全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (3): 302~306　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0493302
收稿 2014-11-06　　修定 2015-02-19
资助 国家自然科学基金(31460064)、内蒙古自治区高等学校
“青年科技英才计划” (NJYT-15-A08)、内蒙古自然科学基
金(2013MS0512)和内蒙古自治区高等学校科学研究项目
(NJZY13152)。
* 通讯作者(E-mail: btliyali@126.com; Tel: 0472-5954358)。
甘草细胞在搅拌式生物反应器中的放大培养
李雅丽*, 孟婷婷, 王毛毛, 李晓雪, 李蓉蓉, 郭晓强
内蒙古科技大学数理与生物工程学院, 内蒙古包头014010
摘要: 在建立了稳定的甘草细胞搅拌式生物反应器放大培养体系的基础上, 本文研究了甘草细胞在搅拌式反应器中悬浮培
养的生长特性, 包括细胞生长、细胞膜的透性、培养体系的pH变化及甘草黄酮合成情况等, 并与摇瓶培养作比较。结果发
现, 同等条件下, 反应器中培养细胞生物量的积累低于摇瓶培养, 整个培养周期较摇瓶培养缩短。培养过程中同一时间段
反应器中的pH值略低于摇瓶中的pH, 细胞中H2O2的浓度是摇瓶中的1.8倍, 甘草黄酮的产量是摇瓶培养的1.5倍, 表明反应
器中机械搅拌与流体剪切的培养环境对细胞生长起到一定程度的抑制作用, 但刺激了细胞次生代谢产物甘草黄酮较高水
平的合成。
关键词: 甘草细胞; 生物反应器; 摇瓶培养; 生长特性
Amplification Culture of Glycyrrhiza uralensis Cell in Stirring Bioreactor
LI Ya-Li*, MENG Ting-Ting, WANG Mao-Mao, LI Xiao-Xue, LI Rong-Rong, GUO Xiao-Qiang
School of Mathematics, Physics and Biology Engineering, Inner Mongolia University of Science and Technology, Baotou, Inner
Mongolia 014010, China
Abstract: Based on the establishment of a stable Glycyrrhiza uralensis (licorice) cells amplification culture
system in stirring bioreactor, the growth characteristics of cell suspension culture in stirring bioreactor were
studied, including the cell growth, cell membrane permeability, the pH change of the culture system and licorice
flavonoids synthesis, and compared with the shake flask culture. The results showed that cell biomass accumu-
lation in the bioreactor was less than that in shake flask under the same conditions, and the whole cultivation
period was shortened. At the same time in the culture period, pH was slightly lower than that in the shake flask,
the H2O2 concentration in cells was 1.8 times of that in shake flask, and the production of licorice flavonoids
was 1.5 times of that in the shake flask. These indicated that the cultivation environment with mechanical agita-
tion and fluid shear in the bioreactor inhibited the cells growth at a certain level, but stimulated secondary me-
tabolites licorice flavonoids synthesis cell in higher levels.
Key words: Glycyrrhiza uralensis (licorice) cell; bioreactor; shake flask culture; growth characteristic
利用植物细胞大规模培养生产有用的次生代
谢产物是解决目前部分天然产物资源短缺的有效
途径之一, 在实现这项技术由实验室规模向生产
规模的过渡过程中, 进行生物反应器培养并逐级
放大是必不可少的关键环节。实际上目前很少有
