全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (8): 1293~1298　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0167 1293
收稿 2015-03-25　　修定 2015-07-14
资助 重庆市能力提升项目(cstc2014pt-sy80001)和攻关项目(cst-
c2012ggB80005)。
* 通讯作者(E-mail: tanhua.li@163.com; Tel: 023-68251950)。
水稻护颖外稃化突变体lsl的遗传分析与基因定位
于洋, 杜丹, 张长伟, 杨正林, 凌英华, 何光华, 李云峰*
西南大学水稻研究所, 转基因植物与安全控制重庆市级重点实验室, 重庆400716
摘要: 护颖是水稻等稻族禾本科植物的小穗器官, 关于其进化及发育的分子机制还不十分清楚。本研究报道了一个来源于
保持系水稻‘西农1B’的EMS诱变群体中的护颖异常突变体, 暂被命名为lsl (lemma-like sterile lemma), 主要表现为护颖显著
伸长变宽。花器官发育早期, lsl突变体护颖原基表现出与野生型护颖一致的发育分化模式; 到成熟期, lsl突变体护颖表层
细胞严重硅化, 着生大量毛刺, 与外稃类似, 护颖内部细胞结构解剖也和外稃一致。这些结果表明突变体的护颖发生了向
外稃的同源异型转化。将lsl与‘缙恢10号’杂交构建F1和F2定位群体。遗传分析表明该突变体受隐性单基因控制。利用SSR
分子标记, 通过BSA法, 将LSL基因定位在第7染色体上SSR标记RM1085和RM6663之间, 物理距离为735.5 kb。本研究为进
一步理解LSL基因的功能及分子机理奠定了良好的基础。
关键词: 水稻; 小穗; 不育外稃; 护颖外稃化突变体; 遗传分析
Genetic Analysis and Gene Mapping of a lemma-like sterile lemma (lsl) Mutant
in Rice
YU Yang, DU Dan, ZHANG Chang-Wei, YANG Zheng-Lin, LING Ying-Hua, HE Guang-Hua, LI Yun-Feng*
Chongqing Key Laboratory of Application and Safety Control of Genetically Modified Crops, Rice Research Institute, Southwest
University, Chongqing 400716, China
Abstract: Rice is the model plant of Gramineae, and the sterile lemmas are its unique spikelet organs. The mo-
lecular mechanism of sterile lemma development doesn’t have a definite peroration. In this study, a sterile lem-
ma mutant lsl (lemma-like sterile lemma) with significantly lemma-like, which is derived from ethyl methane
sulfonate (EMS)-treated mutation in maintainer rice ‘Xinong 1B’. The mutant sterile lemma elongation and
widen, serious silicide surface cells, with a large number of burr which like the burr on lemma, and the morpho-
logical structure dissection of sterile lemma is similar to the lemma. The results showed that the linkage relation
of LSL locus was located between markers RM1085 and RM6663 on the short arm of chromosome 7, the physical
distance is 735.5 kb. This result provided a foundation of map-based cloning and function analysis of LSL gene.
