全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (3): 229~234 229
收稿 2010-12-24　　修定 2011-01-25
资助 国家自然科学基金(31060057)。
* 通讯作者(E-mail: hb_nmg@163.com; Tel: 0471-4308800)。
禾本科植物EST的研究进展
张佳佳, 韩冰*
内蒙古农业大学生命科学学院, 呼和浩特010018
摘要: 禾本科作物与人类密切相关, 对其分子水平上的研究具有重要的理论和实践意义。EST技术的产生和不断完善为禾
本科植物的研究带来了新的思路, 迅速推动禾本科植物研究工作的进行。本文综述了EST技术在禾本科植物研究中的应
用, 包括EST分子标记、构建遗传学图谱、比较基因组学、发现与克隆新基因、基因表达研究以及DNA芯片技术等, 并对
EST在禾本科植物研究中存在的问题及应用前景进行了分析。
关键词: 禾本科; EST分子标记; 遗传学图谱; 比较基因组学; 基因表达
Research Advancement of EST in the Gramineae Plants
ZHANG Jia-Jia, HAN Bing*
College of Life Sciences, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China
Abstract: Gramineous crops are playing an important role in human life and there is both theoretical and prac-
tical significance in molecular researches. With EST coming into being and continuously improving, new ideas
have been brought to researches of the gramineous crops which promotes the research work greatly. The appli-
cations of EST technology in grasses were summarized in the essay, including: the EST markers, the construc-
tion of genetics maps, comparison genomics, searching and isolating the new genes, and the gene expression
research, and so on. Meanwhile, we analyzed the problems we had in the research together with the outlook of
EST for research of the grasses.
Key words: Gramineae; EST molecular markers; genetic linkage map; comparative genomics studies; gene ex-
pression
1991年, 美国国立卫生研究院(National Insti-
tutes of Health, NIH)的生物学家Venter等首次提出
表达序列标签(expressed sequence tags, EST)这一
概念(Adams等1991)。EST是长度为150~500 bp的
cDNA片段。由于cDNA的5端或3端的有限序列
可特异性地代表一个基因, 故被称为“表达序列标
签”。EST技术是将mRNA逆转录成cDNA并建成
cDNA文库, 从中随机挑选cDNA克隆, 对其5端或
3端进行一步法测序, 所得序列利用相关的生物学
软件分析和处理, 从而获得大量生物学信息, 用以
寻找其生物学意义(Hatey等1998)。另外, 由于EST
来源于一定环境下一个组织总mRNA所构建的
cDNA文库, 因此EST也能说明该组织中各基因的
表达水平。近年来由此形成的技术路线已被广泛
应用于基因识别、绘制基因表达图谱、寻找新基
因等研究领域。EST数据的迅速增长为功能基因
研究提供了丰富的资源, 目前公开向全世界生物
科学工作者提供EST数据的网站主要有: NCBI、
EBI、SIB、Info-biogen、SANBI、MIPS、TIGR、