植物细胞培养能够实现工业化生产, 主要原因一
是悬浮细胞中次生代谢产物的含量低, 二是在大
规模培养的过程中还有很多困难(Pan等2000)。植
物细胞由摇瓶培养进入反应器中放大培养, 要承
受由机械搅拌引起的高剪切力和搅拌与通气引起
的流体胁迫带来的伤害(Gong等2006), 这种伤害会
影响到植物细胞的生长和分裂, 严重的会对植物
细胞产生致命的损伤。
甘草, 豆科多年生草本或半灌木植物, 是世界
上最古老也是应用最广泛的中草药之一, 也是多
种中成药与配方制剂的主要成分, 同时也因为其
特有的甜味作为食品添加剂广泛应用在食品行业,
国内外市场需求量很大(Zhang和Ye 2009)。近些
年来, 由于无序采挖、生态环境恶化造成甘草主
产区野生资源濒临枯竭(董静洲等2006)。栽培品
种收获期过长, 病虫害严重, 质量低下, 导致甘草
资源面临危机。本文在7.5 L搅拌式反应器中建立
甘草细胞悬浮培养体系的基础上, 探讨甘草悬浮
细胞的各种生理特性, 包括评价细胞生长、细胞
李雅丽等: 甘草细胞在搅拌式生物反应器中的放大培养 303
活力、细胞膜的通透性、培养体系的pH变化及产
物合成的情况等, 并与摇瓶培养相对比, 为甘草细
胞反应器大规模培养生产天然活性成分的工业化
进程提供理论指导与实验依据。
材料与方法
1 实验材料
供试的甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)品种
为‘乌拉尔甘草’, 种子购自内蒙古自治区鄂尔多斯
市达拉特旗。愈伤组织由幼嫩的甘草无菌苗下胚
轴和子叶诱导而来 , 在固体MS培养基附加0.5
mg·L-1 2,4-D、0.5 mg·L-1 NAA与0.5 mg·L-1 6-BA上
培养和继代。悬浮培养系统的建立: 取6 g分散性
强、生长状态良好的固体细胞置于250 mL三角瓶
中, 120 r·min-1震荡培养, 悬浮培养基为100 mL液
体MS培养基+30 g·L-1 蔗糖+0.5 mg·L-1 NAA+0.5
mg·L-1 6-BA, 光照强度36 μmol·m-2·s-1, 光照时间16
h·d-1, 培养温度25 ℃。
2 反应器细胞种子液的制备
从已建立的稳定生长的甘草细胞摇瓶悬浮系
中挑选生长状态良好、分散均匀、悬浮细胞聚集
体的平均直径在1 mm左右的甘草悬浮细胞作为种
子细胞, 继代培养5~6 d, 准备接入反应器。
3 搅拌式反应器中甘草细胞放大培养
反应器培养在一个7.5 L的搅拌式反应器中进
行, 包括一个7.5 L的玻璃罐体、四个不锈钢挡板、
一个不锈钢加热底盘和六叶低剪切力平滑搅拌桨
(图1)。内有温度探测计和灵敏度较高的pH电极与
溶氧电极, 可实时输出反应器系统的温度、pH和
溶氧。反应器设置配套的在线控制系统, 可实现反
应体系的温度、搅拌速度和通气量等参数的在线
控制。设置搅拌速度80 rpm。对培养体系的通气
通过底部一个不锈钢六孔气体分布器实现, 气体流
速被控制在0.1 m3·m-3·min-1。反应器装液量为5 L,
初始接种浓度为50 g (FW)·L-1, 光照时间为16 h·d-1,
培养温度25 ℃, 每3 d取样1次, 每次取100 mL, 检测
样品的细胞生物量积累、甘草黄酮的合成、细胞中
和培养基中H2O2浓度、培养液的pH和细胞活力。
4 测定方法
细胞生物量的检测、次级代谢产物总黄酮的
提取与含量分析参考杨英(2007)的方法, 细胞活力
测定采用Evans Blue染色(Xu等2004)。细胞与培养
基中H2O2的测定分别参照Chong等(2005)方法。
5 数据分析
结果中的每个数据都是3次独立实验的平均
值, 平均标准偏差表示了样品的变异。在反应器
培养过程中, 每次取3个平行样, 误差线表示平均
标准偏差。
实验结果
1 反应器中甘草细胞的生长与体系pH变化
经过筛选的生长状态良好、分散性强的甘草
种子细胞被接入反应器后, 一个周期生长基本稳
定。结果(图2)表明, 在摇瓶和反应器中, 甘草细胞
都易于成聚集体或者小细胞团, 摇瓶中的细胞生
物量积累最大值比反应器中的高33%。反应器中
细胞生长周期明显比摇瓶培养的短。
由图3可以看出, 培养过程中pH的变化在摇瓶
中与在反应器中的差别不大, 在培养初期(0~3 d)均
表现为一个缓慢的下降, 中期(4~9 d)基本稳定, 培
养后期(9~24 d)的pH先上升后下降, 同一时间段内
图1 搅拌式生物反应器示意图
Fig.1 The schematic diagram of stirred bioreactor
植物生理学报304
反应器中的pH略低于摇瓶中的, 这可能是与细胞
在反应器中受到流体剪切伤害, 部分细胞内含物
的外泄有关。
2 反应器中甘草细胞的活力变化
细胞膜的透性分析采用Evans Blue染色法, 完
整的植物细胞膜是不能渗入如Evans Blue的大分
子物质, 当细胞遇到伤害细胞膜有损伤后大分子
物质就能逐渐渗入。进入细胞内的Evans Blue的
量反映了细胞受伤害的程度, Evans Blue的吸收值
越大, 代表细胞死亡越多, 细胞活力越小。由图4
可以看出, 在摇瓶培养的整个过程中, 细胞活力没
有明显的变化。而在反应器培养过程中, 细胞活
力在前8 d变化较大, 而后趋于稳定。在培养的初
期(0~3 d), 细胞活力明显下降, Evans Blue的最大
吸收值(第3天)达到初始值的6倍。这说明细胞在
接入反应器后立即受到流体胁迫和剪切伤害, 部
