全 文 ：植物生理学通讯 第 46 卷 第 5 期, 2010 年 5 月448
收稿 2010-01-22 修定 　2010-03-08
资助 国家自然科学基金(30 7 00 0 5 2)、广东省自然科学基金
博士启动项目(4600-E09022)和河南科技大学博士启动
基金(0 90 0 1 2 71 )。
* 通讯作者(E-mail: wyq@scau.edu.cn; Tel: 020-85280194)。
非生物胁迫下水稻OsLRR基因的表达分析
张建军 1, 胥华伟 2, 谭锦汶 1, 陈建东 1, 王玉琪 1,*, 彭新湘 1
1 华南农业大学生命科学学院分子植物生理研究室, 广州 510642; 2 河南科技大学农学院, 河南洛阳 471003
提要: 植物中含有多种富含亮氨酸重复(leucine-rich repeats, LRRs)的蛋白质, 这类蛋白质在植物生长、发育和抗病反应等方
面发挥着重要作用。本研究在水稻中克隆到一个编码LRRs结构的基因OsLRR, 以半定量RT-PCR检测了OsLRR在水稻不
同组织和不同非生物胁迫的表达情况, 并进一步分析了铝毒胁迫下OsLRR在抗铝和铝敏感水稻品种之间的表达差异。结
果表明OsLRR在水稻根、叶鞘和叶中都有较高表达。铝、砷、PEG6000和ABA可诱导水稻根中OsLRR的表达, 而镉、硝
普钠和铁则抑制其表达。只有盐胁迫能诱导叶片中OsLRR的表达。铝毒可以诱导抗铝和铝敏感水稻品种根中OsLRR的表
达, 但随着处理时间的延长, 抗铝品种中OsLRR的表达逐渐加强, 而铝敏感品种中OsLRR的表达则逐渐减弱。
关键词: 水稻; OsLRR; 半定量RT-PCR; 非生物胁迫
Expression Analysis of OsLRR in Rice under Abiotic Stresses
ZHANG Jian-Jun1, XU Hua-Wei2, TAN Jin-Wen1, CHEN Jian-Dong1, WANG Yu-Qi1,*, PENG Xin-Xiang1
1Laboratory of Molecular Plant Physiology, College of Life Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou 510642,
China; 2College of Agriculture, Henan University of Science and Technology, Luoyang, Henan 471003, China
Abstract: There are many proteins with leucine-rich repeats (LRRs) in plants, which play important roles in
plant growth, development and disease resistance. In this study, a gene in rice, OsLRR, which encodes a protein
with leucine rich repeats, was cloned by PCR. The expression patterns of OsLRR in different tissues or under
various abiotic stresses were analyzed by semi-quantitative RT-PCR, and the difference between an aluminum
(Al)-resistant cultivar and an Al-susceptible cultivar under Al stress was also observed. The results showed that
the OsLRR was highly expressed in roots, leaf sheahs and leaves. The expression level of OsLRR was highly
induced by Al, arsenic, PEG6000 and ABA, while inhibited by cadmium, SNP (sodium nitroprusside) and iron
toxicity in rice roots. In rice leaves, OsLRR could only be induced by salt stress. In addition, its expression in
rice roots was gradually enhanced in the Al-resistant cultivar while reduced in the Al-susceptible cultivar under
Al stress.
