
qPCR Prime, 其他所用引物见表2。PCR 的反应
程序为: 94 ℃, 1 min; 94 ℃, 10 s; 60 ℃, 25 s (40
cycles)。反应结束后, 以丹参ubiquitin作为内参基
因, 荧光信号值采用“比较Ct值的相对定量法”进行
基因表达定量分析。每个样品反应进行3个重复。
表2 实时荧光定量PCR分析所用引物序列
Table 2 List of primers used for real-time PCR analysis
引物 序列(5′→3′)
SmUbi-F ACCCTCACGGGGAAGACCATC
SmUbi-R ACCACGGAGACGGAGGACAAG
MiRNA Forward Primer GACTGCGATCTCTCTTTTGTATTCC
SmMYC-F GATGGCTACTGCAAATCAAAAGG
SmMYC-R AATCTTTTTGATAATTCTCTGAAG
SmPAL1-F GATAGCGGAGTGCAGGTCGTAC
SmPAL1-R CGAACTAGCAGATTGGCAGAGG
Sm4CL-F TCGCCAAATACGACCTTTCC
Sm4CL-R TGCTTCAGTCATCCCATACCC
SmTAT-F CAACTGCTGGTCTTCCACAAAC
SmTAT-R GCGAGCCAAAACGGACA
SmHPPR-F TGACTCCAGAAACAACCCACATT
SmHPPR-R CCCAGACGACCCTCCACAAG
SmRAS-F GCAAACGAGCACCACCTATCC
SmRAS-R GTCTTGGAGCGGGGTTTCG
2.7 总酚酸含量测定
每个待测株系选取3株40 d左右长势较一致的
植株, 分别取根于30 ℃烘干直至恒重, 研磨粉末过
40目筛, 称取20.0 mg待测样品, 加入1 mL提取液
(甲醇:丙酮=7:3, V/V), 30 ℃超声萃取20 min,
3 824×g离心上清液用于水溶性酚酸的提取。本实
验总酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu法(Zhang等
2010)。每个样品反应进行3个重复。
实验结果
1 amiRNA/amiRNA*茎环结构序列的获得及鉴定
以质粒pRS300为模板, over-lapping PCR结果
如图3-A, 片段大分别为256 bp、176 bp及298 bp。
以这3个片段的DNA混合物为模板扩增整个前体
的片段 , 大小为680 bp, 与预期结果相一致(图
3-B)。测序结果表明, 拟南芥内源miR319a前体序
列中除了miRNA-miRNA*结构被amiRNA-amiRNA*
替换外,其他碱基构成没有发生任何变化, 从而保
证了所构建的人工amiRNA序列能够形成与拟南
芥内源miR319a前体一样的茎环结构(图4)。
2 SmMYC amiRNA植物表达载体的构建
以上面得到的质粒为模板, 用两端加入了酶
切位点的上下游引物扩增amiRNA/amiRNA*序列;
经纯化后用BstEII和BglII进行双酶切, 植物表达载
体pCambia1302也用BstEII和BglII进行双酶切(图
5-A)。片段经回收、连接、转化后挑取阳性克隆,
进行PCR鉴定(图5-B)。测序结果显示, 重组植物
表达载体上不仅含有amiRNA/amiRNA*茎环结构
序列, 而且插入位点准确的位于CaMV35S启动子
后, 命名为pCambia1302-amiRNA-SmMYC。
3 转基因丹参株系DNA水平的PCR检测
将筛选所得到的20个独立转化株系分别提取
基因组DNA进行PCR检测。检测结果显示, 再生
得到的20个独立转化株系中均扩增得到了750 bp
的目的条带(图6), 与预期大小一致, 说明这些转化
株系中amiRNAs前体已经成功整合到丹参基因组
中。从图中可以看出, 不同泳道的扩增条带亮度
并不一致。导致这种结果的原因, 一方面可能与
每一个株系所提的DNA纯度不一所导致PCR扩增
图3 SmMYC amiRNA-amiRNA*茎环结构的PCR扩增
Fig.3 PCR amplification of SmMYC-amiRNA stem-loop
structure
A: PCR扩增amiRNAs前体的a、b、c片段, 1、2、3泳道分别
为a、b、c片段的PCR产物; B: amiRNA-amiRNA*茎环结构的PCR
扩增1泳道为amiRNA-amiRNA*茎环结构的PCR产物。图中M为
DL2000分子量标准, 条带由上到下分别表示2 000、1 000、750、
500、250和100 bp, 图5和图6同此。
王浩如等: 丹参转录因子基因SmMYC amiRNA表达载体的构建及其对丹参的转化 1343
效率的差异, 另一方面可能是amiRNAs前体的插
入位点的拷贝数不一样。
4 转基因株系amiRNA及靶基因SmMYC的表达
分析
我们随机选取上述PCR检测结果显示为阳性
的6个独立转化株系进行Real-time PCR (依次标记
为1#~6#)。结果显示, 与对照(未转化野生丹参)相
比, 转化株系中amiRNA都呈现不同程度的过表达
(图7-A), 其中, 除5#转化株外(可能与cDNA质量不
好有关), 其他转化株均能较好的说明amiRNA对靶
基因的切割效果: 1#株系中amiRNA的表达水平最
高, 其次是4#、2#、3# , 而6#中amiRNA基本无表
达。靶基因SmMYC的结果显示, 1#表达量最低, 其
次是4#、2#、3#, 而6#中smMYC表达水平基本与
野生丹参一致(图7-B)。以上结果说明, 本实验构
建的amiRNA前体序列能够在丹参细胞内能被正
确地加工成成熟的amiRNA, 进而介导对SmMYC
mRNA的剪切, 从而对SmMYC进行基因沉默。