Key words: rice; spikelet; sterile lemma; lsl (lemma-like sterile lemma); genetic analysis
水稻是研究植物花发育的理想材料, 与双子
叶模式植物相比, 水稻花序具有一些禾本科植物
独有的结构单元, 而且具有丰富的遗传与基因组
资源。深入研究水稻生殖发育过程, 不仅有助于
深入理解花发育的分子机制, 而且对丰富植物发
育生物学数据和提高水稻产量都具有重要意义。
小穗是一个典型的禾本科特有的花序结构,
由一对苞片和数目不等(1~40)的小花组成。水稻
等稻族的小穗具有与禾本科其他物种不一样的小
穗结构, 由一对副护颖、一对护颖和一个顶生小
花组成, 小花包括1枚雌蕊、6枚雄蕊、2枚浆片和
内外稃。在进化上, 副护颖相当于退化的苞片, 而
关于护颖的起源有两种假说。一种假说认为水稻
祖先小穗包含两个侧边小花和一个顶生小花, 在
进化过程中两个侧边小花退化, 只剩外稃, 外稃进
一步退化成护颖; 另一种假说认为, 水稻小穗只有
一朵小花, 护颖和副护颖都是严重退化了的苞片
结构。目前一些研究支持第一种假说。
G1 (long sterile lemma)编码DUF640, 属于植
物特异的新基因家族, 在g1突变体中, 护颖被转变
为外稃状器官(Yoshida等2009); 水稻SEP-like基因
OsMADS34和脂肪酶基因EG1也调控护颖的特征,
它们的突变导致护颖伸长并获得外稃特征(Ren等
2013; Yoshida等2009; Hong等2010; Gao等2010;
植物生理学报1294
Kobayashi等2010; Wang等2007); 另一个SEP-like
基因LHS1/OsMADS1特化内外特征, 本身并不在护
颖中表达, 但其在护颖中的异位表达会引起护颖
外稃化(Preston等2009)。然而, 最近的一项研究表
明, 一个AP2-like基因multifloret spikelet 1 (MFS1)
突变后导致护颖进一步退化成副护颖状, 支持护
颖和副护颖同源的假说(Ren等2013)。
本研究中, 我们鉴定了一个护颖异常突变体,
命名为lemma-like sterile lemma (lsl)。该突变体护
颖伸长且变宽, 表层细胞严重硅化, 着生大量毛刺,
与外稃十分类似。LSL基因被定位在第7染色体上
SSR标记RM1085和SSR标记RM6663之间, 物理距
离为735.5 kb。本研究为进一步理解LSL基因的功
能及分子机理奠定了良好的基础。
材料与方法
1 供试材料
水稻(Oryza sativa L.) lsl突变体来源于EMS诱
变保持系‘西农1B’后代, 经连续多代自交种植, 突
变性状稳定遗传。用表型正常的材料‘缙恢10号’
与突变体lsl杂交, 同年种植F1并收获F2种子, 次年
种植亲本和F2代群体。抽穗期对每个单株籽粒进
行调查, 利用隐性突变单株作为遗传分析和基因
定位群体。
2 形态学和组织学分析及统计
在开花期, 随机选取100朵lsl小花和野生型小
花观察其形态并用NIKON SMZ1500体视镜和日
立SU-3500型扫描电子显微镜分析其表型特征。
切片分析参照Xiao等(2009)的方法, 并加以改进:
选取抽穗期的野生型和突变体小穗于4 ℃的FAA
固定液(50%无水乙醇、0.9 mol·L-1的冰乙酸和
3.7%甲醛)中固定, 固定后迅速抽气, 在4 ℃条件下
过夜, 然后用10%的氢氟酸在黑暗条件下, 软化处
理1周, 经乙醇梯度脱水和二甲苯透明后用石蜡包
埋, 切片厚度为10 µm, 经1%番红和1%固绿对染后
于尼康E600光学显微镜下观察照相分析。
在抽穗期, 随机选取长势相对一致的‘西农
1B’和lsl突变体完整单株各5株, 使用尖头镊子将茎
杆中的花器官幼嫩组织与包被组织剥离, 置于扫
描电镜冷冻观察载物台, 使用日立SU-3500型扫描
电子显微镜镜下观察并照相。
3 农艺性状调查
在同一块实验田的相邻位置种植40株lsl突变
体和40株野生型, 成熟期在非边缘位置随机各选
10株, 对其一次枝梗数、千粒重、千粒护颖重、
护颖长度、籽粒长等性状进行调查。
4 基因定位
采用BSA (Bulked Segregant Analysis)定位目
标基因。根据F2代植株表型, 分别选取10株正常单
株和10株突变单株, 剪取等量叶片, 组成正常基因
池和突变基因池。
使用CTAB法提取亲本和基因池DNA, 按碱煮
法提取F2代群体DNA。参照http://www.gramene.