Key words: rice; OsLRR; semi-quantitive RT-PCR; abiotic stresses
植物在自然环境中经常受到干旱、盐害、重
金属等非生物胁迫的威胁。非生物胁迫下植物会
产生不同的生理生化反应, 植物体中的特异基因会
被诱导表达以适应环境胁迫(de Lorenzo等2007), 如
富含亮氨酸重复(leucine-rich repeats, LRRs)结构的
蛋白质就在植物抵御逆境过程中发挥着重要作用。
植物中含有多种富含亮氨酸重复结构的蛋白
质, 这些蛋白质在 LRRs 单位重复数目以及氨基酸
序列上有所差异。植物LRR蛋白由于具有特异的
亮氨酸重复结构, 大多具有相似或相同的功能, 多
参与植物逆境防御相关过程, 与抗逆性反应、发育
和信号转导相关。近年来, 人们发现植物抗性基因
(resistance gene, R 基因)编码蛋白中最重要的结构
特征之一就是具有 LRRs 结构。LRRs 在 R 蛋白中
既涉及蛋白质之间的互作, 又参与受体磷酸化等下
游信号的转导过程(Martin 等 2003)。已从拟南芥
(Arabidopsis thaliana, Hong 等 1997)、胡萝卜
(Daucus carota, Worrall 等 1998)、烟草(Nicotiana
tabacum , Xu 等 2009)、蒺藜苜蓿(Medicago
truncatula, Merchan等 2007; de Lorenzo等 2009)和
油菜(Brassica campestris, Ahsan等 2005)等植物中
克隆得到了可被低温、高盐和ABA等非生物胁迫
诱导表达的基因, 这些基因编码LRR蛋白并参与多
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种胁迫反应。但总体来说, LRR 蛋白在参与非生
物胁迫方面的研究相对较少。
水稻是我国最重要的粮食作物之一。近年来,
干旱、盐害和重金属等非生物胁迫严重影响水稻
的产量和品质, 研究水稻对非生物胁迫的应答反应
具有重要意义。本实验室从抗铝水稻品种 ‘ 湘糯 1
号’中筛选到铝毒诱导基因OsLRR (Zhang等2007),
OsLRR蛋白具有LRR结构, 半定量RT-PCR分析表
明水稻根、叶鞘和叶中的 OsLRR 表达量较高, 铝
毒可诱导根 OsLRR 的大量表达。为了进一步探讨
OsLRR表达与非生物胁迫的关系, 分析了不同非生
物胁迫以及抗铝和铝敏感品种中 OsLRR的表达差
异, 以期为研究水稻的抗逆分子机理及作物改良提
供理论依据。
材料与方法
以抗铝水稻(Oryza sativa L.)品种 ‘ 湘糯 1 号 ’
(Xiangnuo 1, XN1)和铝敏感水稻品种 ‘湘中籼 2号 ’
(Xiangzhongxian 2, XX2)(Xu等 2004)为试验材料。
水稻种子用水冲洗干净后, 浸种 12 h, 取出转
入垫有湿滤纸的培养皿中, 置于 28 ℃恒温培养箱
中暗培养。发芽后点播于尼龙网, 长至 2~3片真叶
后, 移栽至木村 B 营养液中, 预培养 4 d 后分别进
行各种处理。 (1)缺磷处理: 将木村 B 营养液中的
KH2PO4替换为等摩尔体积的KCl作为缺磷处理营
养液。(2)铝毒加缺磷处理: 在含终浓度 1 mmol·L-1
AlCl3缺磷处理营养液的基础上, 添加KH2PO4至终
浓度 0, 180, 540, 1 620 μmol·L-1 作为 4 个铝毒加磷
的处理(pH 4.2)。(3)模拟各种非生物逆境: 木村 B
营养液中分别加入终浓度 1 mmol·L-1 AlCl3、140
mmol·L-1 NaCl、50 μmol·L-1 CdCl2、50 μmol·L-1
Na3AsO4、20% PEG6000、20 μmol·L-1 百草枯
(paraquat)、100 μmol·L-1 H2O2、100 μmol·L-1 脱
落酸(abscisic acid, ABA)、100 μmol·L-1 硝普钠
(sodium nitroprusside, SNP)和 360 μmol·L-1 FeSO4
(pH 4.2)。处理 2 d 后, 分别取根和叶置于-80℃
保存备用。(4)木村B营养液中分别加入终浓度为1
mmol·L-1 AlCl3作为抗铝和铝敏感水稻品种的铝毒处
理(pH 4.2)。处理 2 d 和 4 d 后, 取根置于-80℃保
存备用。
取 50~100 mg 材料液氮研磨后, 加入 1.0 mL
Trizol 提取缓冲液, 参照说明书提取总 RNA。总
RNA用 DNase I (TaKaRa, 大连) 37 ℃处理 30 min
以除去微量的基因组 DNA, 然后抽提纯化 RNA。