5 酚酸代谢途径中酶基因的表达变化
为了进一步探究SmMYC对丹参体内水溶性酚
酸代谢途径的调控作用, 我们选取SmMYC沉默效
果较好的的1#和4#株系 , 分别对PAL1、4CL、
TAT、HPPR以及RAS酶基因的表达水平进行Real-
time PCR检测。结果如图8所示, 与对照株系相比,
转化株系中上述酶基因的表达均表现为不同程度
图6 转化株的PCR验证
Fig.6 PCR identification of the transgenic plantlets
1~20泳道: 各独立转化株系; 21泳道: 野生型植株(阴性对照); 22泳道: pCambia1302-amiRNA-SmMYC质粒(阳性对照)。
图5 amiRNA植物表达载体的构建
Fig.5 construction of amiRNA plant expression vector
A: BstEII和BglII进行双酶切, 1: amiRNA/amiRNA* PCR扩增
产物双酶切, 2: pCAMBIA1302双酶切; B: pCAMBIA1302-amiR-
NA-SmMYC菌落PCR验证, 泳道1~5: 随机挑选的菌落PCR扩增。
图4 SmMYC-amiRNA前体序列折叠后的茎环结构
Fig.4 The representative fold-back structure of SmMYC-amiRNA stem-loop
方框内为amiRNA-amiRNA*。
植物生理学报1344
图7 amiRNA及SmMYC的Real-time PCR检测
Fig.7 The Real-time PCR assay for expression level of the both amiRNA and SmMYC
A: amiRNA在不同转化株系中的表达水平; B: SmMYC在不同转化株系中的表达水平; c.k: 野生型丹参。
图8 丹参酚酸合成途径相关酶基因的表达水平
Fig.8 The relative expression level of the enzyme genes involved in the phenolic acid biosynthesis of Salvia miltiorrhiza
PAL1: 苯丙氨酸解氨酶基因1; 4CL: 4-香豆酰CoA连接酶基因; TAT: 酪氨酸氨基转移酶基因; HPPR: 羟苯基丙酮酸还原酶基因; RAS: 迷
迭香酸合酶基因; c.k: 野生型丹参。
王浩如等: 丹参转录因子基因SmMYC amiRNA表达载体的构建及其对丹参的转化 1345
地降低, 其中, RAS的下调效果最为显著。同时, 除
4CL基因外(可能由于加样误差导致), 1#中相应的
酶基因的表达均低于4#, 与SmMYC的表达丰度呈
现出一定的正相关性。上述结果初步显示, SmMYC
可能作为丹参酚酸代谢途径中的一个重要转录因
子参与对相关酶基因的表达调控。
6 总酚含量分析
以没食子酸为标准品, 采用Folin-Ciocalteu法,
在5~100 µg·mL-1浓度范围内, 以平均吸光度值为横
坐标, 以没食子酸浓度为纵坐标制作标准曲线, 进
行线性回归并考察线性关系, 得到标准品的回归
方程为y=0.1415x–0.0171 (R²=0.9998)。检测结果
如图9所示, 阳性转化株系1#和4#中总酚酸含量分
别只有对照株系的17.24%和18.79%, 显著低于对
照野生型丹参, 而且1#和4#总酚酸含量减少值与
SmMYC的下调幅度也呈现正相关性, 进一步显示
SmMYC可能在丹参酚酸类成分合成中具有重要的
作用。
图9 阳性转化株系和野生型对照的总酚酸含量比较
Fig.9 Total phenolic content comparison between positive
transgenic lines and control
基因家族, 所以我们在对SmMYC设计amiRNA时,
尽量选择SmMYC的基因非保守区域来进行。同时
考虑到设计出的amiRNA前体序列能够在丹参
体内被正确的识别和切割, 因此amiRNA和amiRNA
序列之间的碱基配对模式也完全模仿拟南芥
miR319a前体序列中miRNA和miRNA*的序列结
构特征。另外Park等(2009)发现, amiRNA与靶标
基因完全配对反而能增强基因沉默的效果, 而且
并未造成明显的脱靶现象。因此 , 我们在成熟
amiRNA和目标基因SmMYC间引入1~2个不配对的
碱基。鉴于丹参中bHLH基因家族序列信息的限
制, 本实验中amiRNA是否具有脱靶问题, 我们无
法检测, 下一步将用modified 5′RACE进一步来鉴
定amiRNA对SmMYC的确切切割位点。
大量研究表明, amiRNA过表达能介导大多数
靶基因转录后水平的大幅下调, 同时在表达水平
上amiRNA与其靶基因呈现明显的负相关性。然
而amiRNA所靶定的基因在mRNA水平虽然都可
被下调, 但下调程度却不尽相同。在本实验中, 我
们发现虽然大部分转化株系中SmMYC表达水平与
amiRNA的表达量呈现明显的负相关, 但是2#与5#
相比, 虽然这两个株系中SmMYC都表现为下调的
趋势, 2# amiRNA水平明显高于5#, SmMYC的下调
幅度却不及5#。造成这种现象的原因可能与2#株
系中T-DNA的插入位点有关,由于影响SmMYC表
达水平的并非只有miRNA一个,可能T-DNA的插入
影响了调控SmMYC的其他蛋白因子的表达;另外
一种情况可能是丹参体内内源miRNA与amiRNA
两者在与RISC复合体结合时存在竞争, 因而导致
不同株系中amiRNA对其靶基因的调控程度不一。
本研究通过构建人工microRNA植物表达载
体对丹参SmMYC基因进行特异性沉默, 获得了
SmMYC表达量不同程度下调的阳性转化株系, 分
析发现SmMYC的下调不仅导致酚酸合成途径中相