TIGEM、DDBJ、EMBL等等(Jongeneel 2000)。
禾本科(Gramineae)植物遍布全世界, 能适应
多种不同的环境。它不仅有保持水土、绿化环境
的作用, 并有着重要的经济价值。其中的水稻、
小麦、大麦、玉米、高粱等作物在我国广为栽培,
既是人类粮食的主要来源, 也为工业提供了丰富
的原材料(吴国芳等1991)。为了合理经营现有的
禾本科植物资源, 迫切需要对影响禾本科植物遗
传结构、适应性及生产力的遗传学机制进行更深
入的研究。1991年起动的植物EST计划作为植物
基因组计划的一个重要组成部分 , 已经在拟南
芥、水稻、玉米、小麦、油菜等许多植物中开展
起来, 其中水稻、玉米、小麦等都属于禾本科, 而
水稻则是第一个被选中进行基因组研究的单子叶
植物(骆蒙和贾继增2001)。随着EST数据不断增
长, EST计划的研究内容也得到扩展。例如将获得
植物生理学报230
的EST用于发展分子标记、构建物理图谱、加密
遗传图谱、比较基因组学、分离与鉴定新基因、
基因表达研究、DNA芯片技术。下面主要综述
EST在禾本科植物中的应用。
1 EST衍生的分子标记
EST衍生的分子标记是根据表达序列标签本
身的差异, 以分子杂交或PCR为核心技术而建立的
遗传标记。根据开发的方法不同, 可以将其分为
以下两类。
第一类是以分子杂交为基础的EST标记, 如
EST-RFLP标记(restriction fragment length polymor-
phism markers from EST sequences, 基于EST的限
制性片段长度多态性标记)。该类标记以EST本身
作为探针, 经过不同限制性内切酶消化后的基因
组DNA杂交而产生的标记, 其多态性取决于限制
性内切酶位点的差异。EST-RFLP标记也被应用于
禾本科作物之间的比较基因组研究(Smilde等2001;
Feuillet和Keller 2002; Laurie和Devos 2002)。有人
用荧光原位杂交技术和RFLP标记研究了赖草属3
个物种的亲缘关系, 结果表明, 来源于北欧的沙生
赖草Leymus arenarius (2n=8x=56)与来源于欧亚的
大赖草L. racemosus (2n=4x=28)的亲缘关系较近,
而来源于北美/太平洋地区的滨麦L. mollis与上述
两个物种的亲缘关系较远(Anamthawat-Jónsson和
Bödvarsdóttir 2001)。EST-RFLP标记因其可靠性较
高, 在揭示植物的遗传信息和加速比较基因组研究
等方面都起着重要作用。但开发这类标记过程繁
琐并且技术要求较高且费用昂贵, 目前较少使用。
第二类是基于PCR的EST标记。如EST-SSR
(simple sequence repeat from EST sequences, 基于
EST的简单重复序列)、EST-SNP (single nucleotide
polymorphisms from EST sequences, 基于EST的单
核苷酸多态性)、EST-STS (sequence target site
from EST sequences, 基于EST的序列标签位点)、
EST-AFLP (amplified fragment length polymorphism
from EST sequences, 基于EST的扩增片段长度多
态性)、EST-CAPS (cleaved amplified polymorphic
sequence from EST sequences, 基于EST的切割扩增
多态性序列)、ESTP (expression sequence tag poly-
morphism, 表达序列标签多态性)、TRAP (target
region amplified polymorphism, 靶定区域扩增多态
性)等。它们的共同特点都是利用公共EST序列设
计引物 , 对目标序列区进行特异扩增产生多态
性。由于EST-SSR标记来自于基因的编码序列, 更
容易获得基因表达的信息, 已成为重要的遗传作
图、遗传多样性、比较基因组学研究的新型工
具。目前, 已从公共数据库成功地开发了大量的
禾本科植物EST-SSR标记。Varshney等(2006)通过
发掘大麦EST序列的SSR位点, 将185个EST-SSR标
记定位到大麦的遗传图谱上。Caruso等(2008)用8
对EST-SSR对包括35个栽培种和1个变种在内的36
个竹子品种进行了鉴定, 聚类分析表明品种间遗
