全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 3期，2008年 6月504
外源水杨酸对悬浮培养甘草细胞中甘草黄酮积累的影响
杨英，何峰，季家兴，郑辉，余龙江 *
华中科技大学生命科学与技术学院，武汉 430074
提要：甘草细胞悬浮培养体系中添加 10 mg·L-1水杨酸可促进和提高甘草细胞的生长和甘草总黄酮产量。添加水杨酸可
导致细胞中过氧化氢含量升高，引起细胞中苯丙氨酸裂解酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活性的增强以及丙二醛含量的升高。
关键词：水杨酸；悬浮培养甘草细胞；甘草黄酮积累；防御反应
Effects of Exogenous Salicylic Acid on the Flavonoid Accumulation in Cell Sus-
pension Culture of Glycyrrhiza inflata Bat.
YANG Ying, HE Feng, JI Jia-Xing, ZHENG Hui, YU Long-Jiang*
College of Life Science and Technology, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430074, China
Abstract: Effects of salicylic acid on the cell biomass and flavonoid accumulation in cell suspension cultures of
Glycyrrhiza inflata were studied. The results showed that 10 mg·L-1 salicylic acid increased the cell biomass and
flavonoid accumulation by 28% and 33%, respectively. In addition, salicylic acid increased the content of H2O2,
the activities of phenylalanine ammonialyase, catalase, peroxidase and malondialdehyde content.
Key words: salicylic acid; cell suspension cultures of Glycyrrhiza inflata; flavonoid accumulation; defense
response
收稿 2008-01-16 修定 2008-04-29
致谢 新疆建设兵团新疆昆仑神农股份有限公司提供经费支持。
* 通讯作者(E -m a i l：Y u l j @h u st . e du .c n；T e l：0 2 7 -
8 7 7 9 2 2 6 4；Fa x：0 2 7 -8 7 7 9 2 2 6 5 )。
采用细胞培养大规模生产甘草的有效成分已
多有报道，如梁玉玲等 ( 2 0 0 0 ) 用胀果甘草
(Glycyrrhiza inflata)愈伤组织培养生产甘草酸；
杨世海等(2005)的乌拉尔甘草(G. uralensis)愈伤组
织培养条件的探索以及杜旻等(2001)乌拉尔甘草
毛状根培养体系的建立等。但有关采用甘草细胞
培养生产总黄酮的研究几乎还是空白。此外，
水杨酸(salicylic acid，SA)是植物体内可自身合
成的一种类似植物激素的酚类化合物，它参与许
多生理过程，并与植物抗病反应密切相关。近
年来的研究表明，施加 SA可影响植物体内一系
列生理反应，其对植物培养物的次级代谢的诱导
也引起人们越来越多的注意，报道也越来越多
(于放等 2005；徐亮胜等 2005；罗建平等 2006；
张东向等 2007)。但对胀果甘草悬浮细胞合成甘
草黄酮的研究尚未见报道。因此，本文在研究
SA影响甘草细胞生长和黄酮合成的同时，对其
与防御反应相关的几个生化指标如过氧化物酶
(peroxidase，POD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、
过氧化氢(H 2O 2)和丙二醛(ma londia ldehyde，
MDA)含量变化作了检测，以探讨SA影响甘草黄
酮合成的机制。
材料与方法
实验材料为我们实验室保存的高产甘草黄酮
的胀果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)细胞系。其高
产甘草黄酮细胞系悬浮培养的培养基为MS+0.5
mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 2,4-D+3%
蔗糖，高压灭菌前 pH调至 5.8。在 30 µmol·m-2·s-1
光照条件下振荡培养，光暗周期为 12 h/12 h。摇
床转速为 120 r·min-1，培养温度为(25±1) ℃，每
20 d继代一次细胞，接种量为 5%，用 250 mL三
角瓶，每瓶装 80 mL培养基。所有实验至少重复