org公布的SSR引物和IN/DEL引物序列, 并由上海
英骏技术公司合成。PCR总体系为12.6 μL, 含1.25
μL 10×PCR buffer、1 μL 50 ng·μL-1 DNA模板、
0.75 μL 25 mmol·L-1 MgCl2、0.5 μL 2.5 mmol·L
-1
dNTPs、8.0 μL ddH2O、1.0 μL 10 μmol·L
-1引物、
0.1 μL 5 U·μL-1 Taq酶。PCR程序为: 94 ℃预变性5
min; 94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃复性1
min, 35个循环; 72 ℃延伸10 min。PCR产物经10%
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳, 快速银染后观察。
5 图谱构建
F2代定位群体中, 将具有‘缙恢10号’带型的单
株记为A, 具有lsl突变亲本带型的单株记为B, 具有
杂合带型的单株记为H。根据公式 [ ( H + 2 A ) /
2n]×100计算遗传距离并构建连锁图谱, 其中H表
示定位群体中出现杂合体带型单株的数量, A表示
出现‘缙恢10号’正常带型的单株数, n表示用于定
位的隐性群体总株数。
实验结果
1 lsl突变体的形态学和组织学分析
与野生型水稻相比, 突变体lsl与野生型株型
无明显差异(图1-A、B), lsl突变体护颖发育异常,
统计分析表明突变体护颖的长度极显著大于野生
型(表1), 护颖宽度也明显超过野生型, 形态特征与
外稃相似(图2-A、H)。除以上突变形状外, 根据统
计数据显示(表1), lsl突变体在枝梗数和籽粒长度等
谷物指标上与野生型之间没有表现出显著差异。
与野生型相比, lsl突变体的千粒重显著降低,
其中护颖重量占千粒重的24.7%, 达到野生型千粒
于洋等: 水稻护颖外稃化突变体lsl的遗传分析与基因定位 1295
表1 突变体lsl与野生型(WT)的主要农艺性状分析
Table 1 Main agronomic traits of the lsl mutant and the wild type (WT)
材料 一次枝梗数 籽粒长度/cm 护颖长度/cm 千粒重/g 千粒护颖重/g
WT 9.6±1.30 0.99±0.013 0.27±0.009 24.0±0.27 0.89±0.04
lsl 9.4±0.96 0.95±0.016 0.90±0.015** 21.9±0.12* 5.40±0.04**
　　*: 突变体与野生型在0.05水平上差异显著; **: 突变体与野生型在0.01水平上差异显著。
图1 lsl突变体及其野生型株型对比
Fig.1 Histological analysis of the lsl mutant and wild type
A: 分蘖期, B: 成熟期。
护颖重的6倍以上(表1), 说明突变体千粒重异常的
主要原因是由于护颖外稃化。
经扫描电镜进一步分析发现, 野生型护颖表
层细胞光滑、平整(图2-D), 毛刺较少且呈随机分
布; 而突变体护颖表面细胞严重硅化, 呈紧密排列
的沟壑状结构(图2-K), 毛刺的大小和数目显著超
过野生型, 这种结构特征与同时期内外稃的表层结
构表现一致(图2-C、J)。通过石蜡切片观察发现,
野生型小穗的护颖主要由上下表层细胞和中间的
薄壁细胞3层组成, 且上表皮未硅化(图2-G); 而突变
体小穗的护颖由4层细胞层组成: 包括硅化的上表
皮表、厚壁细胞层、薄壁细胞层和膨大的下表皮
细胞层(图2-N)。这种细胞组织结构与野生型和突
变体的内外稃一致(图2-F、M)。综合这些结果表明
lsl突变体的护颖发生了向外稃的同源异型转变。
2 lsl突变体及其野生型小穗发育过程分析
为了确定突变体护颖原基的发育情况, 参照
前人(Itoh等2005; Ikeda等2004)对小穗发育时期的
分类, 我们用扫描电镜观察了SP4~SP8期小穗的发
育。lsl突变体的小穗在SP4至SP6阶段分化发育表
现正常, 护颖原基与野生型在大小和细胞特征上