传关系与其地理起源有明显的相关性。李杰勤等
(2010)从NCBI中找到202 325条高粱EST序列, 对
EST中的SSR信息进行全面分析并建立EST-SSR标
记。在研究中, 共发现6 663个SSR, 设计出3 446对
引物序列。由此可见, 相对于目前高粱上较少的
SSR引物来讲, 利用EST-SSR来开发新的标记具有
巨大的潜力。目前EST-SSR分子标记技术在小麦
的研究中应用较多。Eujayl等(2002)设计了137个
EST-SSR引物对, 其中有22个引物对在64个硬粒小
麦中扩增出多态性。Ercan等(2010)从抗感F2代种
子中选取抗条锈病型小麦(‘PI78383’)和易感型小
麦(‘Harmankaya99’)分别构建DNA池。对78个
EST-SSR引物进行分析, 发现一个200 bp的EST-
SSR标记(Pk54)存在于抗病型F2代中, 而在易感型
的小麦中则不存在。用Pk54对108个基因型不同
的抗条锈病小麦进行了筛选, 68%的抗条锈病的小
麦含有Pk54, 证明了该标记与抗条锈病有关。张
晗等(2010)利用21对小麦EST-SSR引物对45份黄淮
海地区新育成冬小麦品种的遗传多样性进行了分
析, 证实了EST-SSR标记可用于冬小麦品种DUS测
试中。目前, 很多国家正在开展通过EST发展SSR
标记研究工作, 随着EST-SSR标记的不断开发, 将
在生物的遗传育种、转录图谱绘制、功能基因的
发掘和利用等方面发挥重要作用。
EST标记与其他分子标记相比有其自身的优
越性: (1) EST标记可直接和一个表达基因相关, 从
而获得有关基因表达的信息。如果发现一个EST
标记与某一性状连锁, 那么该EST序列就可能与控
制此性状的基因相关(Schubert等2001); (2)大量的
EST标记可构建EST数据库, 为表达基因的鉴别提
张佳佳等: 禾本科植物EST的研究进展 231
供大量信息; (3)由于EST来自转录区, 其保守性较
高, 故具较好的通用性, 这在亲缘物种之间校正基
因组连锁图谱和比较作图方面有很高的利用价值
(Lan等2000; Brown等2001; 李小白等2006); (4)相
对于基因组测序而言EST标记技术开发简单、快
捷、费用低, 尤其是以PCR为基础的EST标记。
2 EST在禾本科植物中的应用
2.1 EST在遗传学图谱构建中的作用
基因组计划中一般要获得3张遗传学图谱: 遗
传连锁图谱, 物理图谱和转录图谱(骆蒙和贾继增
2001; Lazo等2004)。
遗传连锁图谱是指以遗传标记间重组频率为
基础的一条染色体或基因内位点的相对位置线性
排列图。目前几乎所有重要农作物都构建了分子
遗传连锁图谱。遗传图谱的构建是基因组研究中
的重要环节, 是基因定位与克隆乃至基因组结构
与功能研究的基础(向道权等2001)。水稻和大麦
等基因组测序计划的实施, 促使大量序列信息产
生 , 这些信息可用于高密度遗传连锁图谱的构
建。以前应用RFLP、AFLP、RAPD和重复序列
标记等构建遗传图谱, 随着高通量分析方法的发
展, 如今由于EST片段多态性高也可以用来构建遗
传连锁图谱。因为AFLP、SSR和RAPD等标记主
要定位于非编码区, 所以在有较大基因组的植物
中, EST对于它们的QTL制图尤为重要。Sasaki
(1998)利用日本水稻‘Nipponbare’和印度品种‘Kasal-
ath’杂交F2代186个植株作遗传图谱, 选用了2 300
个DNA标记, 12个连锁群, 总的遗传距离为1 550
cM, 其中70%的标记来源于EST。潘海涛等(2010)
将19个新的EST-SSR位点整合到RIL群体的遗传连
锁图谱上, 增加了图谱的长度, 丰富了功能标记的
数目。
构建染色体物理图谱需大量的单拷贝短序列
(sequence tagged site, STS)作为界标, 由于大多数
基因是单拷贝的, 所以EST可以用来充当STS。
Gadaleta等(2009)精细定位大麦的高度重组区域
7H(1)染色体区段, 把101个大麦EST位点和其他43
个遗传标记整合成饱和遗传图谱, 并构建该区域
的物理图谱。Said和Cabrera (2009)应用以小麦为
背景的有效的检测4Hch染色体区段的分子标记技
术构建了智利大麦的物理图谱, 有效的用于硬粒
小麦和普通小麦的4Hch染色质的基因渗入的辅助
标记。陈华锋等(2007)对11个中国春-百萨偃麦草
异染色体系进行了分析, 结果有10对STS引物可以
特异追踪百萨偃麦草染色质。Hackauf等(2009)把