采用紫外分光光度计法检测总RNA的浓度和纯度,
1% 的变性琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整性。
取 1 μg 总 RNA, 以 Oligo(dT)18 为引物参照逆
转录试剂盒说明合成各个样品的cDNA第1链。以
水稻 Actin基因 OsACTIN 作为 RT-PCR 的内参, 引
物为ACTIN-F: 5 GACTCTGGTGATGGTGTCAGC
3和ACTIN-R: 5 GGCTGGAAGAGGACCTCAGG
3。OsLRR 基因引物为 OsLRR-F: 5 GCAATGCC-
GAATCTGTTG 3 和 OsLRR-R: 5 GTAAGATCC-
AATTCCTCCAAGT 3。反应条件为: 94 ℃预变性
3 min; 94 ℃变性 30 s, 56 ℃退火40 s, 72 ℃延伸40
s, 25~28 个循环; 最后 72 ℃保温 5 min。PCR 产
物在 1% 的琼脂糖凝胶上电泳并用凝胶成像系统
(QuantityOne, Bio-Rad)分析。
实验结果
1 水稻根、叶鞘和叶片中OsLRR的表达分析
在正常培养条件下, OsLRR 在水稻根、叶鞘
和叶片中表达量都较高, 28个循环就能见到明显条
带(图 1)。扩增片段的测序结果表明该 cDNA片段
与已报道的 OsLRR (Os12g0108500)的同一性为
10 0%。
图 1 半定量RT-PCR 分析OsLRR 在水稻不同组织中的表达
Fig.1 Expression analysis of OsLRR in different tissues from
rice by semi-quantitative RT-PCR
2 缺磷和铝毒胁迫下OsLRR的表达分析
我们以前的研究表明在氯化钙系统中 OsLRR
能被铝毒诱导, 并且抗铝品种XN1中的诱导量较铝
敏感品种 XX2 高(Zhang 等 2007)。近年来磷与铝
毒胁迫之间的关系倍受关注, 研究表明铝毒胁迫下
植物根系中磷的浓度增加, 植物体内却表现出一定
的似缺磷症状, 可能原因是铝使磷在根的表面沉积,
植物生理学通讯 第 46 卷 第 5 期, 2010 年 5 月450
降低了根系中磷的转运, 从而影响与磷有关的代谢
活动(黄娟等 2005)。因此, 为了证实 OsLRR 确实
是由铝毒所诱导, 而不是铝毒导致的水稻缺磷而引
起, 试验进一步以木村B营养液系统检测了缺磷和
铝毒胁迫下抗铝品种XN1中OsLRR的表达。结果
显示缺磷处理3 d能轻微诱导水稻根中OsLRR的表
达, 而处理 6 d 则无显著差异(图 2)。铝毒处理 3 d
和 6 d均能显著诱导根OsLRR的表达; 随着磷浓度
的提高, 水稻根中 OsLRR 的表达量逐渐降低, 当加
入 1 620 μmol·L-1 磷处理时, OsLRR 的表达量显著
降低(图2), 这可能与磷能和铝结合从而降低活性铝
的浓度有关(Liao 等 2006), 进一步说明水稻根中
OsLRR 主要由铝诱导表达而与缺磷诱导关系不
大。缺磷和铝毒胁迫 3 d 叶片 OsLRR 的表达模式
与根中相似, 但处理 6 d OsLRR的表达则没有显著
差异(图 2)。
图 2 半定量 RT-PCR 分析 OsLRR 在缺磷和铝毒胁迫下的表达
Fig.2 Expression analysis of OsLRR under phosphate deficiency and Al toxicity by semi-quantitative RT-PCR
CK: 对照; -P: 缺磷; Al: 1 mmol·L-1 AlCl3; 0P, 1P, 2P, 3P 分别表示 0, 180, 540 和 1 620 μmol·L-1 磷处理。
3 几种非生物胁迫下OsLRR的表达分析
以上结果表明铝毒能大量诱导水稻根中
OsLRR的表达, 缺磷仅能轻微诱导根中OsLRR的表
达, 推测 OsLRR 可能参与水稻对非生物胁迫的反
应。为研究不同胁迫下 OsLRR 的表达模式, 试验
进一步以抗铝水稻品种XN1为材料, 分别以不同的
环境胁迫因子如盐、金属( 砷、镉、铁) 、除草
剂(百草枯)和渗透胁迫(PEG6000)以及外源信号物
质如 ABA、NO 供体 SNP 和 H2O2 处理水稻, 分析
OsLRR 在这些非生物胁迫下的表达情况。结果显
示, 除了铝毒能大量诱导根中 OsLRR 的表达外,
砷、PEG6000和ABA也能大量诱导该基因的表达,
而镉、SNP 和铁则明显抑制 OsLRR 的表达; 叶片
OsLRR只能被盐胁迫显著诱导, 其它胁迫下差异不
大(图 3)。不同非生物胁迫下水稻根中 OsLRR 的