无明显差异(图3-A~C、F~H), 而且, 无论是突变体
还是野生型, 这段时期护颖原基和内外稃原基的
细胞特征都比较类似。当小穗的发育进入SP7时,
野生型内外稃原基的发育分化速度明显加快, 内
外稃原基的特征和护颖相比已经表现明显的不同,
整体表现厚实, 外稃顶端有明显隆起结构, 细胞排
列规则且无明显伸长, 而护颖整体较薄, 远轴端细
胞伸长明显、表面平滑, 且出现明显的边缘结构,
两侧的护颖顶端都无隆起结构(图3-D、E)。相较
于野生型, 在lsl突变体中, 护颖原基的细胞分化和
增殖速度都明显加快, 护颖体积硕大, 两侧护颖的
远轴端都逐渐形成了类似外稃原基顶端隆起, 细
胞特征也与内外稃高度一致(图3-I、J)。这些结果
表明突变体的护颖在原基发育阶段就发生了向外
稃的转化。
植物生理学报1296
3 lsl突变体的遗传分析与基因定位
在抽穗期, 调查lsl和‘缙恢10号’杂交组合的F1
和F2群体的表型, 发现F1植株都表现正常, F2群体
出现性状分离, 其中正常单株1 505株、lsl突变单
株481株。经卡方测验, 野生型和突变型表现出3:1
分离(χ2=0.8868<χ20.05=3.84), 表明lsl突变性状受控
于隐性单基因。
选用‘缙恢10号’×lsl杂交的F2代481个突变单
株作为定位群体。利用400个均匀分布于12条染
色体上的SSR标记对亲本‘缙恢10号’和lsl进行多态
性分析, 共获得62个多态性引物; 进一步利用这些
引物扩增正常基因池和突变基因池 , 发现引物
RM5211、RM6047、RM2381和RM7012在基因池
间表现多态性。进一步利用这些引物分析F2代481
个突变单株, 发现SSR标记RM5211、RM6047、
RM2381和RM7012分别有20、11、17和33个交换
株 , 其中RM5211交换株包含RM6047交换株 ,
RM7012交换株包含RM2381交换株, 且RM5211、
RM6047交换株与RM2381、RM7012交换株互不
重叠。因此将LSL基因定位在标记RM6047与
RM2381之间。在两标记间进一步设计了20对SSR
引物, RM3831、RM1085、RM5344、RM6663、
RM3325在亲本间表现多态性, 分析群体后表明,
RM1085和RM6663分别只有1个交换株, 且互不重
叠, RM5344没有交换株, 表现共分离, 最终将LSL
定位在RM1085和RM6663之间(图4), 遗传距离约
为0.78 cM和0.12 cM, 物理距离为735.5 kb。
讨　　论
水稻等稻族成员的小穗是由两对颖片及一朵
顶部小花组成, 分别为一对护颖和一对副护颖, 其
他禾本科物种没有类似护颖的器官(Schmidt和
图2 lsl突变体及其野生型态和组织学分析
Fig.2 Morphological amd histological analysis of the lsl mutant and wild type
A: 野生型水稻的小穗; B: 野生型小穗表面结构; C: 野生型小穗外稃表面结构, 对应B图中红色虚线框I; D: 野生型小穗护颖表面结构,
对应B图中红色虚线框II; E: 野生型小穗的横切面; F: 野生型小穗外稃细胞结构, 对应E图中红色虚线框V; G: 野生型小穗护颖细胞结构, 对
应E图中红色虚线框VI; H: 典型的lsl小穗; I: 典型的lsl小穗表面结构; J: 典型的lsl小穗内稃表面结构, 对应I图中红色虚线框III; K: 典型的lsl
小穗护颖表面结构, 对应I图中红色虚线框IV; L: 典型的lsl小穗的横切面; M: 典型的lsl小穗外稃细胞结构, 对应L图中红色虚线框VII; N: 典
型的lsl小穗护颖细胞结构, 对应L图中红色虚线框VIII; 图E、L中的星号表示雄蕊。缩写: le, 外稃; sl, 护颖; pa, 内稃。
于洋等: 水稻护颖外稃化突变体lsl的遗传分析与基因定位 1297
Ambrose 1998; Sajo等2008; Hong等2010)。在水稻
中, 副护颖通常被认为是极度退化的苞片, 而关于
护颖的来源备受争议。G1、OsMADS34等基因可