92个EST-SSR标记、131个AFLP和4个STS标记定
位在黑麦的7个同源群染色体上, 该图谱覆盖了724
cM黑麦基因组。
转录图谱为染色体DNA的某一区段内, 所有
可转录序列的分布图, 以EST为转录基因的产物,
可直接用来构建该图, 它可以与基因组文库序列
比较, 提供内含子结构、可选择的剪切方式、转录
起始与终止位点等信息。Thiel等(2003)从24 595
条大麦EST序列中开发了76个SSR标记, 并将其定
位于大麦的7个连锁群, 从而构建了基于EST-SSR
的大麦转录图谱。
2.2 EST在比较基因组学中的研究
比较基因组学是通过对一种生物相关基因组
的研究来理解、诠释另一种生物的基因组。植物
比较基因组学研究是从比较不同植物的遗传图谱
开始的, 在比较基因组学研究中, 禾谷类作物一直
是研究重点。Saha等(2004)用同一对EST-SSR引物
对高羊茅、黑麦草、水稻和小麦的片段进行扩增
测序, 结果显示所有对应扩增片段的序列相似性
超过85%。EST编码的DNA序列高度保守, 作为表
达基因所在区域的分子标签具有自身的特殊性质,
与来自非表达序列的标记(如AFLP、RAPD、SSR
等)相比更可能穿越家系与种的限制, 因此EST标
记在亲缘关系较远的物种间比较基因组连锁图和
比较质量性状信息上是特别有用的。Varshney等
(2005)利用大麦遗传图谱中的SSR-EST (含有SSR
的EST)与黑麦、小麦、水稻的EST数据比对, 发现
在大麦中的这些SSR-EST在上述物种中都有存
在。把其中9个大麦的EST-SSR用于黑麦图谱的绘
制, 发现所有的这些标记的位置都在预期的功能
区, 并且与在大麦中的位置相似。
植物多样性分析的核心就是遗传多样性, 即
基因多样性。遗传多样性的评价是种质资源保
护、开发和利用的基础, EST-SSR标记为物种遗传
多样性的分析研究提供一条新途径。利用EST标
记进行遗传多样性研究比其他分子标记更具有优
越性, 因为它是对基因内部变异的一种直接评价,
植物生理学报232
有可能和形态性状, 生理生化特征或某个特定的
环境适应型相联系, 而先前往往需要长期的研究
才能从不同资源中获得确切的数据。Sharma等
(2008)应用124组水稻、甘蔗、竹子的SSR和EST-
SSR引物分析了印度6属23种竹子43个样品的遗传
多样性, 其中59对引物在至少一种竹子中可以产
生重复性良好的多态性条带, 表明通用引物可以
很好的用于竹子的系统发育和遗传多样性的研究,
而且聚类结果与传统分类相吻合。
此外, 利用EST中古老保守序列(ancient con-
served region, ACR)来研究物种间的进化关系, 可
避免周期长而繁琐的遗传图谱制作过程, 使结果
更加准确。Tang等(2006)发现, 在分析的423 611个
小麦EST中, 有109 229个EST在水稻、大麦、玉米
中普遍表达, 占小麦EST的23.94%。利用这些EST
分子标记作为分析手段对相关物种基因组进行比
较分析, 为发掘同源基因, 研究复杂生理和病理过
程, 从而认识生物学机制的普遍性, 分析种内遗传
背景的差异和物种间进化关系, 遗传多样性分析,
遗传作图及不同遗传图谱的合并, 比较作图, 以及
系统发育学等的研究都具有极高的应用价值。
2.3 利用EST发现和克隆新基因
目前, 新基因的分离和克隆会通过cDNA或
ESTs进行克隆, 也就是所谓的“电子克隆”。与传
统的基因克隆方法相比, 具有投入低、速度快、
针对性强等优点。在获得与目的基因紧密连锁
EST标记后, 可直接以该序列为基础进行“电子克
隆”得到候选的新基因, 而无需进行大片段cDNA
文库或基因组文库的筛选。因此电子克隆技术具
有非常广阔的发展前景。马小龙等(2009)在研究
中发现一个玉米苗期早期应答干旱的EST序列 ,
与拟南芥ERD6序列同源性较高并且应用电子克
隆与同源克隆技术分离基因ZmERD6。利用半定
量RT-PCR分析该基因在ABA、干旱、盐和冷胁迫
处理以及不同组织中的表达情况, 表明此基因在
不同胁迫下能被诱导表达, 在不同组织中表达有
差异。刘洋等(2010)则以甘蔗蔗糖合成酶基因
(Susy2) cDNA序列为探针, 对高粱EST数据库进行
同源检索, 将获得的4条与甘蔗相似性很高的EST
序列进行拼接, 后经基因组PCR、分子克隆和序列
分析验证获得了甜高粱(Sorghum bicolor)蔗糖合成
酶基因DNA序列。
2.4 利用EST研究基因表达
组织、细胞的分化依赖于基因特异性的时空