3次。
不同浓度 SA经过滤灭菌后，在细胞培养的
对数生长期(第 11天)，添加到悬浮培养体系中。
培养一个周期(共 20 d)后，培养物以沙芯漏斗过
滤，用蒸馏水将残留的培养液冲洗干净，再次抽
滤，称重，得到细胞鲜重(FW)，然后将所得细
胞置于 50 ℃烘箱中烘干至恒重，冷却后称得细胞
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干重(DW)。
测定甘草黄酮的含量时，准确称取 1 g干燥
至恒重的甘草细胞粉末，过 100目筛，加入 30倍
量 80%乙醇溶液超声提取 1 h，提取液减压浓缩，
用等量乙酸乙酯萃取 3次，合并萃取液，然后用
95%乙醇提取，离心后上清液为甘草黄酮液。甘
草黄酮含量测定用比色法(张雪辉等 2001)，即用
甲醇稀释后，再加 0.5 mL 10% KOH溶液，充
分摇匀显色 5 min后，用甲醇定容至 10 mL，摇
匀，用Unico紫外可见分光光度计[Unico wfz UV-
2100，尤尼柯(上海)仪器有限公司]测定其波长
410 nm处的吸收值，以芦丁为标准样品。
苯丙氨酸裂解酶(phenylalanine ammonialyase，
PAL)和 POD活性及MDA含量的测定均参照李合
生(2000)书中的方法。H2O2含量测定用顾月华等
(1998)文中的方法。CAT活性的测定参照文献(李
合生 2000；彭志英和蒋黎 1995)进行。
结果与讨论
1 SA对甘草细胞生长和黄酮积累的影响
如图 1所示，在一定的浓度范围内，随着SA
浓度的增加，甘草细胞的生物量和总黄酮产量也
在增加，SA浓度为 10 mg·L-1的甘草细胞的生物
量和总黄酮产量最大。SA的浓度继续增大的甘草
细胞的生物量和总黄酮产量都开始下降，SA浓度
达到 50 mg·L-1的甘草细胞的生物量和总黄酮产量
与不加 SA的差异不显著，而且 SA浓度继续提高
的细胞生物量和总黄酮产量明显低于不加 SA的。
这说明低浓度SA促进甘草黄酮的合成，而高浓度
的 S A 则抑制。
2 SA对 PAL、POD和CAT活性的影响
PAL在黄酮合成中非常重要，能够催化苯丙
氨酸生成肉桂酸，肉桂酸又经多步催化，其产物
与乙酸的衍生物结合生成查耳酮，在此基础上又
合成其他黄酮(李雄彪和张金忠 1992)。由图 2可
以看出：添加 SA的细胞中 PAL活性逐渐增强，
第 4 天时，达到最高，此后，酶活开始急剧下
降，但第 5天时的酶活仍高于不加 SA的。不加
SA的细胞的 PAL活性在处理后的第 1天即下降，
图 1 SA对甘草细胞生长和黄酮积累的影响
Fig.1 Effects of SA on the cell biomass
and flavonoid accumulation
图 2 SA对 PAL、POD和 CAT活性的影响
Fig.2 Effects of SA on the PAL, POD and CAT activities
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第 3天降至最低，随后又开始上升，最终保持在
9 U·g-1 (FW)·min-1，但仍然比加 SA的酶活低。加
SA的细胞的 PAL活性增强，与加 SA的总黄酮产
量升高的变化规律一致。从图 2还可以看出：不
加 SA的细胞的POD活性变化不明显。而添加SA
的细胞的 POD活性则急剧上升，第 1天最高，随
后开始下降，但下降速度非常缓慢，在第 5 天，
仍比不加 SA的高 21.9%。这说明 SA促进 POD活
性升高，这对于及时清除过量的H2O2是重要的。
前 3 d，不加 SA的细胞 CAT活性没有明显变化，
培养后期，细胞 CAT活性有所下降。添加 SA后
的第 1天，细胞中 CAT的活性快速升高，并达到
最大；此后，开始下降，第 2 ~ 4 天，加 S A 的
CAT活性变化不显著，第 4天的CAT酶活仍显著
高于不加 SA的；随后急剧下降，第 5天时的仅
为不加 SA的 29.5%。
3 SA对H2O2含量的影响
由图3可以看出，不加SA的细胞产生的H2O2
含量一直比较稳定；而以 SA处理的细胞H2O2含
量立即下降，处理后的 1 h便开始上升，2 h内
产生的H2O2含量和不加 SA的变化均不显著，其
含量继续升高，并在第 3 小时达到最高，而后，
急剧下降，第 5小时起与不加 SA的差异不显著。
这说明添加SA可促进短时间内的细胞中H2O2的产
生。
4 SA对MDA含量的影响
从图 4 可以看出，在培养过程中，不加 SA
的细胞中MDA含量在3.06 µmol·g-1 (FW)上下浮动
10%；而在添加 SA后，细胞中MDA含量迅速升
高，第 3 天达到最高，此后开始下降，但在处
理后的第 5天，加 SA的细胞中MDA含量仍然显
著高于不加 SA 的。
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图 4 SA对MDA含量的影响
Fig.4 Effect of SA on the MDA content
图 3 SA对H2O2含量的影响
Fig.3 Effect of SA on the H2O2 content