分细胞出现细胞膜的损伤导致活力下降。之后,
Evans Blue吸收值下降, 细胞活力有所回升, 与初
始培养时细胞的活力基本平衡, 后面的培养过程
中细胞活力基本无变化, 同一培养时间段对比摇
瓶培养细胞活力均表现为下降。
3 反应器中甘草细胞的黄酮产量变化
在受流体胁迫和剪切作用情况下, 反应器中
培养的甘草细胞黄酮的合成情况见图5。可以看
出, 次级代谢产物甘草黄酮在反应器培养过程中
的合成量较摇瓶培养有明显的提高。甘草黄酮积
累的最大值(120.7 mg·L-1)出现在反应器培养的第
18天, 是摇瓶培养(78.5 mg·L-1)的1.5倍。第18天以
后黄酮的含量出现降低, 这种下降可能是因为部
分黄酮类化合物发生了酶解。
4 反应器中甘草细胞的H2O2浓度变化
图6表明, 在摇瓶培养的第3天, 细胞中的H2O2
浓度下降, 然后开始缓慢上升。这种变化的趋势
与在反应器中基本类似, 反应器中H2O2浓度经过
前3 d的短暂下降后上升的相对变化更大, 到培养
的第18天达到最高值, 与黄酮变化类似。由此可
以看出, 细胞中黄酮积累的最大值与H2O2最大浓
度之间有一个明显的对应关系。
讨　　论
实现了甘草细胞悬浮培养从摇瓶到反应器的
图2 甘草细胞在摇瓶和反应器中生物量的变化
Fig.2 Changes in biomass of licorice cell in the stirred
bioreactor and shake flask
图3 甘草细胞在摇瓶和反应器中pH的变化
Fig.3 Changes in pH of licorice cell in the stirred
bioreactor and shake flask
图4 甘草细胞在摇瓶与反应器中的活力变化
Fig.4 Changes in cell activity of licorice cell in the stirred
bioreactor and shake flask
李雅丽等: 甘草细胞在搅拌式生物反应器中的放大培养 305
放大, 并以摇瓶培养为对照, 对甘草细胞在反应器
中悬浮培养的特性进行分析。结果发现, 相同培
养条件下, 反应器中培养的细胞生物量的积累低
于摇瓶培养, 整个培养周期较摇瓶培养缩短。培
养过程中同一时间段反应器中的pH值略低于摇瓶
中的pH, 细胞中H2O2的浓度是摇瓶中的1.8倍。
Mur等(2005)报道过烟草细胞在被病原菌诱导时会
出现一个双向的氧迸发, 这种氧迸发模式分别在
中国红豆杉和龙眼细胞悬浮培养过程中也报道过
(Han和Yuan 2004; Zhao等2005)。另一方面, 相同
培养条件下, 反应器中细胞次级代谢产物甘草黄
酮的产量是摇瓶培养的1.5倍, 这种现象与其他文
献报道的其他植物细胞体外培养合成次级代谢产
物的情况是相似的(Trejo-Tapia等2005; Luna-Palen-
cia等2005)。这些结果表明, 在反应器培养条件下,
机械搅拌与通气引起的高剪切力与流体剪切对部
分细胞产生了伤害, 破坏了细胞的膜结构, 使细胞
的生长受到一定程度的抑制, 但刺激了细胞中氧
的迸发与次生代谢产物甘草黄酮较高水平的合
成。H2O2在植物次级代谢产物合成的过程中起着
很重要的作用, 这一点与很多早期的研究报道一
致(Chen和Huang 2000; Alvarez等1998)。
植物细胞培养的反应器主要有搅拌式、气升
式、鼓泡式和转鼓式几种。选择和开发新型反应
器要依据能否长时间维持无菌状态, 维持发酵液
均匀混合, 控制反应器内的温度和pH, 保持稳定的
供氧, 以及反应器放大的难易程度等等。搅拌式
反应器通过搅拌和通气控制溶氧, 混合效果好, 供
氧能力强, 适应性广, 在植物细胞大规模培养中广
泛应用, 但搅拌产生的剪切力会对植物细胞产生
伤害, 直接影响细胞生长, 可以通过调整搅拌桨样
式、桨叶大小、搅拌速率等减小搅拌产生的剪切
力, 降低对细胞的伤害。植物细胞生长周期长, 要
求反应器有在相对长的时间里保持良好的防污染
的能力, 搅拌式生物反应器的搅拌轴因为长时间
使用会出现封不严的问题。在这一点上, 气升式
反应器有明显的优势, 它没有搅拌装置, 整个系统
封闭, 容易保持反应器内无菌状态, 但气升式反应
器容易发泡, 起泡是初始培养基中高浓度的糖以
及培养后期细胞释放的蛋白质所致。将气升式反
应器与低速搅拌相结合, 可以加强混合有利于氧
传递同时细胞所受剪切力相对降低, 这样的新型
植物细胞培养反应器可以有很广泛的应用前景。
参考文献
董静洲, 易自力, 蒋建雄(2006). 我国药用植物资源研究概况. 医学
研究杂志, 35 (1): 67~69
杨英(2007). 甘草细胞培养合成甘草黄酮及其调控研究. 武汉: 华
中科技大学
Alvarez ME, Pennell RI, Meijer PJ, Ishikawa A, Dixon RA, Lamb C
(1998). Reactive oxygen intermediates mediate a systemic signal
network in the establishment of plant immunity. Cell, 92 (6):
773~784
Chong TM, Abdullah MA, Fadzillah NM, Lai OM, Lajis NH (2005).