表达, 而生物体在某一时间的基因表达数量通常
只占全部基因的15%。一个未标准化处理的cDNA
文库随机挑选克隆进行大规模测序, 所产生的EST
数据可直接回答特定组织在某一时期哪些基因表
达了, 丰度如何等问题, 从而能在基因整体水平研
究相关的功能及代谢。EST计划因具有稳定性高
和分析规模大等特点, 已成为研究基因差异表达
的重要方法, 基因表达谱的研究更是EST计划的主
要目标之一。
EST代表着一段表达的功能基因, 根据同源同
功原理, 按照一组同源EST在不同组织不同时期的
分布, 利用数据库提供的信息, 可在基因整体表达
的水平上研究相关的功能及代谢。将EST聚类成
独特基因后, 可进一步与蛋白质库或已知功能基
因进行同源比较进而可确定其功能并有可能发现
新基因。为了解白粉菌诱导下抗白粉病小麦的抗
病机制, 吴金华等(2008)构建了白粉菌接种初期的
抑制性消减杂交cDNA (SSH-cDNA)文库。经文库
比较 , 筛选出与病程相关蛋白基因同源的EST
( Z 2 5 - 1 )和与谷胱甘肽硫转移酶同源的E S T
(Z440-1), 以其EST序列为依据设计引物, 通过RT-
PCR分析它们在白粉菌诱导下的表达模式, 结果2
个基因表达存在明显差异。病程相关蛋白和谷胱
甘肽硫转移酶属于诱导型表达基因, 且参与白粉
病抗病反应, 在白粉菌诱导72 h时表达量最高(吴
金华等2008)。
2.5 EST与DNA芯片
cDNA芯片是用于分析全基因组水平上基因
表达的重要技术, 具有高通量分析的优点。利用
cDNA芯片可以获得不同环境因子胁迫下的转录
档案(transcript profiling), 这是现代植物生理学的
重要研究手段。己知功能的EST是很好的用于制
备cDNA芯片的材料 , 随着EST数据的扩大 , 用
ESTs文库制备的cDNA芯片将使测序过程简化并
有力促进功能基因组学研究。刘烜等(2009)根据
转基因玉米中所转入的外源基因, 选择CaMV35S
启动子NOS终止子PAT基因和目的基因以及内源
IVR基因设计特异性引物, 采用多重PCR法对待测
张佳佳等: 禾本科植物EST的研究进展 233
样品进行扩增, 通过缺口平移法合成DIG-dUTP标
记杂交探针, 并制备基因芯片, 在对PCR反应和扩
增产物与芯片杂交条件进行优化的同时, 比较了
芯片检测的特异性和重复性, 并对检测的灵敏度
进行测试 , 检测灵敏度可达0.1%。进一步证明
DNA芯片与传统核酸印迹杂交相比, 具有快速、
集成化和高通量等优点, 必将成为转基因植物产
品检测的主流(刘烜等2009)。
3 EST技术的发展前景
随着EST计划在多种植物上展开, 禾本科植物
的研究内容也从结构基因组学扩展到功能基因组
学和比较基因组学。禾本科植物EST研究发展迅
速, 促进了相关植物的深入研究与发展。
尽管EST标记有着多方面的利用价值, 但EST
研究仍然存在一定局限性。(1)目前注册的EST序
列多为一次性测序, 所得的mRNA存在选择性剪
接, 以及在利用软件进行序列拼接时易产生错拼,
这些都使得EST数据库中的一些EST序列只能作
为实验前的参考。(2)用于构建普通cDNA文库进
行测序时, 由于EST测序时的单克隆是随机挑选
的, 高丰度表达基因引起mRNA的表达水平高而被
反复测序; 相反, 一些丰度较低的基因需要测定上
万个克隆才有可能被挑选测序。因此, 对于为寻
找新基因或研究基因差异表达而言 , 用这样的
cDNA文库进行测序, 一方面稀有基因容易遗漏。
另一方面, 由于只是一轮测序结果, 产生EST的
cDNA文库中表达丰度低的基因不易找到, 可能造
成EST数据库中缺乏表达丰度低的基因序列, 而这
些基因很可能具有关键性功能。(3)利用目前EST
开发的分子标记, 不易很快与功能建立联系。有
时有载体序列和核外mRNA来源的cDNA污染或
是基因DNA的污染也会对实验造成一定影响。镶
嵌克隆的出现以及序列的冗余都会导致所需要处
理的数据量很大。另外, EST技术不能获得非编码
区序列信息。因此, EST计划不能取代全长cDNA
和全基因组测序计划。
随着禾本科植物EST计划的开展、深入研究
以及相关研究技术和分析手段的不断改进并走向
成熟, EST数据资源将不断丰富, 而且本身又具备
独特的优势和多方面的利用价值, 开发也较简便,
我们相信此类标记将会大规模开发并推动禾本科
植物的研究进入全新的发展阶段。
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