以调控护颖的特征, 这些基因的突变都导致护颖
伸长并获得外稃特征, 暗示护颖可能是由小穗的
外稃退化而来。然而, 这些研究都没有关注突变
体护颖外稃化的发生过程。本研究中, 我们通过
扫描电镜观察到lsl突变体与野生型小穗的护颖原
基的起始及分化过程, 发现在SP7期以前, 无论是
突变体还是野生型, 护颖原基和外稃原基的发育
速度和细胞特征都十分相似。自SP7阶段后, 野生
型护颖的发育速度明显放缓, 而外稃的发育速度
明显加快; 而在突变体中, SP7阶段后护颖的发育
并没有放慢, 而是与外稃的发育保持时空上的高
度一致。这些结果暗示水稻的护颖在发育的早期
可能和外稃共享一个相似的基础 , 而G1、Os-
图3 lsl突变体及其野生型小花发育过程分析
Fig.3 Developmental course analysis of the lsl spikelet and wild type spikelet
A、F: 外稃分化初期(SP4); B、G: 雄蕊分化初期I (SP6I); C、H: 雄蕊分化初期II (SP6II); D、I: 心皮分化初期I (SP7I); E、J: 心皮分化
初期II (SP7II); A~E是野生型小花; F~J是典型的lsl的小花。A~J中红色箭头标识护颖。标尺: A、F、G为100 µm, B、C、D、H为200 µm,
E、I为300 µm, J为500 µm。
图4 LSL基因在第7染色体上分子定位
Fig.4 Linkage map of LSL on chromosome 7 of rice
植物生理学报1298
MADS34、EG1及LSL等基因负责在后期抑制了护
颖原基的进一步分化 , 从而导致一个退化的外
稃——护颖, 这也进一步支持了Arber (1935)关于
护颖与外稃同源的假说。
内稃、外稃和护颖是禾本科特有的花器官,
虽然它们通常都被看作花萼类的器官, 但是内稃
和外稃的形态特征有着明显的差别(图2)。有观点
认为其发育可能受控于不一样的基因(Kellogg
2009): 一些突变体的表型已经暗示了这一点, 例如
水稻无内稃突变体palealess中, 内稃被2个叶状的
器官代替, 而外稃正常(Kellogg 2009); 而在大麦中,
calcaroides突变体的外稃过度生长或发育成囊状
结构, leafy lemma突变体的外稃叶化, 但它们的内
稃都是正常的(Pozzi等2000)。这都表明内稃与外
稃可能不属于同一器官。在本研究也发现受LSL
基因突变的影响, 护颖外稃化而不是內稃化, 也从
侧面证明了內稃与外稃(护颖)并非同源器官。
穗粒数是水稻等禾本科粮食作物十分重要的
产量性状。构成因素包括花序上枝梗的数目、长
度以及其上小穗的着生密度等, 而小穗内小花的
数目通常不在考察的范围内, 因为正常的物种一
个小穗内小花数目是稳定的。根据前人的结果,
至少在小穗确定性物种中, 维持确定性发育基因
的功能缺失将导致小穗内小花数目的增加(Chuck
等1998, 2002; 李云峰等2011), 结合本研究发现的
lsl突变体出现外稃化护颖, 在此基础上如能获得更
多表型的护颖突变体, 深入研究这些基因的作用
机制, 有可能在分子水平对其改造后实现增加小
花数目这一设想。
lsl突变体护颖显著变宽伸长, 似外稃状, 扫描
电镜分析发现突变体护颖表层细胞严重硅化, 着
生大量毛刺, SP7时期以前突变体、野生型护颖与
外稃生长速度一致, SP7时期以后野生型护颖发育
速度比外稃明显放缓, 而突变体护颖则与外稃的
发育速度一致; 切片发现突变体护颖细胞结构和
外稃一致, 表明突变体中护颖发生了向外稃的同
源异型转化。该性状受隐性单基因LSL控制, LSL
基因被定位在第7染色体上SSR标记RM1085和
RM6663之间, 物理距离为735.5 kb。护颖外稃化
突变体可作为一种特殊种质资源, 用于研究水稻
花器官的进化机制。本研究为进一步理解LSL基
因的功能及分子机理奠定了良好的基础。
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