Jasmonic acid elicitation of anthraquinones with some associat-
ed enzymic and non-enzymic antioxidant responses in Morinda
elliptica. Enzyme Microb Technol, 36 (4): 469~477
Chen SY, Huang SY (2000). Shear stress effects on cell growth and
图5 甘草细胞在摇瓶和反应器中的黄酮产量变化
Fig.5 Changes in licorice flavonoids content of licorice cell in
the stirred bioreactor and shake flask
图6 甘草细胞在摇瓶和反应器中的H2O2浓度变化
Fig.6 Changes in H2O2 contents of licorice cell in the stirred
bioreactor and shake flask
植物生理学报306
L-DOPA production by suspension culture of Stizolobium
hassjoo cells in an agitated bioreactor. Bioprocess Eng, 22 (1):
5~12
Gong YW, Li SY, Han RB, Yuan YJ (2006). Age-related responses
of suspension cultured Taxus cuspidata to hydrodynamic shear
stress. Biochem Eng J, 32 (2): 113~118
Han RB, Yuan YJ (2004). Oxidative burst in suspension culture of
Taxus cuspidata induced by a laminar shear stress in short-term.
Biotechnol Progr, 20 (2): 507~513
Luna-Palencia GR, Cerda-Garcia-Rojas CM, Rodriguez-Monroy M,
Ramos-Valdivia AC (2005). Influence of auxins and sucrose in
monoterpenoid oxindole alkaloid production by Uncaria tomen-
tosa cell suspension cultures. Biotechnol Progr, 21 (1): 198~204
Mur LAJ, Kenton P, Draper J (2005). In planta measurements of
oxidative bursts elicited by avirulent and virulent bacterial
pathogens suggests that H2O2 is insufficient to elicit cell death in
tobacco. Plant Cell Environ, 28 (4): 548~561
Pan ZW, Wang HQ, Zhong JJ (2000). Scale-up study on suspension
cultures of Taxus chinensis cells for production of taxane diter-
pene. Enzyme Microb Technol, 27 (9): 714~723
Trejo-Tapia G, Cerda-Garcia-Rojas CM, Rodriguez-Monroy M,
Ramos-Valdivia AC (2005). Monoterpenoid oxindole alkaloid
production by Uncaria tomentosa (Willd) DC cell suspension
cultures in a stirred tank bioreactor. Biotechnol Progr, 21 (3):
786~792
Xu QM, Cheng JS, Ge ZQ, Yuan YJ (2004). Effects of organic sol-
vents on membrane of Taxus cuspidata cells in two-liquid-phase
cultures. Plant Cell Tiss Org Cult, 79 (1): 63~69
Zhang QY, Ye M (2009). Chemical analysis of the Chinese herb-
al medicine Gan-Cao (licorice). J Chromatogr, 1216 (11):
1954~1969
Zhao J, Fujita K, Sakai K (2005). Oxidative stress in plant cell culture:
A role in production of beta-thujaplicin by Cupresssus lusitanica
suspension culture. Biotechnol Bioeng, 90 (5): 621~631