表达有很大差异, 说明根中OsLRR可能参与介导水
稻对多种非生物胁迫的反应。
4 铝毒胁迫下抗铝和铝敏感水稻品种中OsLRR的
表达分析
以上结果表明铝毒能大量诱导根中OsLRR的
图 3 半定量 RT-PCR 分析 OsLRR 在非生物逆境下的表达
Fig. 3 Expression analysis of OsLRR under abiotic stress by semi-quantitative RT-PCR
CK: 对照; Al: 1 mmol·L-1 AlCl3; Na: 140 mmol·L-1 NaCl; Cd: 50 μmol·L-1 CdCl2; As: 50 μmol·L-1 Na3AsO4; PEG: 20% PEG6000; Pa:
20 μmol·L-1 百草枯; ABA: 100 μmol·L-1 ABA; SNP: 100 μmol·L-1 SNP; Fe: 360 μmol·L-1 FeSO4。
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表达, 我们进一步分析了铝毒胁迫下抗铝水稻品种
XN1 和铝敏感水稻品种XX2根中OsLRR的表达情
况(图 4)。结果表明铝毒处理 2 d 均能显著诱导根
中OsLRR 的表达, 但随着铝毒胁迫时间的延长, 抗
铝品种 XN1 根中 OsLRR 的诱导表达量逐渐增加;
而铝敏感品种XX2根中OsLRR的诱导表达量则逐
图 4 半定量 RT-PCR 分析铝毒胁迫下抗铝和铝敏感水稻根中 OsLRR 的表达
Fig.4 Expression analysis of OsLRR in rice cultivars with different sensitivities under Al stress by semi-quantitative RT-PCR
CK: 对照; Al: 1 mmol·L-1 AlCl3; R 和 S 分别代表抗铝品种(XN1)和铝敏感品种(XX2)。
渐减少, 说明OsLRR可能与水稻的抗铝性密切相关。
讨　　论
大量研究表明, 有机酸的诱导形成及根际分泌
在植物内部解铝毒及拒铝机制中均起关键作用
(Ryan等2001; 杨志敏和汪瑾2003; Kochian等2004;
刘强等2004; 尤江峰和杨振明2005; 杨建立等2005),
从小麦(Triticum aestivum)、大麦(Hordeum vulgare)
和高粱(Sorghum bicolor)中克隆到的抗铝基因也
与苹果酸和柠檬酸的分泌相关(Sasaki 等 2004;
Furukawa等 2007; Magalhaes等 2007), 但铝毒胁迫
下水稻仅能分泌少量的柠檬酸, 检测不到苹果酸和
草酸等其它有机酸的分泌, 并且抗铝品种和铝敏感
品种中柠檬酸的分泌量没有显著差异(Ma等2002;
Yang等2008), 说明水稻抗铝性与有机酸的分泌关
系不大。本研究结果表明铝毒能大量诱导水稻根
中 OsLRR的表达, 且随铝毒胁迫时间的延长, 抗铝
品种根中OsLRR的诱导表达逐渐提高, 而铝敏感品
种中 OsLRR 的诱导表达逐渐降低, 说明 OsLRR 可
能与水稻的抗铝性密切相关。LRR 蛋白参与蛋白
质的互作, 通过与配体结合介导植物的生长、发育
和抗病等反应(张盈玉和马荣才 2009; 祝钦泷和李
名扬2009), 特别是诱导许多抗病基因的表达(Jones
和Takemoto 2004; Akira等2006), 使植物获得系统
抗性。本研究也证实除了铝毒能诱导水稻根中
OsLRR 的表达外, 砷、PEG6000 和 ABA 也可诱导
根 OsLRR 的表达, 而水稻叶中的 OsLRR 仅能被盐
胁迫诱导。铝和砷胁迫均能使植物根的生长受到
抑制, 从而吸水困难而产生水分胁迫(常思敏等
2005; 杨亚军等 2006); PEG6000、ABA 和盐处理
都会造成渗透胁迫(张春梅等 2008; Hong等 1997),
因此 OsLRR的诱导表达可能与脱水产生的渗透胁
迫相关, 胡萝卜中富含亮氨酸重复蛋白能够抑制冰
晶的形成从而缓解渗透胁迫的伤害也印证了这一推
测(Worrall 等 1998)。镉、SNP 和铁等胁迫主要
产生氧化胁迫, 但在这些胁迫下根OsLRR的表达受
到抑制, 说明OsLRR的抑制表达可能与活性氧产生
的氧化胁迫相关。根据以上研究结果, 我们推测水
稻根中 OsLRR 的表达可能受水分胁迫诱导, 通过
LRRs结构参与蛋白质之间的相互识别, 从而引起下
游蛋白磷酸化和ABA诱导相关基因的表达进一步
调节水稻的抗逆性。
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