关酶基因表达量的降低, 而且进而影响了酚酸类
成分的积累。初步推断SmMYC可能作为一个重要
的转录因子参与了丹参酚酸类次生代谢产物的调
控, 为进一步深入进行SmMYC转录因子的功能研
究奠定了基础。
参考文献
国家药典委员会(2010). 中华人民共和国药典. 北京: 中国医药科
讨　　论
与常规的RNAi相比, amiRNA策略具有多个
优势, RNAi 策略中的茎环结构会产生多种不同
siRNA, 而miRNA的前体一般只产生一种有效的
miRNA, 这就使得 amiRNA能够较为精确的实现
靶基因的切割; 在本实验中, 为了提高靶标基因
沉默的特异性, 我们设计 amiRNA时严格遵循其设
计原则(Schwab等2006)。但鉴于丹参的基因组序
列还未知, 加之SmMYC所属的bHLH是一个较大的
植物生理学报1346
技出版社, 70~71
李国樟, 曹庸, 卜晓英(2010). 丹参活性成分的药效药理作用. 农技
服务, 27 (7): 889~890
Höfgen R, Willmitzer L (1988). Storage of competent cells for
Agrobacterium transformation. Nucl Acids Res, 16 (20): 9877
Li YG, Song L, Liu M, Hu ZB, Wang ZT (2009). Advancement in
analysis of Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma (Danshen).
Chromatogr A, 1216: 1941~1953
Liu AH, Guo H, Ye M, Lin YH, Sun JH, Xu M, Guo DA (2007).
Detection, characterization and identification of phenolic acids
in Danshen using high-performance liquid chromatography
with diode array detection and electrospray ionization mass
spectrometry. Chromatogr A, 1161: 170~182
Molnar A, Bassett A, Thuenemann E, Schwach F, Karkare S,
Ossowski S, Weigel D, Baulcombe D (2009). Highly specific
gene silencing by artificial microRNAs in the unicellular alga
Chlamydomonas reinhardtii. Plant J, 58 (1): 165~174
Park W, Zhai J, Lee JY (2009). Highly efficient gene silencing using
perfect complementary artificial miRNA targeting AP1 or
heteromeric artificial miRNA targeting AP1 and CAL genes.
Plant Cell Rep, 28: 469~480
Schwab R, Ossowski S, Riester M, Warthmann N, Weigel D (2006).
Highly specific gene silencing by artificial microRNAs in
Arabidopsis. Plant Cell, 18 (5): 1121~1133
Shi R, Yang C, Lu S, Sederoff R, Chiang VL (2010).Specific down-
regulation of PAL genes by artificial microRNAs in Populus
trichocarpa. Planta, 232 (6): 1281~1288
Xiong Y, Liu T, Tian C, Sun S, Li J, Chen M (2005). Transcription
factors in rice:a genome-wide comparative analysis between
monocots and eudicots. Plant Mol Biol, 59: 191~203
Yan Q, Shi M, Ng J, Wu HY (2006). Elicitor-induced rosmarinic acid
accumulation and sceondary metabolism enzyme activities in
Salvia miltiorrhiza hairy roots. Plant Sci, 170: 853~858
Yan YP, Wang ZZ (2007). Genetic transformation of the medicinal
plant Salvia miltiorrhiza by Agrobacterium tumefaciens-
mediated method . Plant Cell Tissue Organ Cult, 88: 175~184
Zhang Y, Yan YP, Wang ZZ (2010). The Arabidopsis PAP1
transcription factor plays an important role in the enrichment of
phenolic acids in Salvia miltiorrhiza. J Agric Food Chem, 581:
12168~12175